Summary
بروتوكول التالية توفر تقنيات التغليف البنكرياس β-cells في الهلاميات المائية PEG-الببتيد خطوة نمو ردود الفعل التي شكلتها الصورة مزدوجا فوق ثيول-إيني. هذا البرنامج ليس فقط المواد يقدم المكروية لتغليف الخلايا cytocompatible، ولكن أيضا يسمح للمستخدم التحكم الانتعاش السريع للهياكل الخلية تشكلت في الهلاميات المائية.
Abstract
الهلاميات المائية هي البوليمرات ماء crosslinked التي توفر المكروية ثلاثية الأبعاد مع الأنسجة مثل مرونة ونفاذية عالية للخلايا ذات الصلة زراعة الأنسجة أو علاجية. يتزايد استخدام الهلاميات المائية المحضرة من بولي (إيثيلين جليكول) (PEG) المشتقات لمجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة، ويرجع ذلك جزئيا إلى ممتلكاتهم والانضباطي cytocompatible. في هذا البروتوكول، ونحن تستخدم ثيول-إيني خطوة نمو photopolymerizations الى افتعال PEG-الببتيد الهلاميات المائية للتغليف البنكرياس MIN6 الخلايا البائية. وتم تشكيل المواد الهلامية التي كتبها 4-الذراع macromer (PEG4NB) PEG-نوربورنين وcrosslinker الببتيد كيموتربسين حساسة (CGGYC). طبيعة ماء وغير تلوث من PEG يقدم المكروية cytocompatible لبقاء الخلية والانتشار في 3D، في حين أن استخدام تسلسل الببتيد كيموتربسين حساسة (C GGY ↓ C، سهم يشير إلى الانقسام انزيم موقع، في حين كيسة محطةأضيفت مخلفات eine للثيول-إيني يشابك) يسمح الانتعاش السريع للبنيات الخلية تشكيل هيدروجيل داخل. بروتوكول التالية بالتفصيل تقنيات ل: (1) تغليف من MIN6 β-cells في ثيول-إيني الهلاميات المائية، (2) نوعية وكمية المقايسات بقاء الخلية لتحديد بقاء الخلية والانتشار، (3) استرداد الأجسام الشبه الكروية الخلية باستخدام كيموتربسين بوساطة هلام تآكل، و(4) التحليل البنيوي والوظيفي للالأجسام الشبه الكروية استردادها.
Introduction
الهلاميات المائية هي البوليمرات ماء crosslinked مع إمكانات استثنائية كمواد سقالات للإصلاح وتجديد أنسجة 1-3 من محتوى الماء عالية من الهلاميات المائية يسمح نشر سهلة من الأوكسجين والمواد المغذية وتبادل المنتجات الأيضية الخلوية، والتي تعتبر حاسمة للحفاظ على بقاء الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، الهلاميات المائية يحملون ممتازة لإطلاق وتسليم خلية تسيطر عليها بسبب tunability العالية .. 2 الهلاميات المائية الاصطناعية مثل تلك المحضرة من بولي (إيثيلين جليكول) (PEG) تستخدم بشكل متزايد في تطبيقات هندسة الأنسجة، إلى حد كبير بسبب cytocompatibility بهم، الأنسجة مثل مرونة، وtunability عالية في المواد الخصائص الفيزيائية والميكانيكية 4-6
على الرغم من أن منصة هيدروجيل شيوعا، وقد أظهرت الدراسات أن PEG diacrylate (PEGDA) الهلاميات المائية التي شكلتها سلسلة النمو photopolymerizations لديهم ميل إلى تلف خلايا مغلفة الدورينانوغرام يشابك شبكة والتغليف في الخلية الموقع .. 7 ويعزى إلى حد كبير إلى تلف الخلايا الراديكالية الأنواع التي تم إنشاؤها بواسطة جزيئات photoinitiator، الذي نشر من خلال مجموعات الفينيل على PEGDA لسلاسل البوليمر تشعبي في الهلاميات المائية. للأسف، هذه الأنواع المتطرفة أيضا أن يسبب تلف الخلايا الضغوط والتغليف خلال الخلية، وخاصة بالنسبة للراديكالية الخلايا الحساسة للالبنكرياس β مثل خلايا 8-10 من أجل الحصول على أعلى حجم شبكة لأفضل نشرها وبقاء الخلية، والأوزان الجزيئية أعلى PEGDA وغالبا ما تستخدم لتغليف الخلايا. هذا، ومع ذلك، يعرض للخطر حركية البلمرة ويسبب خصائص هلام دون المستوى الأمثل البيوفيزيائية. 7،11،12 بالإضافة إلى عيوب المذكورة أعلاه، فإنه من الصعب للغاية لاستعادة هياكل الخلية من الهلاميات المائية PEGDA نظرا لطبيعة التغاير وغير القابلة للتحلل، من شبكات crosslinked. في حين يمكن إدراج البروتيني حساسة الببتيداتفي العمود الفقري macromer PEG لتقديم خامل غير ذلك الهلاميات المائية PEGDA حساسة للانشقاق الأنزيمية، وغالبا ما يستخدم اقتران الكواشف باهظة الثمن وشبكات الناتجة لا تزال تحتوي على درجة عالية من عدم التجانس نظرا لطبيعة سلسلة البلمرة النمو. 13-15
في الآونة الأخيرة، وقد ثبت PEG-الببتيد الهلاميات المائية شكلت عبر بلمرة ضوئية المنشأ ثيول-إيني خطوة نمو لعرض خصائص تفضيلية لتغليف الخلايا على الهلاميات المائية التي شكلتها سلسلة النمو بلمرة ضوئية المنشأ. 7 وحركية الهلام متفوقة من ثيول-إيني الهلاميات المائية ويعزى إلى فوق " "طبيعة التفاعل بين ثيول وظائف إيني. مقارنة سلسلة البلمرة من النمو PEGDA، ثيول-إيني رد فعل أقل الأكسجين مما يؤدي إلى تثبيط معدل أسرع الهلام. 16،17 ثيول-إيني الهلاميات المائية أيضا أعلى كفاءة البلمرة وخصائص أفضل هلام البيوفيزيائية مقارنة الهلاميات المائية PEGDA سلسلة النمو، 7 ، 18 </ سوب> مما يؤدي إلى تلف الخلايا التي تسببها الأنواع محدودة جذرية خلال بلمرة ضوئية المنشأ.
سابقا، ثيول-إيني الهلاميات المائية التي شكلتها الذراع 4-macromer (PEG4NB) PEG-نوربورنين ومكرر السيستين الببتيد تحتوي على crosslinkers، مثل البروتياز حساسة استخدمت لتغليف الخلايا الببتيدات. 7،18 tunability العليا شبكات هيدروجيل يقدم PEG 3D المكروية مرنة ويمكن السيطرة عليها عن التحقيق في بقاء الخلية والنشاط، في حين أن استخدام البروتيني تراعي تسلسل الببتيد يوفر طريقة خفيفة لاسترداد بنيات الخلية تشكلت بشكل طبيعي داخل الهلاميات المائية. في هذا البروتوكول خطوة نستخدم النمو photopolymerized ثيول-إيني الهلاميات المائية ملفقة باستخدام الذراع 4-PEG-نوربورنين (PEG4NB) وcrosslinker الببتيد كيموتربسين حساسة (CGGY ↓ C) لتغليف الخلايا β MIN6. هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية لدراسة تقنيات تشكيل البقاء، وانتشار كروي من MIN6β-cells في ثيول-إيني الهلاميات المائية. نحن نقدم طريقة لزيادة β خلايا الانتعاش كروي وتوصيف الأجسام الشبه الكروية البيولوجي للشفاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. Macromer وتوليف الببتيد
- تجميع الذراع 4-PEG-نوربورنين (PEG4NB) وphotoinitiator arylphosphanate ليثيوم (LAP) باستخدام بروتوكولات المعمول بها. 18،19
- تجميع مكرر السيستين التي تحتوي على الببتيد كيموتربسين حساسة CGGY ↓ C (السهم يشير إلى موقع كيموتربسين الانقسام) باستخدام معيار الببتيد التوليف المرحلة الصلبة في الميكروويف المزج الببتيد (CEM اكتشف SPS).
- حساب كمية من الراتنج (صالة-أميد الراتنج MBHA) اللازمة على أساس نسبة الإحلال من الراتنج وحجم التوليف. تنتفخ الراتنج في ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) في وعاء التفاعل (RV) لمدة 15 دقيقة.
- إزالة Fmoc-حماية مجموعة من راتنج باستخدام محلول يحتوي على deprotection الببريدين 20٪ و 0.1 M HOBt في DMF. استخدام المعلمات المذكورة في الجدول أدناه للحصول على الميكروويف بمساعدة deprotection-Fmoc (لجميع الأحماض الأمينية Fmoc):
تجميع النطاق 0،1 mmole 0،2 mmole قوة 20 W 50 واط درجة الحرارة 75 ° C 75 ° C مرة 3 دقائق 3 دقائق - بعد deprotection، شطف الراتنج مع DMF وأداء اختبار النينهيدرين لتأكيد إزالة Fmoc (N-تعرض محطة أمين). ينبغي راتنج بدوره الزرقاء بعد 2 دقيقة في 95 ° C.
- بعد نجاح الزوجين، deprotection أول Fmoc-حمض أميني في محطة سي (التوليف يمتد من C-N-محطة ل) في محلول قاعدة المنشط (0.28 M Diisopropylethylamine (DIEA) في DMF) مع المعلمات المذكورة في الجدول أدناه .
تجميع النطاق 0،1 mmole 0،2 mmole قوة 20 W 50 واط * درجة الحرارة 75 ° C 75 ° C الوقت * 5 دقائق 5 دقائق
* للحصول على الكيس وصاحب، استخدم 50 ° C و 10 دقيقة للحد من تروسم. - شطف الراتنج وأداء اختبار النينهيدرين لتأكيد النوعية الانتهاء من توصيل (N-اختفاء محطة أمين). الراتنج ينبغي أن يكون واضحا بعد 5 دقائق عند 95 درجة C. كرر الخطوة اقتران (A.2.d) إذا اختبار النينهيدرين بإرجاع نتيجة إيجابية (اللون الأزرق).
- deprotection كرر (A.2.b الخطوة) واقتران (A.2.d الخطوة) للأحماض الأمينية في تسلسل إضافية تنتهي مع خطوة deprotection النهائي.
- استنزاف RV، وشطف مع راتنج 25 مل من ثنائي كلورو ميثان (DCM). هذه الخطوة هو شطف DMF، وهي قاعدة، وسوف تعيق الانقسام الببتيد.
- إعداد كوكتيل الانقسام عن طريق خلط 250 مالفينول حمض 4،75 في Trifluoroacetic مل (TFA)، 0،125 مل Triisopropylsilane (TIS) و0،125 مل DDH O. 2 غرام
- إضافة حل الانقسام في RV ويلتصق لمدة 30 دقيقة في فرن الميكروويف المزج الببتيد (السلطة = 20 W، درجة الحرارة = 38 درجة مئوية).
- جمع الحل الببتيد في أنبوب الطرد المركزي 50 مل باستخدام متعددة فراغ.
- الببتيد يعجل المشقوق في 40 مل من الأثير، ودوامة أنبوب الطرد المركزي في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لجمع الببتيد.
- استنزاف طاف وكرر الخطوة A.2.k مرتين.
- جمع وتجفيف الببتيد في فراغ.
- تنقية الببتيد باستخدام HPLC وتميز مع مطياف الكتلة.
B. إعداد المواد والتعقيم
- إعداد 20٪ بالوزن PEG4NB الحل في برنامج تلفزيوني، دوامة الخليط حتى يذوب تماما macromer، وتعقيم الحل macromer باستخدام عامل تصفية حقنة. يخزن المحلول المعقم في -20 ° C مأخوذة إعداد (على المدى الطويل تخزين).
- إعداد وتعقيم 2٪ بالوزن photoinitiator (LAP) في حل PBS. يخزن المحلول المعقم في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
- حل الببتيد (CGGYC) في برنامج تلفزيوني، ودوامة الخليط حقنة تصفية حل للتعقيم. قسامة الحل الببتيد وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدام (منع تجميد ذوبان الجليد دورات).
- تحديد ثيول (-SH) التركيز في حل الببتيد المعدة باستخدام كاشف المان في (اتبع بروتوكول الشركة المصنعة). وهذه الخطوة تعطي تركيز الببتيد دقيقة (أي [SH] / 2) ما هو مطلوب لحساب كمية الببتيد لاستخدامها في ثيول-إيني ردود الفعل مزدوجا فوق الصورة.
- إعداد قوالب الهلام عن طريق قطع الجزء العلوي الخروج من المحاقن المعقمة 1 مل القابل للتصرف باستخدام شفرة حلاقة (نصيحة مفتوحة لإزالة هلام). تعقيم الأوتوكلاف بواسطة حقنة قوالب.
- استنادا إلى صياغة هلام المطلوب (ثيول إلى نسبة إيني = 1) وتركيزات زميله الأسهمريال، وحساب الكمية المطلوبة من البوليمر، الببتيد crosslinker، photoinitiator، والحلول المطلوبة العازلة.
C. إعداد خلية
- تتوازن خلية ثقافة المتوسط (الأعلى DMEM الجلوكوز تحتوي على 10٪ الأبقار مصل الجنين؛ للمضادات الحيوية درجة التأثير مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 250 نانوغرام / مل Fungizone؛ و 50 ميكرومتر β المركابتويثانول-)، هانك محلول الملح المتوازن ( HBSS، كاليفورنيا 2 +، المغنيسيوم 2 + مجانية)، والتربسين EDTA-إلى 37 ° C.
- إزالة القوارير التي تحتوي على خلايا β MIN6 من CO 2 الحاضنة ووضع قوارير الصفحي هود في التدفق.
- نضح أوساط استزراع الخلايا من قوارير وشطف الخلية مع HBSS.
- يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام 3 مل من 2X (0.1٪) التربسين EDTA-قوارير واحتضان لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- ملاحظة: استخدام الحل التربسين 2X يسمح التفكك الكامل للMIN6 β-الخلايا في خلية واحدة التعليق.
- بعد الحضانة، والاستفادة من القوارير على سطح الغطاء بلطف لفصل الخلايا تماما. تأكيد انفصال وتفكك الخلايا باستخدام المجهر.
- إضافة حجم مساو من خلية ثقافة المتوسط لتحييد التربسين. مزيج جيد من قبل pipetting حل لطيف، ثم نقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي والكنسي لمدة 5 دقائق في 1،000 دورة في الدقيقة.
- نضح طاف وبلطف اعادة تعليق الخلايا في 4 - 5 مل من وسائل الإعلام والثقافة.
- تحديد كثافة الخلية باستخدام 50٪ العازلة الأزرق التريبان في عدادة الكريات.
D. تصنيع وتغليف هيدروجيل الخليوي
- مرة واحدة في خلايا جاهزة، مزيج (على أساس نسبة 1:1 إلى ثيول إيني) وحدات التخزين المطلوبة من PEG4NB، CGGYC، LAP، حل الخلية، وHBSS في أنبوب microcentrifuge.
- مزيج الحل باستخدام بلطف ماصة للحصول على خليط متجانس وإضافة 25 ميكرولتر من الحل مما أدى إلى قالب حقنة. كشف حقنة لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365نانومتر، 5 ميغاواط / سم 2) لمدة 2 دقيقة.
- بلمرة ضوئية المنشأ التالية، الهلام يغرق في معقمة 24 لوحة جيدا تحتوي على خلية ثقافة المتوسط والهلاميات المائية في احتضان 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- غسل الخلايا الهلاميات المائية لادن في مستنبت الخلايا لمدة 30 دقيقة لشطف الخلايا المرفقة فضفاضة وmacromers الامم المتحدة crosslinked. نقل المواد الهلامية في المتوسط الطازجة.
- تحديث وسائل الإعلام خلية ثقافة كل 2 إلى 3 أيام.
E. الفحص الخلوي الجدوى
ويمكن ملاحظة مغلفة شكل الخلية باستخدام المجهر الضوئي (منذ الهلاميات المائية توليفها شفافة). ويمكن تصور بقاء الخلية وقياس النوعية باستخدام لايف / الميت وتلطيخ باستخدام كاشف AlamarBlue كميا.
E.1. لايف / الميت تلطيخ
- ذوبان الجليد الكواشف تلطيخ لايف / الميت في درجة حرارة الغرفة.
- في أنبوب الكنسي إضافة PBS وفقا لعدد من العينات (ن) ليكون الملون:
- ماصة ميكرولتر من 0،25 AM Calcein و 2 ميكرولتر من EthD-1 لكل 1 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب يحتوي على PBS الكنسي. دوامة الحل لخلط المكونات.
- احتضان الخلايا لادن الهلاميات المائية في حل تلطيخ لايف / الميت (0.5 مل / عينة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري.
- باستخدام ماصة باستور، قم بإزالة محلول الصبغة وشطف العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- وضع العينة على زلة غطاء أو شريحة زجاجية. مراقبة والخلايا الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر.
E.2. AlamarBlue الفحص
- إعداد 10 V / V حل AlamarBlue٪ في مستنبت الخلية.
- إزالة الهلاميات المائية من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام من كل بئر من دون أي اتصال مع هيدروجيل.
- احتضان الخلايا لادن الهلاميات المائية وفارغة (المراقبة السلبية) بشكل جيد في 500 ميكرولتر من حل AlamarBlue 10٪ لمدة 16 ساعة.
- بعد الحضانة، ماصة 200 ميكرولترمن الحل AlamarBlue في طبق بشكل جيد و96 مضان باستخدام مقياس قارئ صفيحة ميكروسكوبية (الإثارة: 560 نانومتر، والانبعاثات: 590 نانومتر).
- أعلى الخلوية النشاط الأيضي يقلل من صبغة لإعطاء القراءة أعلى مضان.
- تأكد من تضمين اثنين على الأقل من الآبار حل Alamarblue 10٪ والفراغات. عند تحليل البيانات، طرح متوسط قيمة فارغة من مضان مضان القراءة من العينات.
ساطة F. كيموتربسين تآكل جل واستعادة الجسم الشبه الكروي
- إعداد 1 ملغ / مل من محلول α-كيموتربسين التربسين خالية في HBBS ومعقمة مرشح الحل.
- احتضان الهلاميات المائية في حل كيموتربسين (500 ميكرولتر لكل هلام) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف حتى يتم تحقيق كامل تآكل هلام.
- لجل سعة 25 ميكرولتر، والوقت لتعرية كاملة تقريبا 5 دقائق.
- وضع لوحة على الجليد لبضع دقائق للحد من نشاطكيموتربسين.
- نقل الحل الخلية في أنبوب 1 مل والطرد المركزي في 300 دورة في الدقيقة، 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إزالة بعناية طاف باستخدام ماصة المراعي و resuspend بلطف الأجسام الشبه الكروية في HBSS.
- نقل الحل إلى استعادة لوحة كروي 24 بشكل جيد ووضع لوحة على الجليد للسماح للالأجسام الشبه الكروية ليستقر.
- لتحليل الحجم والحصول على صور على النقيض من المرحلة الأجسام الشبه الكروية استقر باستخدام مجهر الضوء. تعافى مقياس بأقطار كروي باستخدام برامج مثل نيكون العنصر البرامج أو يماغيج.
G. مصلحة دمغ المصوغات وظيفية من الأجسام الشبه الكروية المستردة
G.1. إفراز الأنسولين الجلوكوز من حفز خلايا الأجسام الشبه الكروية تعافى
- في 24 لوحة جيدا، احتضان المواد الهلامية في 500 ميكرولتر من العازلة 2 مم منخفضة كريبس، قارع الأجراس الجلوكوز (KRB) لمدة 1 ساعة.
- تآكل جل واستعادة الأجسام الشبه الكروية الخلية باستخدام الخطوات F.1 لF.6.
- نضح بعناية طاف دون إجراء أيالاتصال مع الخلية الأجسام الشبه الكروية و resuspend على الأجسام الشبه الكروية في 500 ميكرولتر من 2 مم KRB انخفاض الجلوكوز.
- نقل 100 ميكرولتر من محلول الأجسام الشبه الكروية الخلية إلى أنبوب مل 0.6 و ضعه على الجليد لالكمي ATP داخل الخلايا.
- تقسيم الخلية الحل المتبقية في نصف كروي (في أنابيب microcentrifuge اثنين) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 300 دورة في الدقيقة و 4 ° C.
- الرشفة طاف (تقريبا إلى أسفل) و resuspend النصف الأول من الأجسام الشبه الكروية خلية في 1 مل من 25 مم KRB ارتفاع نسبة الجلوكوز والنصف الثاني في 1 مل من 2 مم KRB انخفاض الجلوكوز.
- ماصة بلطف ونقل محلول يحتوي على الأجسام الشبه الكروية خلية لاستعادة لوحة 24 أيضا. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة عند 37 ° C و 5٪ CO 2.
- بعد الحضانة، ونقل الحل إلى أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على 1،000 دورة في الدقيقة و 4 ° C.
- نقل 500 ميكرولتر من طاف من الأنبوب إلى آخر بالطرد المركزي أنبوب microcentrifuge وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة الأنسولينELISA.
- أداء بروتوكول الأنسولين المصنع ELISA التالي.
G.2. CellTiter بالشبكة الفحص
- معايير ATP: إعداد لمدة 10 ميكرومتر ATP حل وأداء التخفيفات المسلسل للحصول على سلسلة من 8 الحلول القياسية.
- لوحة 96 بيضاء أيضا، إضافة 50 ميكرولتر من حل كروي الخلية (من الخطوة G.1.6) والمعايير.
- إلى كل العينات المحتوية بشكل جيد والمعايير، إضافة 50 ميكرولتر من كاشف بالشبكة CellTiter واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- التالية الحضانة، وقياس عدد من العينات التلألؤ والمعايير باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية ومعايرة العينة باستخدام تركيزات ATP منحنى الانحدار الخطي الناتجة عن المعايير ATP.
- تحديد تركيز ATP في إجمالي العينة وتتكاثر عن طريق العينة عامل تخفيف للحصول على تركيز ATP داخل الخلايا في خلية هيدروجيل لادن واحد.
G.3. تحديد افراز الانسولين
- حساب عموNT من الأنسولين يفرز من الأجسام الشبه الكروية تعافى من خلال اتخاذ نسبة كمية الأنسولين يفرز في المتوسط إلى ارتفاع نسبة الجلوكوز كمية الأنسولين يفرز في المتوسط انخفاض الجلوكوز.
- تطبيع محتوى الأنسولين كميا من الأجسام الشبه الكروية الخلية مع كمية كل من ATP داخل الخلايا من الخلايا الأجسام الشبه الكروية استردادها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأرقام 1-4 نتائج عرض ممثل من أجل البقاء، التغليف، والانتشار، وتشكيل كروي، والانتعاش كروي في ثيول-إيني الهلاميات المائية. الشكل 1 يبين التخطيطي رد فعل (1) بلمرة ضوئية المنشأ ثيول-إيني خطوة النمو باستخدام PEG4NB وCGGYC، و( 2) تآكل كيموتربسين هلام بوساطة الذي يتبع آلية تآكل السطح. أرقام 2 و 3 نتائج موجودة جدوى الحصول عليها باستخدام تلطيخ لايف / الميت ومقايسة AlamarBlue. نلاحظ أن الخلايا انتشرت في PEG4NB-CGGYC الهلاميات المائية حتى في الخلية منخفضة الكثافة التعبئة، مما يدل على cytocompatibilty نظام هيدروجيل ثيول-إيني. الشكل 4 يظهر تباين الطور صور الأجسام الشبه الكروية β خلايا مغلفة واستردادها، فضلا عن توزيع حجم تعافى β خلايا الأجسام الشبه الكروية.
_upload/50081/50081fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
الشكل 1. التخطيطي للنمو خطوة ثيول-إيني مزدوجا فوق الصورة باستخدام تفاعل PEG4NB وCGGYC لتشكيل PEG-الببتيد المتقارن. يمكن أن تتآكل بسرعة الهلاميات المائية عن طريق العلاج كيموتربسين.
الشكل 2. الجدوى الأولية والخلية كروي تشكلت في الهلاميات المائية PEG4NB/CGGYC. (أ) لايف / الميت تم إجراء تلطيخ التالية مباشرة الصور التغليف. (ب) لايف / الميت تلطيخ تنفيذها بعد 10 يوما من الثقافة في المختبر. ممثل مبائر Z-كومة من الصور MIN6 β خلايا مغلفة في 4wt٪ الهلاميات المائية PEG4NB/CGGYC (2 × 10 6 خلية / مل، ومقياس = 100 ميكرون). وقد عرفت بقاء الخلية بأنه النسبة المئوية للخلايا (الأخضر) يعيش أكثر من خلية الإجمالي (الخضراء + الحمراء) العد. (2 × 10 6 خلية / مل، N = 4، يعني ± SD).
الشكل 3. النشاط الأيضي للخلايا β MIN6 قياس بوصفها وظيفة من الوقت عن طريق كاشف AlamarBlue (N = 3، يعني ± SD). MIN6 β خلايا مغلفة في 3wt٪،٪ 4wt والهلاميات المائية 5wt PEG4NB/CGGYC٪ في 2 × 10 6 خلية / مل.
الشكل 4. توصيف الأجسام الشبه الكروية تعافى β خلايا MIN6. تم انتشال الأجسام الشبه الكروية خلية من PEG4NB/CGGYC باستخدام 40 ميكرومتر كيموتربسين بعد 10 يوما من الثقافة في المختبر. (أ) المرحلة المقابل صورة الممثل من الأجسام الشبه الكروية β خلايا مغلفة. (ب) المرحلة المقابل صورة الممثل من الأجسام الشبه الكروية β خلايا استردادها. (ج) توزيع سو بأقطار كروي (كثافة خلية = 1 × 10 7 خلية / مل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول وصف تفاصيل يعرض على تغليف سهلة من الخلايا في ثيول-إيني الهلاميات المائية التي شكلتها خطوة نمو بلمرة ضوئية المنشأ. في حين تم استخدام نسبة 1:1 من متكافئة من نوربورنين إلى المجموعات الوظيفية ثيول في هذا البروتوكول، يمكن تعديل نسبة اعتمادا على التجارب. بالإضافة إلى صياغة صحيحة، فمن المهم للحفاظ على التجانس في الحل قبل البوليمر. على وجه الخصوص، استخدام pipetting لطيف لضمان توزع جيدا أن الخلايا في حل البوليمر قبل وذلك لتجنب تراكمها من الخلايا والاختلاف في خصائص هلام. على الرغم من أن استخدام الوقت البلمرة من 2 دقيقة لليشابك هلام، هلام نقطة لثيول-إيني الهلاميات المائية أقل من 10 ثانية في معظم تركيبات التغليف ذات الصلة الخلية (على سبيل المثال، نقطة هلام لمدة 4٪ بالوزن هيدروجيل PEG4NB/CGGYC هو 7 ± 2 ثانية و 5٪ بالوزن هو 6 ± 1 ثانية). ودبق السريع لهذا النظام بسرعة هيدروجيل تأمين الخلايا في المكان، مما أدى إلى تحسين سلتوزيع لتر في 3D مقارنة مخططات بلمرة ضوئية المنشأ الأخرى التي تأخذ دقائق أو ساعات حتى الوصول إلى نقطة هلام. 7،20
بالإضافة إلى ذلك، تم انتشال β خلايا الأجسام الشبه الكروية شكلت بشكل طبيعي في ثيول-إيني الهلاميات المائية من تآكل جل كيموتربسين بوساطة. قد كيموتربسين، ومع ذلك، هو انزيم التربسين في الأسرة والتركيز العالي أو طويلة فترة حضانة هذا الانزيم يؤثر سلبا خلية خلية التفاعلات أو تعطيل حتى العمارة كروي خلال الانتعاش. من أجل تجنب هذا القيد المحتملة، قد يكون من ركائز crosslinked الهلاميات المائية الأخرى، ويمكن thiolated يزال تآكل جل أن يتحقق عن طريق الانزيمات المناسبة التي لا تسبب الضارة خلية خلية التفاعل.
وعموما، ثيول-إيني الهلاميات المائية توفير بيئة cytocompatible لتعزيز انتشار الخلايا β في 3D. ويمكن استخدام هذا النظام لثقافة ودراسة السلوك الفسيولوجي لمختلف أنواع الخلايا في 3D. وعلاوة على ذلك،هذا النظام يسمح للانتعاش من السهل تشكيل بنيات الخلية داخل المصفوفة هيدروجيل لالأوصاف الوظيفية والبيولوجية كذلك. هذا النظام هيدروجيل متنوعة ويوفر منصة cytocompatible هلام لأنسجة الهندسية المعقدة 3D لتطبيق الطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21EB013717) وIUPUI OVCR (RSFG). المؤلف يشكر السيدة هان شي لمساعدتها التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
