Summary
Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.
Abstract
Gli astrociti sono un tipo di cellula abbondante nel cervello dei mammiferi, ma resta ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche molecolari e funzionali. Nei sistemi di coltura in vitro di cellule astrociti possono essere utilizzati per studiare le funzioni biologiche di queste cellule gliali in dettaglio. Questo protocollo video mostra come ottenere astrociti puri di isolamento e la coltura di cellule corticali miste di cuccioli di topo. Il metodo si basa sulla mancanza di neuroni vitali e la separazione di astrociti, oligodendrociti e microglia, le tre popolazioni principali cellule gliali del sistema nervoso centrale, in coltura. Immagini rappresentative durante i primi giorni di cultura dimostrare la presenza di una popolazione cellulare mista e indicare il timepoint, quando astrociti diventano confluenti e devono essere separati da microglia e gli oligodendrociti. Inoltre, abbiamo dimostrato la purezza e la morfologia degli astrociti di astrociti in coltura utilizzando colorazioni immunocitochimiche per la consolidata eappena descritto marcatori astrociti. Questo sistema di coltura può essere facilmente utilizzato per ottenere astrociti topo puri e astrociti terreno condizionato per studiare vari aspetti della biologia astrociti.
Introduction
Astrociti sono un tipo cellulare molto abbondante nel sistema nervoso centrale (CNS). Il rapporto tra astrociti ai neuroni è di 1:3 nella corteccia di topi e ratti, mentre ci sono 1,4 astrociti per neurone nella corteccia umana 1. L'interesse per la funzione degli astrociti è aumentato drammaticamente negli ultimi anni. Una funzione chiave degli astrociti è il loro ruolo di supporto strutturale e metabolico ai neuroni 2,3. Ruoli di recente scoperta per gli astrociti coprono un ampio spettro di funzioni. Questi includono guidare la migrazione degli assoni di sviluppo e alcuni neuroblasti durante lo sviluppo 4-6, funzioni nella trasmissione sinaptica, forza sinapsi e di elaborazione delle informazioni da circuiti neurali 7-9, ruoli nella barriera ematoencefalica (BBB) formazione 10 e 11-13 integrità e la regolamentazione del 14 tono cerebrovascolare. Un'altra caratteristica importante di astrociti è la loro risposta al danno. In condizioni patologiche astrocytes diventano reattive e upregulate ulteriormente l'espressione della proteina di filamento intermedio acida fibrillare gliale (GFAP) e inibitori della matrice extracellulare (ECM) proteine 15,16. Astrociti reattivi delimitare il luogo di ferita da tessuto sano formando una cicatrice gliale, che consiste principalmente di proteine secrete astrociti ECM del condroitin solfato proteoglicani (CSPG) famiglia, i principali fattori che inibiscono la rigenerazione assonale dopo lesione del SNC 15-17.
Gli astrociti sono originari di radiali gliali (RG), le cellule durante l'embriogenesi e all'inizio della vita post-natale. Secondo le specifiche astrociti si è verificato, precursori degli astrociti migrare verso le loro posizioni finali, dove iniziare il processo di differenziazione terminale. In vivo, astrociti sembrano essere maturi tre o quattro settimane dopo la nascita come indicato dalla loro morfologia tipica 18,19. Una sottopopolazione di cellule RG convertire in zona subventricolare astrociti (cellule di tipo B). Both, RG e le cellule di tipo B funzionano come astrociti-come le cellule staminali neurali (NSC) durante lo sviluppo e nell'adulto, rispettivamente. Come astrociti, RG e le cellule di tipo B anche esprimere la astrociti specifico trasportatore del glutammato (GLAST), lipidi del cervello-binding protein (BLBP), e GFAP, indicando che questi indicatori non possono essere utilizzati esclusivamente per etichettare specificamente astrociti adulti. In contrasto adulti astrociti parenchimali, che non si dividono nel cervello sano, RG e B tipo cellule mostra potenziale di cellule staminali, come la capacità di auto-rinnovarsi. Disregolazione di astrociti è stato implicato in numerose patologie, compreso il morbo di Alzheimer 20,21, malattia di Huntington 22, morbo di Parkinson 23, 24 Rett sindrome e malattia di Alexander 25. Inoltre, astrociti reagire a tutte insulti del SNC, portando all'attivazione astrociti e astrocitica formazione della cicatrice gliale 16,26. La cicatrice che si forma astrocitari gliale tr seguente cervelloAUMA midollo spinale o lesioni è pensato per essere la barriera principale impedire la rigenerazione neuronale 15.
Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere popolazioni purificate di cellule è stato fondamentale per la nostra comprensione del sistema nervoso. Lavoro pionieristico da McCarthy e de Vellis consente agli investigatori di data per preparare colture quasi pure di astrociti da tessuti di ratto neonato 27. Molto è stato appreso sulla biologia astrociti utilizzando questo metodo, che viene qui presentata in una forma leggermente modificata per isolare gli astrociti corticali di topo. Integrando studi in vivo, astrociti nonché mezzo condizionato ottenuto utilizzando la coltura in vitro descritto, sono strumenti utili per ottenere ulteriori approfondimenti funzioni astrociti.
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Protocol
1. L'isolamento e la placcatura di misti cellule corticali
Mixed isolamento cellulare corticale per colture astrociti può essere eseguita utilizzando P1 a P4 cuccioli di topo. Al fine di ottenere la giusta densità astrociti è necessario utilizzare 4 cortecce topo pup per T75 pallone di coltura tissutale. Pertanto, volumi nel seguente protocollo sono calcolati per un preparato cellulare utilizzando 4 cuccioli di topo.
- Prima di avviare la procedura di dissezione, preriscaldata 30 ml di mezzo di coltura di astrociti (DMEM, glucosio + 10% di siero fetale di siero bovino + 1% di penicillina / streptomicina, vedi tabella) a 37 ° C. Coat uno T75 pallone con 20 ml di poli-D-lisina (PDL) ad una concentrazione di 50 ug / ml in acqua di grado coltura cellulare per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2.
- Per la procedura di dissezione, preparare tutti i reagenti necessari e materiali. Avrete bisogno di: forbici chirurgiche, lisce una pinza sottile, pinze punta piatta, asciugamani di carta, sacchetto di rifiuti, il 70% di etanolo und 2 piatti dissezione (3.5 cm di diametro) sul ghiaccio riempito con 2 HBSS ml ciascuno.
- Premere delicatamente e spruzzare la testa e il collo del mouse cucciolo con il 70% di etanolo. L'animale viene sacrificato per decapitazione usando le forbici.
- Eseguire una incisione mediana, posteriore a anteriore, lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio.
- Tagliare il cranio con cura dal collo al naso. Due ulteriori tagli vengono eseguiti per permettere ulteriore accesso al cervello: Il primo taglio è fatto anteriore dei bulbi olfattivi, l'altra inferiore del cervelletto di scollegare il cranio dalla base del cranio.
- Utilizzando le pinze punta piatta, i lembi cranici sono gentilmente girato di lato e il cervello viene estratto e inserito nel primo piatto dissezione pieno di HBSS. Porre la capsula posteriore su ghiaccio e continuare a raccogliere tutti e 4 i cervelli.
- Il resto della procedura di dissezione è eseguita sotto uno stereomicroscopio. In primo luogo, i bulbi olfattivi e il cervelletto vengono rimossi con l'ammendadissettore (Figura 1B).
- Al fine di recuperare le cortecce, afferrare l'estremità posteriore del cervello con le pinza sottile, eseguire una incisione mediana tra i due emisferi, inserire una seconda serie di pinze al boschetto creato e rimuovere la piastra-come la struttura della corteccia dal cervello.
- Attenzione sezionare le meningi dagli emisferi della corteccia tirando con la pinza fini (Figura 1D '). Questo passaggio consente di evitare la contaminazione della cultura finale astrociti da cellule meningee e fibroblasti. Trasferire gli emisferi della corteccia preparati nel secondo piatto pieno di HBSS e restituirlo su ghiaccio. Continuare quindi con tutti e 4 cortecce.
- Infine, tagliare ogni emisfero corteccia in piccoli pezzi con lame affilate (circa 4 a 8 volte).
- In condizioni sterili, pezzi di corteccia di trasferimento in un unico tubo da 50 ml Falcon e aggiungere HBSS ad un volume totale di 22,5 ml.
- Aggiungere 2,5 ml di 2,5% tripsina, mescolare e incubareil tessuto nel bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min. Mescolare occasionale agitando ogni 10 min.
- Centrifugare per 5 minuti a 300 xg per pellet pezzi di tessuto della corteccia.
- Rimuovere con attenzione il surnatante per decantazione. Al fine di evitare di perdere il tessuto pellet si può trattenere meccanicamente utilizzando una pipetta. Dissociare il tessuto in una sospensione cellulare singola aggiungendo 10 ml di mezzo di placcatura astrociti e vigorosa pipettaggio utilizzando una pipetta di plastica da 10 ml fino pezzi di tessuto sono dissociate in singole cellule (20 a 30 volte). Regolare il volume a 20 ml con media placcatura astrociti. La possibilità di controllare la dissociazione del tessuto corticale in cellule singole contando utilizzando un hematocytometer. Una preparazione di 4 cortecce topo cucciolo dovrebbe produrre 10-15 x10 6 cellule dissociate singole.
- Aspirare PDL dalla fiasca T75 cultura, piastra sospensione dissociato singola cella e incubare a 37 ° C in incubatore CO 2.
2. Come ottenere un Enriched Cultura astrociti
- Modificare le medie 2 giorni dopo la placcatura delle cellule miste corticali e tutti i 3 giorni successivi.
- Dopo 7-8 giorni, quando microglia astrociti sono confluenti e sovrapposizione sedersi esposta sullo strato astrociti o sono già staccati dallo strato astrociti (Figura 2), agitare il matraccio T75 a 180 rpm per 30 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere microglia. Eliminare il supernatante contenente microglia o se si desidera esaminare la cultura e la microglia, che spin down e piastra per la cultura 28,29.
- Aggiungere 20 ml di mezzo fresco cultura astrociti e proseguire con agitando a 240 rpm per 6 ore per rimuovere le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Poiché alcuni OPC non si stacchi dallo strato di astrociti, continuano ad agitare vigorosamente per 1 minuto, al fine di prevenire la contaminazione OPC. Eliminare il surnatante o girare verso il basso e piatto, se si desidera la cultura OPC 29.
- Sciacquare il restante confluestrato nt astrociti due volte con PBS, aspirare il PBS, aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA e incubare in 2 CO incubatore a 37 ° C. Controllare distacco di astrociti ogni 5 min e far rispettare il distacco di astrociti colpendo il pallone contro il palmo della mano (2-3 volte).
- Dopo astrociti sono staccati dal pallone cultura, aggiungere 5 ml di terreno di coltura astrociti, cellule di spin a 180 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 40 ml di terreno fresco placcatura astrociti. Un pallone di coltura di tessuti T75 dovrebbe produrre circa 1x10 6 cellule dopo la scissione prima cella. Celle a piastre in due fiasche T75 e incubare a 37 ° C in 2 CO incubatore. Cambiare il mezzo ogni 2 o 3 giorni.
- 12-14 giorni dopo il primo split astrociti sono placcati in un apposito concentrazione cellulare 24-48 ore prima di eseguire l'esperimento. Un pallone di coltura di tessuti T75 dovrebbe produrre circa 1,5-2 x10 6 cellule dopo la divisione seconda cella.
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Representative Results
Sull'isolamento del cervello di topo completa (Figura 1A), il cervelletto e bulbi olfattivi devono essere rimossi (Figura 1B). Le cortecce sono sbucciati del tronco cerebrale mouse (Figura 1C) e meningi della corteccia individuale (Figura 1D ') sono attentamente rimossi (Figura 1E). Meningi sono evidenti dal sistema arteria meningea e risultati incompleti rimozione della contaminazione della cultura finale astrociti da cellule meningee e fibroblasti.
Dopo fasciame della sospensione mista cellula corticale, alcuni astrociti già allegare al pallone di coltura entro 24 ore (Figura 2A). Tuttavia, il supernatante di coltura cellulare conterrà detriti cellulari e neuroni muoiono per i primi 3 a 5 giorni (Figura 2A-C), il mezzo di coltura favorisce la sopravvivenza e la crescita di cellule gliali. Una volta che gli astrociti e microglia sono confluenti siedono esposto sulla astrocytstrato e, di solito al giorno 7 dopo l'isolamento di cellule miste corticali, astrociti dovrebbero essere separati da microglia e OPC agitando (Figura 2D). 2 giorni dopo le celle divise prima mostra morfologia degli astrociti. A questo punto la densità astrociti è bassa e gli astrociti sono voluminosi (Figura 2E, frecce nere marcare una cella). La resa prevista in quel momento è basso, con circa 4-6 x 10 5 cellule per T75 pallone di coltura di tessuti. Tuttavia, le cellule proliferano e ancora maturare in coltura a questo timepoint. Gli astrociti sono di solito utilizzati per gli esperimenti al giorno 21 a 28 (Figura 2F) per garantire un fenotipo maturo di astrociti isolati. A questo punto il rendimento atteso è di circa 1,5-2 x10 6 cellule per T75 pallone di coltura tissutale.
La purezza cultura astrociti è stata caratterizzata da studi di microscopia elettronica morfologici, marcatori di espressione delle cellule e la reattività farmacologica 27. Una contaminazione delcultura strocyte può essere esaminato utilizzando marker per microglia (IBA-1) e OPC (O4). La purezza ottenuta cultura astrociti e maturità devono essere esaminati mediante esame immunocitochimica utilizzando un anticorpo contro la proteina GFAP. Si prevede che la maggior parte delle celle mostrano un intenso segnale filamentosa (Figura 3). Il nostro metodo di isolamento e la coltura di astrociti corticali determinato un astrocita purezza superiore al 98%, ha rivelato utilizzando un anticorpo contro la proteina GFAP (Figura 3). Se la procedura è stata eseguita correttamente, cellule contaminanti sono rare (<2%) e contengono microglia e OPC, che può essere trattata utilizzando IBA-1 e O4, rispettivamente. Se desiderato, ulteriori analisi di altri marcatori astrociti, come Aquaporin-4, BLBP, S100B e GLAST possono essere utilizzati. Oltre a GFAP, questi marcatori sono stati tutti espressi dai giorni 28 vecchie culture astrociti. Recenti profilo di espressione genica di popolazioni purificate astrociti rivelato nuovo ast potenzialemarcatori rocyte, come l'enzima metabolico folato ALDH1L1 30,31, che è anche espresso dalla maggioranza dei astrociti corticali isolati (Figura 3).
Figura 1. Dissezione di post-natale (P3) corteccia del mouse. A) intero cervello. B) del cervello dopo la rimozione dei bulbi olfattivi e del cervelletto. C) Isolamento delle cortecce dal staccando lastriforme struttura della corteccia del cervello. D, D ') Cortex dal sito ventrale e dorsale con meningi (frecce nere indicano arterie meningee). E) Cortex senza meningi. Scala bar, 1,5 mm.
Figura 2. Rassegna morfologica di isolate cellule miste corticali e pura cultura astrociti in tempi di valutazione differenti dopo isolamento.A) 1 giorno dopo la placcatura di cellule corticali miste. Astrociti primi sono attaccati al fondo del pallone (frecce nere) e neuroni muoiono sono nel supernatante. B) 3 giorni dopo la placcatura di cellule corticali miste. Strato di astrociti è di formatura (frecce nere). I neuroni sono quasi assenti. C) 5 giorni dopo la placcatura di cellule corticali miste. Prima microglia e OPC sopra uno strato di astrociti (frecce nere). D) 7 giorni dopo la placcatura di cellule corticali miste. Strato di astrociti è completamente confluente. E) Dopo aver rimosso microglia e OPC da agitare vigorosamente e 2 giorni dopo la divisione, le cellule allegate mostrano morfologia degli astrociti a bassa densità (le frecce indicano una cella). F) strato di astrociti mostra ad alta densità 2 settimane dopo la prima divisione. Scala bar, 10 micron.
Figura 3. La purezza del primario cultura astrociti. Immunomarcatura del cul primaria astrociti del mouseture con i marcatori GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 e BLBP (tutto verde) ha rivelato pura coltura primaria astrociti. I nuclei sono colorati con 4 ', 6'-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (blu). Scala bar: 10 pm.
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Discussion
Il metodo qui descritto si basa sulla preparazione cultura astrociti dal cervello di roditori neonatali, originariamente descritti da McCarthy e de Vellis nel 1980 27. Il metodo modificato di isolamento e la coltura di astrociti corticali da P1 postnatale al cervello P4 del mouse qui presentato è veloce, rese astrociti primari puri ed è altamente riproducibile. Questa tecnica può essere facilmente trasferiti per isolare astrociti da altre specie, come di ratto o di maiale e da altre regioni del cervello, come il midollo spinale. Considerando che astrociti isolamento delle cellule progenitrici dal cervello neonatale dal McCarthy e il metodo deVellis genera cellule altamente proliferative, la proliferazione cellulare e la propagazione di astrociti isolati di postnatali P1-P4 cuccioli di topo è limitato. Dopo astrociti spaccare una volta a 7 giorni in vitro (DIV), che crescerà fino a confluenza e maturo. In vivo, la proliferazione degli astrociti la maggior parte è in gran parte completa da P14 32. Egliri, si consiglia di utilizzare gli astrociti per esperimenti al giorno 21-28 DIV (Figura 2F) per garantire il fenotipo maturo di astrociti isolati. A causa della ritenuta intrinseca di proliferare culture astrociti non dovrebbero essere diviso più di 3 volte.
Fasi critiche nel metodo descritto isolamento sono la digestione delle cortecce e la triturazione seguente del tessuto digerito per ottenere la sospensione singola cella. Pertanto, è necessario ottimizzare la concentrazione tripsina e tempo di digestione in modo da ottenere una sospensione singola cellula dopo triturazione del tessuto cerebrale corteccia per 20-30 volte. Per minimizzare tripsina variazione deve essere aliquotati e congelamento-scongelamento deve essere evitato. La procedura descritta si basa su placcatura le cellule corticali miste su PDL rivestite fiasche di coltura, che assicura il legame di astrociti e promuove uno strato confluente astrociti diversi giorni dopo la placcatura. Mentre PDL-rivestimento non è necessario per astrociti manutenzione dopo la loro separazione dalla microglia e oligodendrociti, può essere eseguita per determinate applicazioni a valle come colorazione immunofluorescene. Buona scelta di tempo della scissione prima cella è importante per l'integrità delle cellule e la resa. Se astrociti sono coltivate al di là raggiunsero confluenza, si rischia di perdere la maggior parte delle cellule a causa di distacco insufficiente durante la divisione prima cella. Questo non può essere superato aumentando il tempo di distacco, poiché il tempo di incubazione con tripsina vasta influenza negativamente l'integrità delle cellule. In contrasto, la sospensione placcatura corticale cella troppo poco provocherà insufficiente formazione di uno strato di cellule confluenti astrociti. Il momento migliore per la divisione prima cella è a 7 a 8 giorni dopo la placcatura di cellule corticali miste, quando astrociti sono confluenti e le cellule microglia sedersi sulla posizione più alta del livello astrociti.
Nella cultura descritta cellula corticale, astrociti mostrano eterogeneità cellulare (<strong> Figura 3), come è stato descritto per astrociti in vivo 33,34. Tuttavia, la definizione di diversa morfologia degli astrociti e la funzionalità è stata ostacolata dal numero limitato di indicatori per identificare e distinguere sottotipi astrociti potenzialmente eterogenei. Un indicatore ben caratterizzato di fibroso maturo e astrociti reattivi è GFAP. Tuttavia, GFAP è appena espressa da adulte astrociti protoplasmatici, limitando il suo uso come marcatore per tutti astrociti ed è anche espresso dalle cellule RG durante lo sviluppo e dalle cellule B nell'adulto, limitando il suo uso come stadio-specifico marcatore. Altri marcatori di astrociti, tra cui GLAST, ALDH1L1 o BLBP, sono anche espressi dagli astrociti immaturi e quindi non esclusivamente segnare astrociti maturi. Infine, astrociti maturi marcatori quali GFAP, Aquaporin-4, e S100B (Figura 3) sono sempre up-regolato durante la maturazione post-natale.
Nelle nostre mani, astculture rocyte in età di 4 settimane hanno caratteristiche di astrociti maturi in vivo. Utilizzando colture primarie di astrociti abbiamo potuto identificare il meccanismo molecolare come la nascita del fibrinogeno proteina del sangue induce l'attivazione degli astrociti 17. I nostri studi hanno rivelato che il fibrinogeno è un vettore di TGF-β latente. Trattamento di astrociti primari con fibrinogeno portato attivo TGF-β formazione e l'attivazione della via di segnalazione TGF-β/Smad in astrociti 17,26. Questi risultati sono stati confermati mediante iniezioni fibrinogeno in vivo. Inoltre, astrociti controllare altri tipi cellulari dalla secrezione di sostanze che possono essere analizzati mediante raccolta astrociti terreno condizionato ed applicando questo mezzo condizionato ad altri tipi di cellule. Abbiamo precedentemente utilizzato astrociti terreno condizionato per analizzare in un saggio funzionale come terreno condizionato di fibrinogeno trattati astrociti colpisce crescita dei neuriti. Reattiva astrociti esprimono e secernonoproteine della famiglia CSPG, che inibiscono la crescita dei neuriti 16. Infatti, mezzo condizionato da fibrinogeno trattati astrociti considerevolmente diminuito tanto lunghezza dei neuriti e la percentuale di cellule che presentano neuriti 17.
L'isolamento e la coltura di astrociti corticali descritte in questo protocollo fornisce un potente strumento per studiare la biologia astrociti, in quanto la loro gestione in diverse applicazioni possono notevolmente completare le loro indagini in vivo. Tuttavia, va tenuto presente che gli astrociti ottenuti sono stati coltivati in vitro e mentre riflette molte caratteristiche astrociti, essi differiscono anche da astrociti in vivo. Pertanto, altri metodi di selezione diretta e l'isolamento di astrociti da immunopanning 35 o a base di anticorpi isolamento FACS 36 rappresentano nuove vie per indagare ulteriormente le proprietà fondamentali di astrociti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Supportato dalla Fondazione Fazit Graduate borsa di studio per SS, il Ministero federale dell'Istruzione e della ricerca (BMBF 01 EO 0803) a KB e della Commissione europea sovvenzione 7 ° PQ PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, e il tedesco Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 per CS Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
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