Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Generation og indvinding af β-celle Sfæroider Fra Step-vækst PEG-peptid hydrogeler

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Den følgende protokol giver teknikker til indkapsling af bugspytkirtlen β-celler i trin-vækst PEG-peptid hydrogeler dannet af thiol-foto-klik reaktioner. Dette materiale platform tilbyder ikke kun en cytocompatible mikromiljø for celleindkapsling, men også tillader brugeren kontrolleret, hurtig genopretning af cellestrukturer dannet inden for hydrogeler.

Abstract

Hydrogeler er hydrofile tværbundne polymerer, som giver et tredimensionelt mikromiljø med vævslignende elasticitet og høj permeabilitet til dyrkning af terapeutisk relevante celler eller væv. Hydrogeler fremstillet ud fra poly (ethylenglycol) (PEG)-derivater anvendes i stigende grad til mange forskellige vævsdyrkningsapplikationer, delvis på grund af deres justerbare og cytocompatible egenskaber. I denne protokol, udnyttede vi thiol-step-vækst photopolymerizations at fabrikere PEG-peptid hydrogeler til indkapsling pancreas MIN6 B-celler. Gelerne blev dannet ved 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) makromeren og en chymotrypsin-følsom peptid tværbinder (CGGYC). Den hydrofile og ikke-fouling karakter af PEG har en cytocompatible mikromiljø for celleoverlevelse og proliferation i 3D, mens anvendelsen af chymotrypsin-sensitive peptidsekvens (C GGY ↓ C, pilen angiver enzym spaltningssted, mens terminal cysteeine rester blev tilføjet til thiol-tværbinding) muliggør hurtig genopretning af cellekonstruktioner danner i hydrogelen. Følgende protokol uddyber teknikker til: (1) Indkapsling af MIN6 β-celler i thiol-hydrogeler, (2) Kvalitativ og kvantitativ cellelevedygtighedsassays at bestemme celleoverlevelse og proliferation, (3) Udvinding af celle sfæroider ved hjælp af chymotrypsin-medieret gel erosion, og (4) Strukturel og funktionel analyse af de inddrevne sfæroider.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydrogeler er hydrofile tværbundne polymerer med enestående potentiale som stilladser materialer til reparation og regenerering af væv. 1-3 Den høje vandindhold af hydrogeler muliggør let diffusion af oxygen og udveksling af næringsstoffer og metaboliske produkter, som alle er afgørende for opretholdelse af cellelevedygtighed. Desuden er hydrogeler fremragende bærere til reguleret frigivelse og celle produktionstid på grund af deres høje justerbarhed. 2 Syntetiske hydrogeler, såsom dem fremstillet ud fra poly (ethylenglycol) (PEG) anvendes i stigende grad i vævsdyrkningsapplikationer, hovedsagelig på grund af deres cytocompatibility, vævs- såsom elasticitet og høj justerbarhed i materiale fysiske og mekaniske egenskaber. 4-6

Selv om en almindeligt anvendt hydrogel platform, har undersøgelser vist, at PEG-diacrylat (PEGDA) hydrogeler dannet ved kæde-vækst photopolymerizations har en tendens til skade indkapslede celler During netværk tværbinding og in situ celleindkapsling. 7 Den cellulære skader blev i vid udstrækning tilskrives radikalspecies genereret af fotoinitiator molekyler, som udbreder sig gennem vinylgrupper på PEGDA at tværbinde polymerkæder til hydrogeler. Desværre er disse radikalspecies også forårsage spændinger og cellulære beskadigelse under celleindkapsling, især for radikal-følsomme celler, såsom pancreas-β-celler. 8-10 For at opnå en højere maskestørrelse for bedre diffusion og celleoverlevelse, højere molekylvægte PEGDA anvendes ofte til celleindkapsling. Dette vil imidlertid gøre polymerisationskinetik og forårsager suboptimale gel biofysiske egenskaber. 7,11,12 Ud over de ovennævnte ulemper, er det meget vanskeligt at genvinde cellestrukturer fra PEGDA hydrogeler på grund af heterogenitet og ikke-nedbrydelige natur de tværbundne netværk. Medens protease-sensitive peptider kan inkorporeresi PEG makromer backbone at gøre de ellers inerte PEGDA hydrogeler følsomme for enzymatisk spaltning, ofte konjugeringen anvender dyre reagenser, og de ​​resulterende net stadig indeholder høj grad af heterogenitet på grund af karakteren af kæde-vækst polymerisation. 13-15

For nylig er PEG-peptid-hydrogeler dannet via trin-vækst thiol-en fotopolymerisation vist sig at udvise fordelagtige egenskaber til celleindkapsling i hydrogeler dannet ved kæde-vækst fotopolymerisation. 7 De overlegne geleringsegenskaber kinetik thiol-hydrogeler tilskrives 'klik "karakter reaktion mellem thiol og ØNØ funktionaliteter. Sammenlignet med kæde-vækst polymerisation af PEGDA, er thiol-reaktion mindre oxygen inhiberet, hvilket resulterer i hurtigere gelering rate. 16,17 thiol-hydrogeler også højere polymerisation effektivitet og bedre gel biofysiske egenskaber sammenlignet med kæde-vækst PEGDA hydrogeler, 7 , 18 </ Sup>, som resulterer i begrænset cellulær skader forårsaget af radikale arter i fotopolymerisation.

Tidligere thiol-hydrogeler dannet af 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) makromer og bis-cysteinholdige peptid-tværbindere, såsom protease-sensitive peptider er blevet anvendt til celleindkapsling. 7,18 High justerbarhed af PEG-hydrogel-net tilbyder en fleksibel og styrbar 3D mikromiljø til undersøgelse af celleoverlevelse og-aktivitet, mens anvendelsen af ​​protease-sensitive peptidsekvens tilvejebringer en mild måde til genvinding af cellekonstruktioner dannes naturligt i hydrogeler. I denne protokol anvender vi trinvis vækst fotopolymeriserede thiol-hydrogeler fremstillet under anvendelse af 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) og en chymotrypsin-følsom peptid tværbinder (CGGY ↓ C) til indkapsling af MIN6 β-celler. Denne protokol systematisk uddyber teknikker til at studere overlevelse, spredning og klumpformet dannelse af MIN6β-celler i thiol-hydrogeler. Vi tilvejebringer endvidere metode til β-celle sphæroide genopretning og biologisk karakterisering af genvundne sfæroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A. makromeren og Peptide Synthesis

  1. Syntetisere 4-armet PEG-norbornen (PEG4NB) og fotoinitiator Lithium arylphosphanate (LAP) ved anvendelse af etablerede protokoller. 18,19
  2. Syntetisere bis-cysteinholdige chymotrypsin-sensitive peptid CGGY ↓ C (pil angiver chymotrypsin spaltningssted) ved anvendelse af standard fast-fase peptidsyntese i en mikrobølgeovn peptidsynteseapparat (CEM Discover SPS).
    1. Beregne mængden af ​​harpiks (Rink-amid-MBHA-harpiks) nødvendig baseret på substitution forholdet af harpiksen og syntesen skala. Kvælde harpiksen i dimethylformamid (DMF) i en reaktionsbeholder (RV) i 15 min.
    2. Fjerne Fmoc-beskyttelsesgruppen fra harpiksen under anvendelse af en afbeskyttelse opløsning indeholdende 20% piperidin og 0,1 M HOBt i DMF. Anvende parametrene i nedenstående tabel for mikrobølgeassisteret Fmoc-afbeskyttelse (for alle Fmoc-aminosyrer):
      Synthesis skala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Power 20 W 50 W
      Temperatur 75 ° C 75 ° C
      Tid 3 min 3 min
    3. Efter afbeskyttelse, harpiksen med DMF skylles og udføre Ninhydrin-testen for at bekræfte fjernelse af Fmoc (eksponering for N-terminal amin). Harpiksen skal blive blå efter 2 minutter ved 95 ° C.
    4. Efter vellykket afbeskyttelse, par den første Fmoc-aminosyre ved C-terminalen (syntese løber fra C-til N-terminalen) i en aktivator baseopløsning (0,28 M diisopropylethylamin (DIEA) i DMF) med parametrene i nedenstående tabel .
      Synthesis skala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Power 20 W 50 W
      Temperatur * 75 ° C 75 ° C
      Time * 5 min 5 min

      * For Cyst og Hans, bruge 50 ° C og 10 min for at reducere racemisering.
    5. Resinen skylles og udføre Ninhydrin test til kvalitativ bekræfter afslutningen af ​​koblingen (forsvinden af ​​N-terminal amin). Harpiksen skal være klar efter 5 minutter ved 95 ° C. Gentag koblingstrinnet (A.2.d), hvis Ninhydrin-testen returnerer positivt resultat (blå farve).
    6. Gentag afbeskyttelse (trin A.2.b) og kobling (trin A.2.d) for yderligere aminosyrer i sekvensen slutter med et endeligt afbeskyttelsestrin.
    7. Hæld vandet fra RV, skyl harpiks med 25 ml dichlormethan (DCM). Dette trin er at skylle DMF, hvilket er en base og vil hindre peptidspaltning.
    8. Forbered spaltning cocktail ved at blande 250 mg phenol i 4,75 ml trifluoreddikesyre (TFA), 0,125 ml triisopropylsilan (TIS) og 0,125 ml ddH 2 O.
    9. Tilføj spaltning løsning i RV og kløve i 30 minutter i mikrobølgeovnen peptidsynteseapparat (Power = 20 W; Temperatur = 38 ° C).
    10. Opsaml peptidopløsningen i et 50 ml centrifugerør med vakuummanifold.
    11. Bundfaldet spaltet peptid i 40 ml ether, vortexes røret og centrifugeres ved 3.000 rpm i 5 minutter for at opsamle peptidet.
    12. Hæld supernatanten og gentag trin A.2.k to gange.
    13. Indsamle og tør peptid i vakuum.
    14. Renses peptidet ved anvendelse af HPLC og karakteriseres med massespektrometri.

B. Materiale Forberedelse og Sterilisation

  1. Forbered 20 vægt% PEG4NB opløsning i PBS, vortexes blandingen, indtil den makromere er fuldstændigt opløst, og steriliseres makromeropløsning anvendelse af et sprøjtefilter. Opbevar den steriliserede opløsning ved -20 ° C (udfylder alikvotertil langtidsopbevaring).
  2. Fremstille og sterilisere 2 vægt% fotoinitiator (LAP) opløsning i PBS. Opbevar den steriliserede opløsning ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
  3. Opløsning af peptidet (CGGYC) i PBS, vortexes blandingen og sprøjten filtreres for sterilisering. Alikvot peptidopløsningen og opbevares ved -20 ° C indtil brug (forhindre fryse-tø cykler).
  4. Bestem thiol (-SH) koncentrationen i den fremstillede peptidopløsning med Ellmans reagens (følge fabrikantens protokol). Dette trin vil give nøjagtig peptidkoncentration (dvs. [SH] / 2), der kræves til beregning af peptidet mængde, der skal anvendes i thiol-en foto-klik reaktioner.
  5. Forbered geleringsproblemer forme ved at skære den øverste del ud af sterile 1 ml engangssprøjter med et barberblad (åbne spids til gel fjernelse). Sterilisere sprøjte formene ved autoklavering.
  6. Baseret på den ønskede gelformuleringen (thiol til ene-forhold = 1), og koncentrationer af lager materialer, beregne den nødvendige mængde polymer, peptid tværbinder, fotoinitiator og puffer krævede opløsninger.

C. Cell Preparation

  1. Ækvilibrere celledyrkningsmedium (høj glucose DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum, antibiotika-antimykotisk med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 250 ng / ml Fungizone, og 50 uM β-mercaptoethanol), Hanks balancerede saltopløsning ( HBSS, Ca2 +, Mg2 + frit), og trypsin-EDTA til 37 ° C.
  2. Fjern kolber indeholdende MIN6 β-celler fra CO2-inkubator, og kolberne anbringes i stinkskab med sideværts luftstrømning.
  3. Aspirere celledyrkningsmedier fra kolberne og skylles cellen med HBSS.
  4. Trypsinisér cellerne under anvendelse af 3 ml 2X (0,1%) trypsin-EDTA og inkuberes kolberne i 4 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
    • Bemærk: Anvend 2X trypsinopløsning tillader fuldstændig dissociation af MIN6 β-celler i enkelt cellesuspension.
    </ Li>
  5. Efter inkubation tryk kolberne på overfladen af ​​hætten forsigtigt for at frigøre cellerne. Bekræfte løsgørelse og dissociation af cellerne under anvendelse af et mikroskop.
  6. Tilsættes samme volumen celledyrkningsmedium for at neutralisere trypsin. Bland opløsningen godt ved forsigtig pipettering, derefter overføres blandingen til en kanonisk rør og centrifugeres i 5 minutter ved 1000 rpm.
  7. Aspirer supernatanten og forsigtigt genopslæmmes cellerne i 4-5 ml dyrkningsmedium.
  8. Bestem celletæthed anvendelse af 50% trypanblåt-puffer i et hæmocytometer.

D. Hydrogel Fabrikation og celleindkapsling

  1. Når cellerne er klar, mix (baseret på en 1:1 thiol til ene-forhold) den fornødne mængde af PEG4NB, CGGYC, LAP celleopløsning og HBSS i et mikrocentrifugerør.
  2. Bland opløsningen forsigtigt med en pipette til opnåelse af en homogen blanding, og der tilsættes 25 ul af den resulterende opløsning til en sprøjte støbeform. Udsættes sprøjten for UV-lys (365nm, 5 mW / cm 2) i 2 minutter.
  3. Efter fotopolymerisation, kaster geler i en steril 24-brønds plade indeholdende celledyrkningsmedium og inkuberes hydrogelerne med 37 ° C og 5% CO2.
  4. Vaske celle-holdige hydrogeler i celledyrkningsmedium i 30 minutter for at skylle løst bundne celler og ikke-tværbundne makromerer. Overfør gelerne i frisk medium.
  5. Refresh celledyrkningsmedier hver 2 til 3 dage.

E. cellelevedygtighedsassay

Indkapslet celle morfologi kan observeres ved hjælp af lysmikroskop (idet de syntetiserede hydrogeler er gennemsigtige). Cellelevedygtighed kan visualiseres og måles kvalitativt ved hjælp af Live / Dead farvning og kvantitativt ved hjælp alamarBlue reagens.

E.1. Live / Dead farvning

  1. Tø Levende / Dead farvningsreagenser ved stuetemperatur.
  2. I en kanonisk rør tilsættes PBS i overensstemmelse med det antal prøver (n), der skal farves:
    Samlet volumen PBS = n × 500 pi
  3. Pipette 0,25 ul Calcein AM og 2 pi EthD-1 per 1 ml PBS til den kanoniske rør indeholdende PBS. Vortex løsningen på blande komponenterne.
  4. Inkuber celle-holdige hydrogeler i Live / Dead farvningsopløsning (0,5 ml / prøve) i 1 time ved stuetemperatur på en orbital omryster.
  5. Under anvendelse af en pasteur-pipette, fjerne farveopløsningen og skylles derefter to gange med PBS.
  6. Anbring prøven på en dækstrimmel eller objektglas. Iagttag og image celler ved hjælp af en konfokal mikroskop.

E.2. AlamarBlue Assay

  1. Fremstilling af 10 vol / vol% alamarBlue opløsning i celledyrkningsmedium.
  2. Fjern hydrogeler fra inkubatoren og aspirere mediet ud af hver brønd uden at gøre nogen kontakt med hydrogel.
  3. Inkuber celle-holdige hydrogeler og en tom brønd (negativ kontrol) i 500 pi 10% alamarBlue opløsning i 16 timer.
  4. Efter inkubation pipette 200 piDen alamarBlue opløsning i en plade med 96 brønde og måle fluorescens under anvendelse af en mikropladelæser (excitation: 560 nm, emission: 590 nm).
    • Højere cellulære metaboliske aktivitet reducerer farvestof til opnåelse af højere fluorescensaflæsning.
    • Vær sikker på at inkludere mindst to brønde i 10% alamarBlue opløsning som blanks. Ved analyse af data, trække den midlede blank fluorescens værdi fra den fluorescensaflæsning af prøverne.

F. Chymotrypsin Formidlet Gel Erosion og klumpformet Recovery

  1. Fremstilling af 1 mg / ml trypsin-free α-chymotrypsin opløsning i HBBS og sterilt filtreres.
  2. Inkuber hydrogeler i chymotrypsin opløsning (500 ul til hver gel) ved stuetemperatur under forsigtig omrystning, indtil fuldstændig gel erosion opnås.
    • For en 25 ul gel, er tiden til fuldstændig erosion ca 5 min.
  3. Pladen anbringes på is i et par minutter for at reducere aktiviteten afchymotrypsin.
  4. Overfør celleopløsning i 1 ml rør og centrifugeres ved 300 rpm, 4 ° C i 2 min.
  5. Omhyggeligt fjerne supernatanten under anvendelse af en græsgang pipette og forsigtigt resuspenderes sfæroiderne i HBSS.
  6. Overfør det udvundne kugleformet opløsning til en 24-brønds plade og placere pladen på is for at tillade sfæroiderne at bundfælde sig.
  7. For størrelsesanalyse, erhverver fasekontrast billeder af de bundfældede sfæroider ved hjælp af et lysmikroskop. Foranstaltning inddrives sfæroide diametre ved hjælp af software som f.eks Nikon Element software eller ImageJ.

G. Funktionel analyse af Gendannede Sfæroider

G.1. Glucose stimuleret insulinsekretion fra de gendannede celle sfæroider

  1. I en 24-brønds plade, inkuberes gelerne i 500 pi 2 mM lav glucose Kantsten-Ringer-buffer (KRB) i 1 time.
  2. Erode gelen og inddrive celle sfæroider med trin F.1 til F.6.
  3. Aspirer supernatanten forsigtigt, uden at nogenkontakt med cellen sfæroider og resuspender sfæroiderne i 500 pi 2 mM lav glucose KRB.
  4. Overfør 100 ul celler sfæroider opløsning til en 0,6 ml rør og anbringes på is i intracellulært ATP kvantificering.
  5. Splitter den anden celle kugleformet opløsning i halvdelen (i to mikrocentrifugerør) og centrifugeres i 2 minutter ved 300 rpm og 4 ° C.
  6. Aspirer supernatanten (næsten til bunden) og resuspender første halvdel af celle sfæroider i 1 ml 25 mM højglucose KRB og anden halvdel i 1 ml 2 mM lav glucose KRB.
  7. Forsigtigt pipette og overføres opløsningen indeholdende genvundet celle sphæroider til en 24-brønds plade. Inkubér pladen i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2.
  8. Efter inkubation af opløsningen overføres til et mikrocentrifugerør og centrifugeres i 2 minutter ved 1.000 rpm og 4 ° C.
  9. Overfør 500 gi af supernatanten fra den centrifugerede rør til et andet mikrocentrifugerør, og opbevar ved 4 ° C i insulinELISA.
  10. Udfør insulin ELISA efter fabrikantens protokol.

G.2. CellTiter Glo Assay

  1. ATP-standarder: Forbered en 10 uM ATP-opløsning og udføre seriefortyndinger at opnå en serie af 8 standardløsninger.
  2. Til en hvid plade med 96 brønde, 50 ul celle klumpformet opløsning (fra trin G.1.6) og standarder tilsættes.
  3. Til hver brønd indeholdende prøver og standarder, 50 pi CellTiter Glo reagens tilsættes og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
  4. Efter inkubering, mål luminescens optælling af de prøver og standarder ved anvendelse af en mikropladeaflæser og kalibrere prøve ATP-koncentrationer ved anvendelse af en lineær regressionskurve frembragt af ATP-standarder.
  5. Bestemme den totale ATP-koncentration i prøven og multiplicere med prøven fortyndingsfaktoren for at få den intracellulære ATP-koncentration i en celle-laden hydrogel.

G.3. Bestem insulinsekretion

  1. Beregne Amount af insulin secerneret fra de udvundne sfæroider ved at tage forholdet af mængden af ​​insulin udskilt i høj glucose medium til mængden af ​​insulin udskilt i lav glucose-medium.
  2. Normalisere kvantificerede insulin indholdet af celle sfæroider med respektive mængde af intracellulært ATP af de gendannede celle sfæroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-4 viser repræsentative resultater for indkapsling, overlevelse, proliferation, kugleformet dannelse og sfæroide opsving i thiol-hydrogeler. Figur 1 viser reaktionen skematisk (1) trin-vækst thiol-en fotopolymerisation ved hjælp PEG4NB og CGGYC, og ( 2) chymotrypsin medieret gel erosion, der følger en overfladeerosion mekanisme. figur 2 og 3 foreliggende levedygtighed opnåede resultater med Live / Dead-farvning og alamarBlue assay. Vi observerer, at celler prolifererede i PEG4NB-CGGYC hydrogeler selv ved lave celle pakningstæthed, der angiver cytocompatibilty af thiol-en hydrogel system. Figur 4 viser fasekontrast billeder af indkapslede og genvundet β-celle sfæroider, såvel som størrelsesfordelingen af genvundet β-celle sfæroider.

_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
Fig. 1. Skematisk af trin-vækst thiol-en billede-på reaktion under anvendelse PEG4NB og CGGYC til dannelse af PEG-peptid-konjugat. Hydrogeler kan eroderes hurtigt ved chymotrypsin behandling.

Figur 2
Figur 2. Initial levedygtighed og celle klumpformet dannet i PEG4NB/CGGYC hydrogeler. (A) Live / Dead farvning blev udført umiddelbart efter foto-indkapsling. (B) Live / Dead-farvning udført efter 10 dages in vitro-dyrkning. Repræsentative konfokale z-stack billeder af MIN6 β-celler indkapslet i 4wt% PEG4NB/CGGYC hydrogeler (2 x 10 6 celler / ml, målestok = 100 gm). Cellelevedygtighed blev defineret som procentdelen af ​​levende (grøn) celler end den samlede celle (grøn + rød) tæller. (2 x 10 6 celler / ml, N = 4, middel ± SD).

Figur 3
Figur 3. Metaboliske aktivitet af MIN6 β-celler målt som en funktion af tid ved alamarBlue reagens (N = 3, middelværdi ± standardafvigelse). MIN6 β-celler indkapslet i 3wt%, 4wt% og 5 vægt% PEG4NB/CGGYC hydrogeler ved 2 × 10 6 celler / ml.

Figur 4
Fig. 4. Karakterisering af genvundne MIN6 β-celle sfæroider. Celle sfæroider blev udvundet fra PEG4NB/CGGYC anvendelse af 40 uM chymotrypsin efter 10 dages in vitro-dyrkning. (A) repræsentant fase kontrast billede af indkapslede β-celle sfæroider. (B) repræsentant fasekontrast billede af genvundne β-celle sfæroider. (C) Distribution of sfæroide diametre (Cell density = 1 × 10 7 celler / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den beskrevne protokol præsenterer oplysninger om nem indkapsling af celler i thiol-hydrogeler dannet ved trin-vækst fotopolymerisation. Mens et støkiometrisk forhold på 1:1 af norbornen til thiol-funktionelle grupper blev anvendt i denne protokol, kan forholdet justeres afhængigt af eksperimenterne. Foruden en korrekt formulering, er det vigtigt at opretholde homogenitet i præ-polymeropløsningen. Især ved anvendelse forsigtig pipettering at sikre, at cellerne er godt fordelt i den præ-polymeropløsningen for at undgå sammenklumpning af celler og variation i gelegenskaber. Selv om en polymeriseringstid på 2 min blev anvendt til gel tværbinding, gelen punkt for thiol-hydrogeler er mindre end 10 sekunder i de fleste celleindkapsling-relevante formuleringer (f.eks gelpunkt for 4 vægt% PEG4NB/CGGYC hydrogel er 7 ± 2 sekund og 5 vægt% er 6 ± 1 sekunder). Den hurtige gelering af denne hydrogel systemet hurtigt låser cellerne på plads, hvilket resulterer i bedre cell fordeling i 3D i forhold til andre fotopolymerisationsinitiatorer ordninger, der tager minutter eller timer for at nå gelpunkt. 7,20

Derudover blev β-celle sfæroider naturligt dannet i thiol-hydrogeler udvundet ved chymotrypsin-medieret gel erosion. Chymotrypsin er imidlertid et enzym i trypsin familien og høj koncentration eller lang inkubationstid på dette enzym kan indvirke negativt på celle-celle interaktioner eller endda forstyrre sphæroide arkitektur under restitution. For at undgå denne potentielle begrænsning kan hydrogeler tværbindes ved andre thiolerede substrater og gel erosion kan stadig opnås med egnede enzymer, som ikke forårsager skadelige celle-celle-interaktion.

Samlet, thiol-hydrogeler tilvejebringe en cytocompatible miljø til fremme af proliferation af β-celler i 3D. Dette system kan anvendes til kultur og undersøge den fysiologiske adfærd af forskellige celletyper i 3D. EndvidereDette system giver mulighed for facile genvinding af cellekonstruktioner dannet inde i hydrogelmatrixen for yderligere funktionelle og biologiske karakterisering. Denne forskelligartede og cytocompatible hydrogel system giver gel platform for engineering komplekse 3D væv til regenerativ medicin ansøgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette projekt blev finansieret af NIH (R21EB013717) og IUPUI OVCR (RSFG). Forfatteren takker Ms Han Shih for hendes teknisk bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
  2. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
  3. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
  4. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
  5. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
  6. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
  7. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
  8. Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
  9. Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
  10. Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
  11. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
  12. Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
  13. Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
  14. Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
  15. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
  16. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
  17. Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
  18. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  19. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
  20. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
Generation og indvinding af β-celle Sfæroider Fra Step-vækst PEG-peptid hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter