Summary
Os astrócitos têm sido reconhecidos como células versáteis que participam em processos biológicos fundamentais, que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais, e reparação do sistema nervoso central. Aqui apresenta-se um processo rápido de obtenção de culturas de astrócitos de rato puros para estudar a biologia desta classe importante de centrais células do sistema nervoso.
Abstract
Os astrócitos são um tipo de célula abundante no cérebro dos mamíferos, mas há ainda muito que aprender sobre as suas características moleculares e funcionais. Nos sistemas de cultura in vitro de células de astrócitos podem ser utilizados para estudar as funções biológicas destas células gliais em detalhe. Este protocolo de vídeo mostra como obter astrócitos puras através do isolamento e da cultura de células corticais mistas de filhotes de rato. O método baseia-se na ausência de neurónios viáveis e a separação dos astrócitos, oligodendrócitos e microglia, os três principais populações de células da glia do sistema nervoso central, em cultura. Imagens representativas durante os primeiros dias de cultura demonstram a presença de uma população mista de células e indicam o ponto no tempo, quando os astrócitos tornam-se confluentes e deve ser separada da microglia e oligodendrócitos. Além disso, demonstramos a pureza e a morfologia dos astrócitos em cultura astrocítica utilizando colorações imunocitoquímicos para bem estabelecida erecentemente descritos marcadores de astrócitos. Este sistema de cultura pode ser facilmente usado para obter os astrócitos de rato puros e astrócitos meio condicionado para estudar vários aspectos da biologia do astrócito.
Introduction
Os astrócitos são um tipo de célula muito abundantes no sistema nervoso central (SNC). A razão entre os astrócitos de neurónios é 1:3 no córtex de ratos e ratazanas, enquanto que existem 1,4 astrócitos por neurónios no córtex humano 1. Interesse em função de astrócitos aumentou dramaticamente nos últimos anos. A função principal de astrócitos é o seu papel no apoio estrutural e metabólica dos neurônios 2,3. Papéis recém-descobertos para astrócitos abrangem um amplo espectro de funções. Estes incluem guiar a migração de axónios em desenvolvimento e neuroblastos determinados durante o desenvolvimento 4-6, a formação de funções na transmissão sináptica, sinapse força e de processamento de informações por circuitos neurais 7-9, papéis na barreira hemato-encefálica (BHE) 10 e 11-13 integridade e regulação do tônus vascular cerebral 14. Outra característica importante dos astrócitos é a sua resposta a lesões. Sob astrocyt condições patológicases tornar reactivo e mais regular positivamente a expressão do filamento intermediário glial da proteína fibrilar ácida (GFAP) e inibidores da matriz extracelular (ECM) proteínas 15,16. Astrócitos reativos demarcar o local da lesão do tecido saudável através da formação de uma cicatriz glial, que consiste principalmente de astrócitos proteínas secretadas ECM do sulfato de condroitina proteoglicanos família (CSPG), os principais fatores que inibem a regeneração axonal após lesão do SNC 15-17.
Os astrócitos são originários de radiais gliais (RG), as células durante a embriogênese tarde e vida pós-natal precoce. Após a especificação dos astrócitos ocorreu, precursores de astrócitos migram para as suas posições finais, em que começa o processo de diferenciação terminal. In vivo, os astrócitos parecem estar maduro três a quatro semanas após o nascimento, tal como indicado pela sua morfologia típica 18,19. Uma subpopulação de células de RG converter em astrócitos zona subventricular (do tipo células B). Both RG, e as células do tipo B funcionam como astrócitos do tipo de células estaminais neurais (NSC) durante o desenvolvimento e no adulto, respectivamente. Como astrócitos RG, e as células do tipo B também expressam o transportador glutamato astrócito-específico (GLAST), proteína de ligação ao lípido cérebro (BLBP) e GFAP, indicando que estes marcadores não pode ser exclusivamente utilizado para rotular os astrócitos especificamente adultos. Em contraste com os adultos astrócitos parenquimatosas, que não se dividem no cérebro saudável, RG e B do tipo células exibem potencial das células estaminais, tais como a capacidade de se auto-renovar. A desregulação dos astrócitos tem sido implicada em numerosas patologias, incluindo a doença de Alzheimer 20,21, doença de Huntington, 22, doença de Parkinson 23, 24 e síndrome de Rett doença de Alexander 25. Além disso, os astrócitos reagir a todos os insultos do SNC, levando à activação de astrócitos e a formação de cicatriz glial astrocítica 16,26. A cicatriz glial astrocitária que forma tr cérebro seguinteauma lesão da medula espinhal ou é pensado para ser a principal barreira impedindo a regeneração neuronal 15.
O desenvolvimento de métodos fiáveis para isolar e manter populações puras de células tem sido essencial para a compreensão do sistema nervoso. Trabalho pioneiro de McCarthy e de Vellis permite investigadores a data para preparar culturas quase puras de astrócitos do tecido de ratos neonatos 27. Muito tem sido aprendido sobre a biologia astrócitos usando este método, que é apresentado aqui em uma forma ligeiramente modificada para isolar astrócitos de rato corticais. Complementando os estudos in vivo, astrócitos, bem como meio condicionado obtido usando o descrito na cultura in vitro, são ferramentas valiosas para continuar a obter insights sobre funções de astrócitos.
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Protocol
1. Isolamento e Chapeamento de Mixed células corticais
Isolamento celular mista cortical para culturas de astrócitos podem ser realizados utilizando P1 a P4 crias de rato. Para alcançar densidade adequada dos astrócitos é necessário utilizar quatro córtices pup rato por frasco de cultura de tecidos T75. Por conseguinte, os volumes no protocolo que se segue são calculados para uma preparação de células com 4 crias de rato.
- Antes de iniciar o procedimento de dissecção, 30 ml de Pré-aquecer os meios de cultura de astrócitos (DMEM, glucose elevada + 10% de soro fetal de soro de bovino a 1% + Penicilina / Estreptomicina, ver tabela) a 37 ° C. Um casaco frasco T75 com 20 ml de poli-D-lisina (PDL), a uma concentração de 50 ug / ml em água de grau de cultura de células durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO2.
- Para o procedimento de dissecção, preparar todos os reagentes e materiais necessários. Você vai precisar de: uma tesoura cirúrgica, lisas pinça fina, pinças ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, 70% de etanol umd 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) sobre gelo enchido com 2 ml de HBSS a cada.
- Segurar delicadamente e pulverizar a cabeça e pescoço do rato filhote com etanol 70%. O animal é sacrificado por decapitação utilizando uma tesoura.
- Realizar uma incisão na linha média, posterior para anterior, ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio.
- Corte o crânio cuidadosamente desde o pescoço até o nariz. Dois cortes adicionais são realizados para permitir o acesso ainda mais para o cérebro: O primeiro corte é feito anterior dos bulbos olfatórios, o outro inferior do cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio.
- Usando a pinça de ponta plana, as abas cranianas são suavemente virado para o lado e o cérebro é retirado e colocado no primeiro prato de dissecação cheio com HBSS. Coloque o prato de volta no gelo e continuar a colher todos os quatro cérebros.
- O resto do procedimento de dissecção é realizada sob um estereomicroscópio. Em primeiro lugar, os bulbos olfativos e no cerebelo são removidos usando o finofórceps de dissecção (Figura 1B).
- A fim de recuperar o córtex, pegue a extremidade posterior do cérebro com a pinça fina, realizar uma incisão entre os hemisférios, inserir um segundo conjunto de pinça para o bosque criado e retire a estrutura da placa-como o córtex do cérebro.
- Dissecar cuidadosamente as meninges dos hemisférios corticais, puxando com o fórceps finos (Figura 1D). Este passo evita a contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos. Transfira os hemisférios corticais preparadas para o segundo prato cheio com HBSS e devolvê-lo em gelo. Continuar de acordo com todos os 4 cortices.
- Finalmente, cortar cada hemisfério do córtex em pequenos pedaços, utilizando lâminas cortantes (cerca de 4 a 8 vezes).
- Sob condições estéreis, pedaços de córtex de transferência para um tubo Falcon de 50 ml e adicionar HBSS para um volume total de 22,5 ml.
- Adicionar 2,5 ml de 2,5% de tripsina, misturar e incubaro tecido no banho de água a 37 ° C durante 30 min. Misturar por agitação ocasional cada 10 min.
- Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg para peças de tecido do córtex da pelota.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação. A fim de evitar a perda do tecido pellet pode ser mecanicamente retê-lo usando uma pipeta. Dissociar o tecido numa única suspensão de células por adição de 10 ml de meio de revestimento de astrócitos e pipetagem vigorosa com uma pipeta de plástico de 10 ml até pedaços de tecido são dissociadas em células individuais (20 a 30 vezes). Ajustar o volume a 20 ml com o meio de revestimento de astrócito. Pode prova a dissociação do tecido do córtex em células individuais por contagem usando um hematocytometer. Uma preparação de 4 córtices rato filhote deve render 10-15 x10 6 dissociadas células individuais.
- Aspirar PDL a partir do balão de cultura T75, a placa de suspensão de células dissociadas único e incubar a 37 ° C na incubadora de CO2.
2. Obtenção de um EnrCultura astrocitária iched
- Altere as médias 2 dias após o plaqueamento das células corticais e mistas todos os 3 dias seguintes.
- Depois de 7-8 dias, quando os astrócitos microglia são confluentes e sobreposição sentar exposta sobre a camada de astrócitos são ou já separado da camada de astrócitos (Figura 2), agitar o frasco T75 a 180 rpm durante 30 min num agitador orbital a remover microglia. Descartar o sobrenadante contendo microglia ou se deseja para a cultura e examinar microglia, girá-lo para baixo e placa para cultura de 28,29.
- Adicionam-se 20 ml de meio de cultura fresco astrócitos e continuar agitando o frasco a 240 rpm durante 6 h para remover as células precursoras de oligodendrócitos (OPC). Uma vez que alguns OPCs não destacar completamente a partir da camada de astrócitos, continuar a agitar vigorosamente à mão durante 1 minuto, a fim de evitar a contaminação do OPC. Descartar o sobrenadante ou girá-lo para baixo e placa, se quiser cultura OPCs 29.
- Lave o restante confluent camada de astrócitos duas vezes com PBS, aspirar o PBS, adicionar 5 ml de tripsina-EDTA e incubado no incubador de CO2 a 37 ° C. Verifique destacamento de astrócitos a cada 5 minutos e fazer cumprir destacamento de astrócitos por bater o frasco contra a palma da sua mão (2-3 vezes).
- Depois de astrócitos são separadas do frasco de cultura, adicionam-se 5 ml de meio de cultura de astrócitos, células de rotação a 180 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e adicionar 40 ml de meio de revestimento fresco de astrócitos. Um frasco de cultura de tecidos T75 deve render cerca de 1x10 6 células após o desdobramento primeira célula. As células da placa em dois frascos de cultura T75 e incubar a 37 ° C na incubadora de CO2. Alterar o meio a cada 2 a 3 dias.
- 12-14 dias após a primeira divisão astrócitos são plaqueadas na célula concentração adequada 24-48 horas antes de realizar a experiência. Um frasco de cultura de tecidos T75 deve render cerca de 1,5-2 x10 6 células após a separação segunda célula.
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Representative Results
Após o isolamento do cérebro de rato completo (Figura 1A), o cerebelo e os bulbos olfativos tem que ser removido (Figura 1B). Os córtices são descascadas do tronco cerebral do rato (Figura 1C) e meninges do córtex individual (Figura 1D ') são cuidadosamente removida (Figura 1E). Meninges são óbvias pelo sistema artéria meníngea e resultados de remoção incompleta em contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos.
Após o plaqueamento da suspensão de células mista cortical, alguns astrócitos já anexar ao frasco de cultura dentro de 24 horas (Figura 2A). No entanto, o sobrenadante de cultura de células irá conter os detritos celulares e os neurónios a morrer durante os primeiros 3 a 5 dias (Figura 2A-C), como o meio de cultura favorece a sobrevivência e crescimento de células da glia. Uma vez que os astrócitos são confluentes e microglia sento exposta na astrocytcamada e, normalmente no dia 7 após o isolamento das células corticais mistas, astrócitos devem ser separados a partir de microglia e OPCs por agitação (Figura 2D). 2 dias após as células divididas primeiro demonstrar a morfologia de astrócitos. Neste ponto densidade astrócitos é baixo e astrócitos são volumosos (Figura 2E, setas pretas indicam uma célula). O rendimento esperado neste ponto é baixo com cerca de 4-6 x 10 5 células por frasco de cultura de tecidos T75. No entanto, as células continuam a proliferar e amadurecer na cultura neste ponto de tempo. Os astrócitos são normalmente utilizados para experiências no 21 ° dia a 28 (Figura 2F), para garantir um fenótipo maduro de astrócitos isolados. Neste ponto, o rendimento esperado é de cerca de 1,5-2 x 10 6 células por frasco de cultura de tecidos T75.
A pureza da cultura de astrócitos tem sido caracterizada por estudos de microscopia eletrônica morfológicas, expressão marcador celular e capacidade de resposta farmacológica 27. A contaminação do umstrocyte cultura pode ser examinado usando marcador de microglia (IBA-1) e OPCs (O4). A pureza da cultura obtida de astrócitos e maturidade devem ser examinados por análise imunocitoquímica utilizando um anticorpo contra a proteína de GFAP. Espera-se que a maioria das células apresentam um sinal, intensivo filamentosos (Figura 3). O nosso método de isolamento e cultura de astrócitos corticais resultou numa pureza de astrócitos superior a 98%, revelada por utilização de um anticorpo contra a proteína de GFAP (Figura 3). Se o procedimento foi bem sucedido, as células contaminantes são raros (<2%) e contêm microglia e OPCs, que podem ser coradas utilizando IBA-1 e O4, respectivamente. Se desejado, análise ulterior de outros marcadores, tais como astrócitos Aquaporin-4, BLBP, S100B e GLAST pode ser usado. Além de GFAP, estes marcadores foram todas expressas pelos 28 dias de idade culturas de astrócitos. Perfil de expressão do gene recente de populações purificadas de astrócitos revelou ast novo potencialrocyte marcadores, tais como a enzima metabólica do folato ALDH1L1 30,31, o que também é expresso pela maioria dos astrócitos isolados do córtex (Figura 3).
Figura 1. Dissecção do córtex pós-natal do rato (P3). Um cérebro) Total. B) após a remoção do Cérebro bulbos olfativos e cerebelo. C) Isolamento de córtices por peeling da estrutura em forma de placa do córtex do cérebro. D, Cortex D ') do site ventral e dorsal com meninges (setas pretas indicam artérias das meninges). E) Cortex sem meninges. Barra de escala, de 1,5 mm.
Figura 2. Visão morfológica de isolados mistos células corticais e cultura de astrócitos pura em momentos diferentes após o isolamento.A) 1 dia após o plaqueamento de células corticais mistas. Astrócitos primeiros são ligados ao fundo do balão (setas pretas) e neurónios moribundos são no sobrenadante. B) 3 dias após o plaqueamento de células corticais mistas. Camada de astrócitos é formador (setas pretas). Os neurônios são quase ausente. C) 5 dias após o plaqueamento de células corticais mistas. Microglia primeiro e OPCs no topo de uma camada de astrócitos (setas pretas). D) 7 dias após o plaqueamento de células corticais mistas. Camada de astrócitos é completamente confluentes. E) Depois de retirar a microglia e OPCs por agitação vigorosa e 2 dias após a divisão, as células em anexo mostram a morfologia dos astrócitos com baixa densidade (setas indicam uma célula). F) camada astrocitária mostra alta densidade de 2 semanas após a primeira divisão. Barra de escala, 10 um.
Figura 3. Pureza da cultura de astrócitos primários. Imunomarcação de cul primária de astrócitos de ratoturas com os marcadores GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 e BLBP (toda verde) revelou cultura primária de astrócitos pura. Os núcleos são corados com 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (azul). Barra de escala: 10 ^ m.
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Discussion
O método descrito aqui é baseado na preparação da cultura de astrócitos de cérebros de roedores neonatais, originalmente descritos por McCarthy e Vellis de, em 1980, 27. O método de modificação do isolamento e da cultura de astrócitos corticais a partir de P1 a P4 pós-natal do cérebro de rato aqui apresentado é rápido, rendimentos puros astrócitos primários e é altamente reprodutível. Esta técnica pode ser facilmente transferido para isolar os astrócitos de outras espécies, tais como o rato ou a partir de porco e de outras regiões do cérebro, tais como a medula espinhal. Considerando o isolamento de células progenitoras a partir de astrócitos do cérebro neonatal pela McCarthy e método DeVellis gera células altamente proliferativas, a proliferação celular e a propagação de astrócitos isolados de pós-natais filhotes de rato P1-P4 é limitada. Depois de astrócitos dividindo uma vez aos 7 dias in vitro (DIV), que irão crescer até à confluência e madura. In vivo, a proliferação dos astrócitos é mais amplamente realizado por P14 32. Elere, sugerimos usar astrócitos para experimentos em dias 21 e 28 DIV (Figura 2F) para assegurar o fenótipo maduro de astrócitos isolados. Devido à limitação intrínseca para proliferar culturas de astrócitos não deve ser dividida mais de 3 vezes.
Etapas críticas no método de isolamento descritas são a digestão dos córtices ea trituração seguinte do tecido digerido para obter a suspensão de célula única. Portanto, é necessário optimizar a concentração de tripsina e tempo de digestão, a fim de se obter uma suspensão de célula única, após a trituração do tecido do córtex cerebral de 20-30 vezes. A fim de minimizar a variação da tripsina devem ser divididos em alíquotas e os ciclos de congelação-descongelação deve ser evitado. O processo descrito baseia-se no plaqueamento das células corticais mistas em frascos de cultura revestidos com PDL, o que assegura a ligação dos astrócitos e promove uma camada confluente de astrócitos vários dias após o plaqueamento. Enquanto PDL revestimento não é necessário para m astrócitoanutenção após a sua separação da microglia e oligodendrócitos, pode ser realizada para certas aplicações a jusante, tais como a coloração immunofluorescene. Bom tempo da divisão primeira célula é importante para a integridade celular e rendimento. Se astrócitos são cultivadas além chegaram confluência, você pode perder a maioria das células, devido ao descolamento insuficiente durante a divisão de células primeiro. Isto não pode ser superada pelo aumento do tempo de desprendimento, uma vez que o tempo de incubação com tripsina extensa influencia negativamente a integridade celular. Em contraste, a suspensão de células do plaqueamento cortical muito dificilmente irá resultar na formação insuficiente de uma camada de células confluentes de astrócitos. A melhor época para a divisão primeira célula é de 7 a 8 dias após o plaqueamento de células corticais mistas, quando os astrócitos são confluentes e células da microglia sentar-se na posição mais alta da camada de astrócitos.
Em cultura de células descrito cortical, astrócitos mostram heterogeneidade celular (<strong> Figura 3), tal como foi descrito para os astrócitos in vivo 33,34. No entanto, a definição de morfologia de astrócitos e funcionalidade diversificada tem sido dificultada pelo número limitado de marcadores para identificar e distinguir subtipos de astrócitos potencialmente heterogéneos. Um marcador bem caracterizado da fibroso maduro e astrócitos reactivos é GFAP. No entanto, quase não é GFAP maduros expressa por astrócitos protoplasmáticos, limitando a sua utilização como marcador para todos os astrócitos e também é expresso por células de RG durante o desenvolvimento e pelas células B no adulto, restringindo a sua utilização como um marcador de fase específica. Outros marcadores de astrócitos, incluindo GLAST, ALDH1L1 ou BLBP, são também expressos por astrócitos imaturos e, portanto, não exclusivamente marcar os astrócitos maduros. Finalmente, os marcadores de astrócitos maduros, tais como GFAP, Aquaporin-4, e S100B (Figura 3) são cada vez mais sobre-regulada durante a maturação pós-natal.
Em nossas mãos, astculturas rocyte numa idade de 4 semanas, têm características de astrócitos maduros in vivo. Usando culturas primárias de astrócitos pudéssemos identificar o mecanismo molecular como o sangue fibrinogênio proteína nascido induz a ativação de astrócitos 17. Os nossos estudos revelaram que o fibrinogénio é um portador de latente de TGF-β. Tratamento de astrócitos primários com fibrinogénio levou à formação de TGF-β activa e a activação da via de sinalização TGF-β/Smad em astrócitos 17,26. Estes resultados foram confirmados utilizando injecções de fibrinogénio in vivo. Além disso, os astrócitos controlar outros tipos de células, através da secreção de substâncias, que podem ser analisadas por colheita astrócito meio condicionado e aplicar este meio condicionado para outros tipos de células. Nós utilizado anteriormente astrócitos-condicionado de médio a analisar em um ensaio funcional como meio condicionado de fibrinogênio tratados com astrócitos afeta neuritos. Reativa astrócitos expressam e secretamproteínas da família CSPG, que inibem o crescimento de neurites 16. Com efeito meio condicionado a partir de fibrinogénio tratados com astrócitos diminuiu significativamente o comprimento de neurites e a percentagem de células que mostram o crescimento de neurites 17.
O isolamento e cultura de astrócitos corticais descritas neste protocolo fornece uma ferramenta poderosa para investigar a biologia astrócitos, já que sua capacidade de gestão em diversas aplicações, pode extremamente completar sua investigação in vivo. No entanto, deve-se ter em mente que os astrócitos obtidos foram cultivadas in vitro e enquanto eles reflectem muitas características de astrócitos, que também diferem em astrócitos in vivo. Por isso, outros métodos de seleção direta e isolamento de astrócitos por immunopanning 35 ou baseado em anticorpos isolamento FACS 36 representam novos caminhos para investigar as propriedades fundamentais de astrócitos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Apoiado pela Fundação Fazit graduação bolsa para SS, o Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF 01 OE 0803) para KB e da Comissão Europeia FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, ea Fundação Alemã de Pesquisa Grant SCHA 1442 / 3-1 para CS Os autores não têm conflitos de interesses financeiros.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
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