Summary
הפרוטוקול הבא מספק טכניקות לencapsulating לבלב β-תאים בידרוג PEG-פפטיד שלב צמיחה שהוקם על ידי thiol-ene תגובות תמונה בלחיצה. פלטפורמת חומר זה לא רק מציעה microenvironment cytocompatible אנקפסולציה תא, אלא גם מאפשרת התאוששות מהירה למשתמש שליטה מלאה של מבני תא נוצרה בתוך הידרוג.
Abstract
הידרוג הם פולימרי crosslinked הידרופילי המספקים microenvironment תלת ממדים עם רקמות כמו גמישות וחדירות גבוהות לתאים או רקמות טיפוליות רלוונטיים culturing. הידרוג הוכן מפולי (אתילן גליקול) (PEG) נגזרים משמשים יותר ויותר למגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות, בחלקו בשל המאפיינים מתכוננים וcytocompatible. בפרוטוקול זה, אנו מנוצלים thiol-ene photopolymerizations שלב צמיחה לפברק הידרוג PEG-פפטיד לencapsulating לבלב MIN6 תאי B. הג'לים נוצרו על ידי 4-זרוע PEG-norbornene macromer (PEG4NB) וcrosslinker פפטיד chymotrypsin רגיש (CGGYC). הטבע הידרופילי ולא עכירות של PEG מציע microenvironment cytocompatible להישרדות תא והתפשטותו ב3D, תוך השימוש ברצף פפטיד chymotrypsin הרגיש (C GGY ↓ C, חץ מציין אתר מחשוף אנזים, בעוד ציסטה מסוףשאריות eine נוספו לcrosslinking thiol-ene) מאפשר התאוששות מהירה של מבנים בתוך תא יוצרים הידרוג'ל. הפרוטוקול הבא מפרט טכניקות ל: (1) Encapsulation של MIN6 β-תאים בthiol-ene הידרוג; (2) מבחני כדאיות סלולרית איכותיים וכמותיים לקביעת הישרדות תא ושגשוג; (3) שחזור של שספרואידים סלולריים באמצעות ג'ל chymotrypsin בתיווך שחיקה; ו (4) ניתוח מבני ותפקודי של הספרואידים התאוששו.
Introduction
הידרוג הם פולימרי crosslinked הידרופילי עם פוטנציאל יוצא דופן כחומרי פיגומים לרקמות תיקון והתחדשות. 1-3 תכולת המים הגבוהה של הידרוג מאפשרת דיפוזיה קלה של חמצן וחומרים מזינים חילופים ומוצרים מטבוליות סלולריים, שכולם חיוניים לשמירה על כדאיויות תא. בנוסף, הידרוג הם נישא מצוין לשחרור מבוקר ומשלוח תא בשל tunability הגבוה שלהם. 2 הידרוג סינטתית כגון אלה שהוכנו מפולי (אתילן גליקול) (PEG) משמשים יותר ויותר ביישומי הנדסת רקמות, בעיקר בשל cytocompatibility, רקמות כמו אלסטיות, וtunability גבוה בחומר תכונות פיסיקליות ומכאניות. 4-6
למרות פלטפורמת הידרוג נפוץ, מחקרים הראו כי PEG diacrylate (PEGDA) הידרוג נוצרה על ידי photopolymerizations שרשרת צמיחה יש נטייה לפגוע בתאים במארז duricrosslinking ng הרשת ובאתרו אנקפסולציה תא. 7 ניזק לתאים יוחס בעיקר למינים רדיקליים שנוצרו על ידי מולקולות photoinitiator, אשר מתפשטות דרך הקבוצות ויניל על PEGDA לשרשרות פולימר לתוך Crosslink הידרוג. למרבה הצער, מינים רדיקליים אלה גם לגרום ללחצים וניזקים סלולריים בעת אנקפסולציה תאים, במיוחד לתאים קיצוניים רגישים כגון לבלב β-תאים. 8-10 על מנת לקבל את גודל רשת גבוהה יותר עבור דיפוזיה טובה יותר והישרדות תא, משקולות מולקולריות גבוהות יותר PEGDA משמש לעתים קרובות לאנקפסולציה תא. זה, לעומת זאת, פוגע בקינטיקה פולימריזציה וגורם למאפייני biophysical ג'ל תת אופטימליים. 7,11,12 בנוסף לחסרונות שהוזכרו לעיל, זה מאוד קשה להתאושש ממבני תאי הידרוג PEGDA בשל ההטרוגניות ושאינן מתכלה, אופי רשתות crosslinked. בעוד פפטידים פרוטאז רגישים יכולים להיות משולביםלשדרת PEG macromer כדי להבהיר את הידרוג PEGDA אחרת אינרטיים הרגישה למחשוף האנזימטית, הנטייה לעתים קרובות משתמשת בריאגנטים יקרים ורשתות כתוצאה עדיין מכילות רמה גבוהה של הטרוגניות בשל האופי של פילמור בשרשרת צמיחה. 13-15
לאחרונה, הידרוג PEG-פפטיד שנוצרה באמצעות צעד צמיחת photopolymerization thiol-ene הוכחה להציג תכונות מועדפות לאנקפסולציה תא מעל הידרוג נוצרה על ידי photopolymerization שרשרת צמיחה. 7 קינטיקה gelation המעולה של thiol-ene הידרוג מיוחסת ל'קליק "טבעה של תגובה בין פונקציות Ene thiol ו. בהשוואה לפילמור בשרשרת צמיחה של PEGDA, תגובת thiol-ene פחות חמצן שתוצאתו שיעור gelation מהר יותר. עכבות 16,17 הידרוג Thiol-ene גם יעילות גבוהה יותר ופילמור מאפייני biophysical ג'ל טובים יותר בהשוואה לשרשרת צמיחת PEGDA הידרוג, 7 , 18 </ Sup> שתוצאתו ניזק לתאים הנגרם על ידי זנים מוגבלים קיצוניים במהלך photopolymerization.
בעבר, הידרוג thiol-ENE הוקמה על ידי 4-זרוע PEG-norbornene (PEG4NB) macromer וcrosslinkers bis-ציסטאין המכיל פפטיד, כגון פרוטאז רגישים פפטידים כבר נוצל לאנקפסולציה תא. Tunability גבוה 7,18 של רשתות הידרוג PEG מציע microenvironment גמיש והשליטה 3D לחקירת הישרדות תא ופעילות, תוך השימוש ברצף פפטיד פרוטאז הרגיש מספק דרך קלה להתאוששות של מבני תא שנוצרו באופן טבעי בתוך הידרוג. בפרוטוקול זה אנו מנצלים צעד צמיחת photopolymerized thiol-ene הידרוג המפוברקת באמצעות 4-זרוע PEG-norbornene (PEG4NB) וcrosslinker פפטיד chymotrypsin רגיש (CGGY ↓ C) לאנקפסולציה של MIN6 תאי β. פרוטוקול זה מרחיב באופן שיטתי ללימוד טכניקות הישרדות, השגשוג ואליפטית היווצרות MIN6β-תאים בידרוג thiol-מז. בנוסף, אנו מספקים שיטה להתאוששות אליפטית β-תאים ואפיון ביולוגי של שספרואידים התאוששו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
א Macromer וסינתזת פפטיד
- לסנתז 4-זרוע PEG-norbornene (PEG4NB) וarylphosphanate ליתיום photoinitiator (LAP) באמצעות פרוטוקולים מבוססים. 18,19
- לסנתז bis-ציסטאין המכיל פפטיד chymotrypsin הרגיש CGGY ↓ C (חץ מציין אתר המחשוף chymotrypsin) באמצעות סינתזת פפטיד הסטנדרטית מוצקה שלב בסינתיסייזר פפטיד מיקרוגל (CEM גלה SPS).
- לחשב את הסכום של שרף (שרף MBHA רינק-אמיד) צורך בהתבסס על יחס ההחלפה של השרף וקנה מידת הסינתזה. יפי השרף בdimethylformamide (DMF) בכלי תגובה (RV) במשך 15 דקות.
- הסר Fmoc-הגנת קבוצה מהשרף באמצעות פתרון המכיל deprotection Piperidine 20% ו M HOBt 0.1 בDMF. השתמש בפרמטרים המפורטים בטבלה שלהלן לFmoc-deprotection מיקרוגל בסיוע (לכל חומצות אמינו-Fmoc):
קנה מידת סינתזה 0.1 mmole 0.2 mmole כוח 20 ואט 50 ואט טמפרטורה 75 ° C 75 ° C זמן 3 דקות 3 דקות - בעקבות deprotection, לשטוף את השרף עם DMF ולבצע בדיקת Ninhydrin כדי לאשר את ההסרה של Fmoc (חשיפה של N-מסוף אמין). שרף צריך להפוך לכחול אחרי 2 דקות ב 95 ° C.
- לאחר deprotection, זוג מוצלח החומצה אמינית Fmoc-1 ב-C-הסופי (סינתזה יוצאת מג' ל- N-תחנה סופית) בבסיס פתרון activator (0.28 M Diisopropylethylamine (DIEA) בDMF) עם הפרמטרים המפורטים בטבלה שלהלן .
קנה מידת סינתזה 0.1 mmole 0.2 mmole כוח 20 ואט 50 ואט * טמפרטורה 75 ° C 75 ° C * זמן 5 דקות 5 דקות
* לציסטה ו, השתמשו 50 מעלות צלזיוס ו 10 דקות כדי להפחית racemization. - שטוף את השרף ולבצע בדיקת Ninhydrin איכותי כדי לאשר את השלמת הצימוד (היעלמותו של N-מסוף אמין). שרף צריך להיות ברור לאחר 5 דקות ב 95 ° C. חזור על שלב צימוד (A.2.d) אם בדיקת Ninhydrin מחזירה תוצאה חיובית (בצבע כחול).
- deprotection חזור (הצעד A.2.b) וצימוד (A.2.d צעד) לחומצות אמינו נוספות ברצף שהסתיים בצעד deprotection סופי.
- מסנן את הקרוואנים, לשטוף שרף עם 25 מ"ל של dichloromethane (DCM). צעד זה הוא כדי לשטוף את DMF, שהוא בסיס ויפריע מחשוף פפטיד.
- הכן קוקטייל מחשוף ידי ערבוב 250 מ 'גרם פנול בחומצת 4.75 מיליליטר Trifluoroacetic (TFA), 0.125 המ"ל Triisopropylsilane (TIS) והמ"ל DDH 2 O. 0.125
- הוסף פתרון מחשוף לקרוונים, והדבק למשך 30 דקות בסינתיסייזר פפטיד המיקרוגל (כוח = 20 ואט; טמפרטורה = 38 מעלות צלזיוס).
- איסוף פתרון פפטיד בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל באמצעות סעפת ואקום.
- פפטיד המשקע בקע ב40 מ"ל של אתר, מערבולת הצינור וצנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 5 דקות כדי לאסוף את הפפטיד.
- מסנן את supernatant ולחזור A.2.k צעד פעמים.
- לאסוף ולייבש פפטיד בואקום.
- לטהר את הפפטיד באמצעות HPLC ולאפיין אותה עם ספקטרומטריית מסה.
הכנה ועיקור חומר B.
- להכין תמיסת 20% wt PEG4NB ב PBS, מערבולת את התערובת עד macromer מתמוסס לחלוטין, ולעקר את פתרון macromer באמצעות מסנן מזרק. אחסן את הפתרון עוקר ב-20 ° C (aliquots להכיןעבור אחסון לטווח ארוך).
- הכן ולעקר פתרון photoinitiator 2 wt% (LAP) ב PBS. אחסן את פתרון העיקור בטמפרטורת חדר המוגן מפני אור.
- ממס את הפפטיד (CGGYC) ב PBS, מערבולת את התערובת והמזרק לסנן פתרון לעיקור. Aliquot פתרון וחנות פפטיד ב -20 ° C עד השימוש (למנוע מחזורי הקפאת הפשרה).
- קבע thiol (-SH) ריכוז בפתרון פפטיד שהוכן באמצעות ריאגנט של אלמן (בעקבות הפרוטוקול של היצרן). צעד זה ייתן לי ריכוז הפפטיד מדויק (כלומר, [SH] / 2) כי הוא נדרש לחישוב כמות פפטיד שישמש בתגובות תמונות לחצו thiol-מז.
- הכן תבניות gelation על ידי חיתוך החלק העליון מעל 1 מיליליטר מזרקים חד פעמים סטריליים באמצעות סכין גילוח (קצה פתוח להסרת ג'ל). לעקר את תבניות המזרק ידי חיטוי.
- בהתבסס על הניסוח הרצוי ג'ל (thiol יחס ene = 1) וריכוזים של תאומת המניותריאל, לחשב את הנפח הנדרש של פולימר, crosslinker פפטיד, photoinitiator, ופתרוני חיץ הנדרשים.
הכנת תא ג
- לאזן בינוני תרבית תאים (גבוה גלוקוז DMEM המכיל 10% עוברי שור בסרום; אנטיביוטיקת Antimycotic עם 100 U / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, 250 ng / ml Fungizone; וβ-mercaptoethanol מיקרומטר 50) הפתרון, של האנק מאוזן המלח ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + חינם), וטריפסין-EDTA עד 37 ° C.
- הסר צלוחיות המכילות MIN6 β-תאים מCO 2 חממה ולמקם את הצלוחיות בברדס הזרימה למינרית.
- לשאוב תקשורת סלולרית תרבות מהצלוחיות ולשטוף את התא עם HBSS.
- Trypsinize התאים באמצעות 3 מ"ל של 2X (0.1%) טריפסין-EDTA ולדגור על הצלוחיות ל4 דקות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- הערה: השתמש בפתרון 2X טריפסין מאפשר ניתוק מוחלט של MIN6 β-תאים לתוך השעית תא בודדה.
- לאחר דגירה, להקיש על צלוחיות על פני השטח של מכסה המנוע בעדינות כדי לנתק את התאים לחלוטין. לאשר את הניתוק וההפרדה של התאים באמצעות מיקרוסקופ.
- הוסף נפח שווה של מדיום תרבית תאים לנטרל טריפסין. מערבב היטב על ידי pipetting הפתרון העדין, לאחר מכן להעביר את התערובת לצינור וצנטריפוגה הקנונית למשך 5 דקות ב1000 סל"ד.
- לשאוב supernatant ועדינות מחדש להשעות את התאים ב4-5 מ"ל של תקשורת התרבות.
- קביעת צפיפות תאים באמצעות 50% חיץ כחול Trypan בhemocytometer.
ייצור Hydrogel ד וEncapsulation הסלולרי
- ברגע שהתאים מוכנים, לערבב (על בסיס של 1:1 thiol יחס ene) הכרכים המבוקשים לPEG4NB, CGGYC, LAP, פתרון תא, וHBSS בצינור microcentrifuge.
- מערבב בעדינות את הפתרון באמצעות פיפטה לקבל תערובת הומוגנית ולהוסיף 25 μl מהפתרון שנוצר לעובש מזרק. לחשוף את המזרק לאור UV (365ננומטר, 5 / סנטימטר mW 2) עבור 2 דקות.
- photopolymerization הבא, ג'לי לצלול לתוך מדיום סטרילי 24 גם צלחת המכיל תא תרבות ודגירת הידרוג ב37 ° C ו 5% CO 2.
- שטוף את הידרוג תא העמוס בתרבית תאים בינוניים למשך 30 דקות כדי לשטוף את התאים באופן רופף מצורפים וmacromers בלתי crosslinked-. להעביר את הג'לי למדיום טרי.
- תקשורת סלולרית התרבות רעננה כל 2 עד 3 ימים.
Assay כדאיויות התא E.
המורפולוגיה של תאי Encapsulated ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ אור (מאז הידרוג המסונתזת הן שקופה). כדאיויות תא יכולה להיות חזותיות ונמדדה איכותיים באמצעות הכתמת חיים / מלח וכמותית באמצעות ריאגנט AlamarBlue.
E.1. מכתים חיים / מלח
- הפשר ריאגנטים מכתים חי / מלח בטמפרטורת חדר.
- בצינור הקנונית להוסיף PBS לפי מספר הדגימות (n) להיות מוכתם:
- 0.25 μl פיפטה של Calcein AM ו 2 μl של EthD-1 לכל 1 מ"ל של PBS לצינור קנונים המכיל PBS. מערבולת הפתרון לערבב את המרכיבים.
- דגירת הידרוג תא עמוס בפתרון מכתים חיים / מלח (0.5 / מדגם מ"ל) לשעה 1 בטמפרטורת חדר בהקפת מטרף.
- שימוש פסטר פיפטה, הסר את הפתרון לצבוע ולשטוף את המדגם פעמים עם PBS.
- הנח מדגם בתלוש כיסוי או שקופית זכוכית. להתבונן ותמונת תאים באמצעות מיקרוסקופ confocal.
E.2. AlamarBlue Assay
- הכן 10 v /% פתרון v AlamarBlue במדיום תרבות תא.
- הסר הידרוג מהחממה ולשאוב את התקשורת מחוץ לכל גם מבלי שיצר קשר עם הידרוג'ל.
- דגירת הידרוג תא עמוס ו( בקרה שלילית) גם ריקה ב500 μl של 10% פתרון AlamarBlue עבור 16 שעות.
- לאחר דגירה, 200 μl פיפטהמפתרון AlamarBlue בצלחת 96 היטב ופלואורסצנטי מידת השימוש microplate קורא (עירור: 560 ננומטר, פליטה: 590 ננומטר).
- פעילות המטבולית תאית גבוהה מקטינה את הצבע פלואורסצנטי לתת קריאה גבוהה יותר.
- הקפד לכלול לפחות שתי בארות של 10% פתרון Alamarblue כחסר. כאשר מנתחים את הנתונים, לחסר ערך פלואורסצנטי הריק הממוצעים מקריאת הקרינה של הדגימות.
פ chymotrypsin בתיווך שחיקת ג'ל ושחזור אליפטית
- הכן 1 מ"ג / מ"ל של פתרון טריפסין ללא α-chymotrypsin בHBBS וסטרילי מסנן הפתרון.
- דגירת הידרוג בפתרון chymotrypsin (500 μl לכל ג'ל) בטמפרטורת חדר עם טלטול עדין עד שחיקת ג'ל מלאה מושגת.
- לג'ל μl 25, הזמן לשחיקה מלאה הוא כ 5 דקות.
- מניח את הצלחת על קרח לכמה דקות כדי להפחית את הפעילות שלchymotrypsin.
- להעביר את פתרון תא ובצינור צנטריפוגה 1 מ"ל ב 300 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- הסר בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה מרעה ועדינות resuspend הספרואידים בHBSS.
- להעביר את פתרון אליפטית התאושש לצלחת 24 היטב ומניח את הצלחת על קרח כדי לאפשר הספרואידים לתמסד.
- לניתוח גודל, לרכוש תמונות לעומת שלב של הספרואידים מסולקות באמצעות מיקרוסקופ אור. מדד התאושש קטרי אליפטית באמצעות תוכנה כגון ניקון אלמנט תוכנה או ImageJ.
Assay הפונקציונלי ז spheroids שוחזר
G.1. הפרשת אינסולין גלוקוז מגורה מהספרואידים הסלולריים התאוששו
- בצלחת גם 24, דגירת הג'לי ב500 μl של 2 מ"מ נמוך גלוקוז Kerbs-רינגר חיץ (KRB) עבור 1 שעה.
- לשחוק את הג'ל ולהתאושש שספרואידים סלולריים באמצעות צעדי F.1 לF.6.
- לשאוב supernatant בזהירות מבלי לבצע כלקשר עם הספרואידים הסלולריים וresuspend הספרואידים ב500 μl של KRB גלוקוז הנמוך 2 מ"מ.
- העברת 100 μl של פתרון שספרואידים תא לצינור מ"ל 0.6 ולמקם אותו על קרח לכימות ATP תאי.
- פיצול הפתרון הנותר תא אליפטית במחצית (לשני צינורות microcentrifuge) וסרכזת עבור 2 דקות ב 300 סל"ד ו 4 ° C.
- Aspirate supernatant (כמעט עד לתחתית) וresuspend המחצית הראשונה של שספרואידים סלולריים ב1 מ"ל של KRB 25 מ"מ גבוה גלוקוז ומחצית שנייה ב1 מ"ל של KRB הגלוקוז נמוך 2 מ"מ.
- עדינות פיפטה ולהעביר תמיסה המכילה שספרואידים סלולריים התאוששו לצלחת 24 היטב. דגירה את הצלחת לשעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- לאחר דגירה, להעביר את הפתרון לצינור microcentrifuge וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1000 סל"ד ו 4 ° C.
- העברת 500 μl של supernatant מהצינור לצינור אחר centrifuged microcentrifuge ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך האינסוליןאליסה.
- בצע הפרוטוקול של היצרן הבא אינסולין ELISA.
G.2. Assay CellTiter Glo
- תקני ה-ATP: הכן את פתרון 10 מיקרומטר-ATP ולבצע דילולים סידוריים לקבל סדרה של 8 פתרונות סטנדרטיים.
- לצלחת גם לבנה 96, להוסיף 50 μl של פתרון אליפטית תא (מצעד G.1.6) וסטנדרטים.
- לכל אחד מהם דגימות ותקנים גם מכילות, להוסיף 50 μl של ריאגנט Glo CellTiter ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
- הדגירה באה, ספירת הארת מידה של הדגימות וסטנדרטים באמצעות לכייל ריכוזי מדגם ATP באמצעות עקומת רגרסיה לינארית שנוצרה על ידי תקני ה-ATP וקורא microplate.
- לקבוע את ריכוז ה-ATP במדגם ולהכפיל בפקטור דילול המדגם כדי לקבל את ריכוז ה-ATP התאי בידרוג תא אחד עמוס.
G.3. לקבוע את הפרשת אינסולין
- חישוב amount של אינסולין מופרש מהספרואידים התאוששו על ידי לקיחה את היחס של כמות האינסולין המופרש במדיום גלוקוז גבוה לכמות האינסולין מופרש במדיום גלוקוז נמוך.
- לנרמל את התוכן לכמת אינסולין של שספרואידים סלולריים עם כמות מתאימה של ה-ATP התאי של הספרואידים הסלולריים התאוששו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איורים 1-4 נציג תוצאות להראות לאנקפסולציה, הישרדות, התפשטות, היווצרות אליפטית, והתאוששות אליפטית בידרוג thiol-מז. איור 1 מציג את סכמטי התגובה (1) שלב צמיחת photopolymerization thiol-ene באמצעות PEG4NB וCGGYC, ו( 2) שחיקת chymotrypsin תיווך ג'ל העוקב מנגנון שחיקת פני שטח. איורי 2 ו 3 תוצאות המתקבלים באמצעות יכולת קיום בהווה מכתים חיים / מלח וassay AlamarBlue. אנו צופים שבתאים התרבו בידרוג PEG4NB-CGGYC גם בתא הנמוך אריזת צפיפות, המציין cytocompatibilty של מערכת הידרוג thiol-ene. איור 4 תמונות עם ניגודיות שלב מופעים של שספרואידים מקופלים והתאוששו תאי β, כמו גם את התפלגות הגודל של התאושש שספרואידים β-תאים.
_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
איור 1. סכמטי של שלב צמיחת thiol-ene תמונה לחץ תגובה באמצעות PEG4NB וCGGYC ליצור הצמוד PEG-פפטיד. הידרוג ניתן נשחק במהירות על ידי טיפול chymotrypsin.
איור 2. כדאיות ראשונית ואליפטית תא נוצרה בידרוג PEG4NB/CGGYC. (א) חיים / מלח מכתים בוצע מייד תמונתו אנקפסולציה הבאה. (ב) מכתים חיים / מלח שבוצע לאחר 10 ימים של התרבות במבחנה. תמונות מייצגות confocal Z-מחסנית של MIN6 β-תאים גלומות הידרוג PEG4NB/CGGYC% 4wt (2 × 10 6 תאים / מ"ל, בקנה המידה = 100 מיקרומטר). כדאיויות תא הוגדרו כאחוז מתאי חיים (ירוק) על פני תא כולל (ירוק + אדום) ספירה. (2 × 10 6 תאים / מ"ל, N = 4, ממוצע ± סטיית תקן).
איור 3. פעילות המטבולית של MIN6 β-תאים נמדד כפונקציה של זמן על ידי ריאגנט AlamarBlue (N = 3, ממוצע ± סטיית תקן). MIN6 β-תאים גלומים%, 3wt% 4wt והידרוג PEG4NB/CGGYC% 5wt ב2 × 10 6 תאים / מ"ל.
איור 4. אפיון MIN6 שספרואידים התאוששו β-תאים. שספרואידים סלולריים היו התאוששו מPEG4NB/CGGYC באמצעות chymotrypsin מיקרומטר 40 אחרי 10 ימים של התרבות במבחנה. (א) תמונת נציג ניגוד בשלב של שספרואידים כמוסים β-תאים. (ב) נציג תמונת ניגוד בשלב של שספרואידים β-cell התאוששו. (ג) ההפצה of קטרי אליפטית (צפיפות תא = 1 × 10 7 תאים / מ"ל).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר מציג פרטים על אנקפסולציה הקלה של תאים בידרוג thiol-ene נוצר על ידי photopolymerization שלב צמיחה. בעוד שיחס של 1:1 של stoichiometric norbornene לקבוצות פונקציונליות thiol היה בשימוש בפרוטוקול זה, היחס יכול להיות מותאם בהתאם לניסויים. בנוסף לניסוח נכון, חשוב לשמור על אחידות בפתרון מראש הפולימר. בפרט, להשתמש pipetting העדין כדי להבטיח שתאים מחולקים היטב בפתרון מראש פולימר על מנת להימנע מיצירת הגושים של תאים ושינוי במאפייני ג'ל. למרות זמן פילמור של 2 דקות שמש לcrosslinking ג'ל, ג'ל לנקודת thiol-ene הידרוג היא פחות מ 10 שניות ברוב הניסוחים סלולריים אנקפסולציה רלוונטיות (למשל, צבע ג'ל לידרוג PEG4NB/CGGYC wt% 4 הוא 7 ± 2 שניות ו 5% wt הם 6 ± 1 שניות). Gelation המהיר של מערכת הידרוג זה במהירות נועל את התאים במקום, וכתוצאה מcel הטוב יותרהפצת הליטר ב-3D בהשוואה לתוכניות אחרות, הלוקחות photopolymerization דקות או אפילו שעות כדי להגיע לנקודת ג'ל. 7,20
בנוסף, שספרואידים β-תאים שנוצרו באופן טבעי בthiol-ene הידרוג התגלו על ידי שחיקת ג'ל chymotrypsin בתיווך. Chymotrypsin, לעומת זאת, הוא אנזים במשפחת טריפסין וריכוז גבוה או זמן דגירה הארוכה של אנזים זה עשוי להשפיע לרעה על אינטראקציות תא סלולרי או אפילו לשבש את ארכיטקטורת אליפטית במהלך התאוששות. על מנת להימנע מהגבלת הפוטנציאל הזה, הידרוג ניתן crosslinked ידי מצעי thiolated אחרים ושחיקת ג'ל עדיין יכולה להיות מושגת על ידי אנזימים המתאימים שאינו גורמים אינטראקציה שלילית תאי תאים.
בסך הכל, הידרוג thiol-ene לספק סביבת cytocompatible לקידום השגשוג של β-תאים ב-3D. מערכת זו יכולה לשמש לתרבות וללמוד את ההתנהגות הפיזיולוגית של תאים מסוגים שונים ב3D. יתר על כן,מערכת זו מאפשרת להתאוששות קלילה של מבני תא שנוצרו בתוך מטריצת הידרוג'ל לאפיונים פונקציונליים נוסף וביולוגיים. מערכת הידרוג מגוונת וcytocompatible זה מספקת פלטפורמת ג'ל לרקמות 3D מורכבות הנדסיות ליישום הרפואה רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי NIH (R21EB013717) וIUPUI OVCR (RSFG). המחבר מודה גב 'האן שי לקבלת הסיוע הטכני שלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
