Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.

Abstract

Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren die een driedimensionale micro met weefsel-achtige elasticiteit en hoge permeabiliteit voor het kweken van therapeutisch relevante cellen of weefsels te verschaffen. Hydrogelen bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) derivaten worden steeds meer gebruikt voor een verscheidenheid van tissue engineering toepassingen, mede dankzij hun afstembare en cytocompatible eigenschappen. In dit protocol, gebruikten we thiol-stap-groei photopolymerizations aan PEG-peptide hydrogels fabriceren voor het inkapselen pancreas MIN6 b-cellen. De gels werden gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGYC). De hydrofiele en aangroeiloze aard van PEG biedt cytocompatible micromilieu voor celoverleving en proliferatie in 3D, terwijl het gebruik van chymotrypsine-gevoelige peptidesequentie (C GGY ↓ C, pijl enzym klievingsplaats, terwijl klem cysteeine residuen werden toegevoegd voor thiol-crosslinking) maakt snel herstel van celpreparaten vormt binnen de hydrogel. De volgende protocol uitgewerkt technieken: (1) inkapseling van MIN6 β-cellen in thiol-hydrogels, (2) Kwalitatieve en kwantitatieve cellevensvatbaarheidsassays bepalen celoverleving en proliferatie (3) Herstel van cel Steroiden met chymotrypsine-gemedieerde gel erosie, en (4) Structurele en functionele analyse van de gerecupereerde sferoïden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren uitzonderlijk potentieel steigers materialen voor reparatie en regenererende weefsels. 1-3 De hoge watergehalte van hydrogels maakt eenvoudige diffusie van zuurstof en uitwisseling van voedingsstoffen en cellulaire metabole producten, die cruciaal zijn voor handhaving van cellevensvatbaarheid. Bovendien hydrogelen uitstekende dragers voor gecontroleerde afgifte en cel productietijd wegens hun hoge tunability. Twee synthetische hydrogels zoals die bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) worden steeds meer gebruikt in tissue engineering toepassingen, voornamelijk vanwege hun cytocompatibility, weefsel- zoals elasticiteit en hoge tunability in materiaal fysische en mechanische eigenschappen. 4-6

Hoewel een veelgebruikte hydrogel-platform, hebben studies aangetoond dat PEG-diacrylaat (PEGDA) hydrogelen gevormd door ketting-groei photopolymerizations de neiging tot schade ingekapseld cellen Duri hebbenng netwerk en verknoping in situ cel inkapseling. 7 De celschade werd grotendeels toegeschreven aan radicalen gegenereerd door de foto-initiator moleculen, die door de vinylgroepen aan PEGDA propageren verknopen polymeerketens in hydrogels. Helaas zijn deze radicalen veroorzaken ook stress en cellulaire beschadiging tijdens cel inkapseling, vooral voor radicaal-gevoelige cellen zoals pancreatische β-cellen. 8-10 Om een hogere maaswijdte verkrijgen betere verspreiding en celoverleving, hogere molecuulgewichten PEGDA worden vaak gebruikt voor cel inkapseling. Dit is echter afbreuk polymerisatiekinetiek en veroorzaakt suboptimale gel biofysische eigenschappen. 7,11,12 Naast de bovengenoemde nadelen, is het zeer moeilijk om celstructuren herstellen van PEGDA hydrogels door de heterogeniteit en niet-afbreekbare aard de verknoopte netwerken. Terwijl protease-gevoelige peptiden kunnen worden opgenomenPEG macromeer in de ruggengraat anders inert PEGDA hydrogels gevoelig voor enzymatische splitsing maken, de conjugatie gebruikt vaak dure reagentia en de resulterende netwerken bevatten nog aanzienlijke heterogeniteit vanwege de aard van ketting-groei polymerisatie. 13-15

Onlangs hebben PEG-peptide hydrogelen gevormd via stap-groei thiol-fotopolymerisatie aangetoond preferentiële eigenschappen voor cel inkapseling vertonen dan hydrogels gevormd door chain groei fotopolymerisatie. 7 De superieure gelering kinetiek van thiol-hydrogels wordt toegeschreven aan de 'click 'aard van de reactie tussen thiol en buteen functionaliteiten. In vergelijking met ketting-groei polymerisatie van PEGDA, thiol-reactie is minder zuurstof geremd wat resulteert in een snellere gelering tarief. 16,17 thiol-hydrogels ook hogere polymerisatie efficiëntie en een betere gel biofysische eigenschappen in vergelijking met ketting-groei PEGDA hydrogels, 7 hebben , 18 </ Sup> wat resulteert in beperkte cellulaire schade veroorzaakt door radicalen tijdens fotopolymerisatie.

Voorheen thiol-hydrogelen gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en bis-cysteine ​​bevattende peptide crosslinkers, zoals protease-gevoelige peptiden zijn gebruikt voor cel inkapseling. 7,18 High tunability van PEG hydrogel netwerken biedt flexibel en controleerbaar 3D micro-omgeving voor onderzoek celoverleving en activiteit, terwijl het gebruik van protease-gevoelige peptide sequentie is een mild middel voor het terugwinnen van celpreparaten natuurlijk gevormd in hydrogels. In dit protocol gebruiken we stap-groei photopolymerized thiol-hydrogelen gefabriceerd met 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGY ↓ C) voor het inkapselen van MIN6 β-cellen. Dit protocol uitgewerkt systematisch technieken voor het bestuderen van de overleving, proliferatie en bolvormige formatie van MIN6β-cellen in thiol-hydrogels. We Verder dient werkwijze voor β-cel sferoïde herstel en biologische karakterisering van teruggewonnen sferoïden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A. macromeer en Peptide Synthesis

  1. Synthetiseren 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) en foto-initiator Lithium arylphosphanate (LAP) met behulp van vastgestelde protocollen. 18,19
  2. Synthetiseren bis-cysteine ​​bevattende chymotrypsine-gevoelige peptide CGGY ↓ C (pijl geeft chymotrypsine splitsingsplaats) onder toepassing van standaard vaste fase peptide synthese in een magnetron peptide synthesizer (CEM Discover SPS).
    1. Bereken de hoeveelheid hars (Rink-amide MBHA hars) nodig gebaseerd op de vervanging verhouding van de hars en de synthese schaal. Zwellen de hars in dimethylformamide (DMF) in een reactievat (RV) gedurende 15 minuten.
    2. Verwijder Fmoc-beschermende groep van de hars met een oplossing die ontscherming 20% ​​piperidine en 0,1 M HOBt in DMF. Gebruik de parameters in de tabel voor microgolven Fmoc-ontscherming (voor Fmoc-aminozuren):
      Synthese schaal 0,1 mmol 0,2 mmol
      Vermogen 20 W 50 W
      Temperatuur 75 ° C 75 ° C
      Tijd 3 min 3 min
    3. Na ontscherming, spoel de hars met DMF en voer ninhydrinetest de verwijdering van Fmoc (blootstelling van N-eindstandige amine) bevestigen. Hars moet blauw wordt na 2 min bij 95 ° C.
    4. Na succesvolle ontscherming, paar eerste Fmoc-aminozuur op het C-terminus (synthese loopt van C-tot N-terminus) in een activator base-oplossing (0,28 M Diisopropylethylamine (DIEA) in DMF) met de parameters in de onderstaande tabel .
      Synthese schaal 0,1 mmol 0,2 mmol
      Vermogen 20 W 50 W
      Temperatuur * 75 ° C 75 ° C
      Tijd * 5 min 5 min

      * Voor Cyste en Zijn, gebruik 50 ° C en 10 min naar racemisatie te verminderen.
    5. Spoel de hars en voer ninhydrinetest kwalitatief bevestiging van de voltooiing van de koppeling (verdwijning van N-eindstandige amine). Hars moet duidelijk na 5 min bij 95 ° C. Herhaal koppelingsstap (A.2.d) als Ninhydrin test keert positief resultaat (blauwe kleur).
    6. Herhaal deprotectie (stap A.2.b) en koppeling (stap A.2.d) voor aanvullende aminozuren in de sequentie eindigend met een laatste ontschermingsstap.
    7. Afvoer van de RV, spoel hars met 25 ml dichloormethaan (DCM). Deze stap is te spoelen DMF, een basis en zal belemmeren peptide splitsing.
    8. Bereid decollete cocktail door het mengen van 250 mg fenol in 4,75 ml trifluorazijnzuur (TFA), 0,125 ml triisopropylsilaan (TIS) en 0,125 ml ddH 2 O.
    9. Voeg splitsing oplossing in de RV en splitsen gedurende 30 minuten in de magnetron peptide synthesizer (Power = 20 W; Temperatuur = 38 ° C).
    10. Verzamel de peptide-oplossing in een 50 ml centrifugebuis met vacuüm mondstuk.
    11. Gesplitste peptide neerslag in 40 ml ether, de vortex en centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 5 minuten om de peptide te verzamelen.
    12. Giet het supernatant en herhaal stap A.2.k tweemaal.
    13. Verzamel en droog peptide in vacuüm.
    14. Zuiver het peptide met HPLC en gekenmerkt met massaspectrometrie.

B. Materiaal Voorbereiding en sterilisatie

  1. Bereid 20 gew% oplossing in PBS PEG4NB, vortex het mengsel tot het macromeer volledig is opgelost en steriliseer het macromeer behulp van een spuit filter. Sla de gesteriliseerde oplossing bij -20 ° C (aliquotsvoor langdurige opslag).
  2. Bereiden en steriliseren 2 gew% fotoinitiator (LAP) oplossing in PBS. Bewaar de gesteriliseerde oplossing bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
  3. Los het peptide (CGGYC) in PBS, vortex het mengsel en de oplossing spuitfilter gesteriliseerd. Aliquot de peptide oplossing en bij -20 ° C tot gebruik (voorkomen vries-dooi cycli).
  4. Bepaal thiol (-SH) concentratie in de bereide oplossing met peptide Ellman's reagens (aanwijzingen van de fabrikant protocol). Deze stap geeft accurate peptide concentratie (bijv. [SH] / 2) die nodig is voor de berekening van het peptide te gebruiken hoeveelheid in thiol-een foto-click reacties.
  5. Bereid gelering mallen door het snijden van het bovenste gedeelte af van steriele 1 ml wegwerpspuiten met behulp van een scheermesje (open tip voor gel verwijderen). Steriliseer de spuit matrijzen autoclaaf.
  6. Gebaseerd op de gewenste gelformulering (thiol om buteen ratio = 1) en concentraties stock matematerialen Bereken het vereiste volume polymeer, peptide crosslinker, fotoinitiator en vereist bufferoplossingen.

C. Bereiding Cell

  1. Equilibreren celkweekmedium (hoog glucose DMEM dat 10% foetaal bovine serum, antibiotica antimycoticum met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 250 ng / ml Fungizone en 50 uM β-mercaptoethanol) balanced salt Hank's oplossing ( HBSS, Ca2 +, Mg2 + vrij) en trypsine-EDTA tot 37 ° C.
  2. Verwijder kolven met MIN6 β-cellen van CO 2 incubator en zet de maatkolven in de laminaire stroming kap.
  3. Zuig celcultuurmedia uit de kolven en spoel de cel met HBSS.
  4. Trypsinize de cellen met 3 ml 2X (0,1%) trypsine-EDTA en de kolven gedurende 4 min incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
    • Opmerking: Gebruik 2X trypsine-oplossing maakt het mogelijk volledige dissociatie van MIN6 β-cellen in enkele celsuspensie.
    </ Li>
  5. Na incubatie werden de kolven voorzichtig op het oppervlak van de kap volledig verwijderen van de cellen. Bevestig de onthechting en dissociatie van de cellen met behulp van een microscoop.
  6. Voeg gelijke volume van het celkweekmedium de trypsine te neutraliseren. Meng de oplossing door voorzichtig pipetteren en breng het mengsel op een canonieke en centrifugeer gedurende 5 min bij 1000 rpm.
  7. Zuig het supernatant en voorzichtig de cellen opnieuw te suspenderen in 4 - 5 ml van de cultuur media.
  8. Bepaal celdichtheid met 50% Trypan blue buffer in een hemocytometer.

D. Hydrogel Fabricage en Cell Encapsulation

  1. Zodra de cellen klaar zijn, mix (op basis van een 1:1 thiol aan ONO-verhouding) de vereiste hoeveelheden PEG4NB, CGGYC, LAP, cel-oplossing, en HBSS in een microcentrifuge buis.
  2. Meng de oplossing voorzichtig met een pipet een homogeen mengsel en 25 pl van de verkregen oplossing tot een spuit vorm toevoegen. Maak de spuit aan UV-licht (365nm, 5 mW / cm 2) gedurende 2 minuten.
  3. Na fotopolymerisatie duik gels in een steriele 24 wells plaat met celcultuurmedium en hydrogels incuberen in 37 ° C en 5% CO2.
  4. Was de cel-beladen hydrogelen in celkweekmedium gedurende 30 minuten af ​​te spoelen losjes bevestigde cellen en niet-verknoopt macromeren. Breng de gel in vers medium.
  5. Vernieuwen celcultuurmedia om de 2 tot 3 dagen.

E. levensvatbaarheid van de cellen Assay

Ingekapselde celmorfologie kan worden waargenomen met behulp van de lichtmicroscoop (sinds de gesynthetiseerde hydrogels transparant zijn). Levensvatbaarheid van de cellen kunnen worden gevisualiseerd en kwalitatief gemeten met behulp van Live / Dead kleuring en kwantitatief met behulp van AlamarBlue reagens.

E.1. Live / Dead vlekken

  1. Ontdooi Live / Dead kleurstoffen bij kamertemperatuur.
  2. In een canonieke buis toe PBS volgens het aantal samples (n) te worden gemerkt:
    Totaal volume PBS = n × 500 pi
  3. Pipetteer 0,25 pl Calcein AM en 2 pl EthD-1 per 1 ml PBS met de canonieke buis met PBS. Vortex de oplossing om de componenten te mengen.
  4. Incubeer cellen beladen hydrogels in Live / Dead kleuroplossing (0,5 ml / monster) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat.
  5. Met een Pasteur pipet verwijderen kleurstofoplossing en tweemaal spoelen van het monster met PBS.
  6. Plaats monster op een dekglaasje of objectglaasje. Houd u aan het beeld cellen met behulp van een confocale microscoop.

E.2. AlamarBlue Assay

  1. Bereid 10 v / v% AlamarBlue oplossing in celkweekmedium.
  2. Verwijder hydrogelen van incubator en zuig de media uit elk putje zonder enig contact met de hydrogel.
  3. Incubeer cellen beladen hydrogels en een lege put (negatieve controle) in 500 ui 10% AlamarBlue oplossing gedurende 16 uur.
  4. Na incubatie pipet 200 piAlamarBlue van de oplossing in een plaat met 96 putjes en meet fluorescentie met behulp van een microplaatlezer (excitatie: 560 nm, emissie: 590 nm).
    • Hogere cellulaire metabole activiteit vermindert de kleurstof hogere fluorescentie lezing te geven.
    • Zorg ervoor dat ten minste twee putjes van 10% AlamarBlue oplossing blanks zijn. Bij het analyseren van de data, trekt de gemiddelde fluorescentie blanco waarde van de fluorescentie lezing van de monsters.

F. Chymotrypsine gemedieerde Gel Erosie en Spheroid Recovery

  1. Bereid 1 mg / ml trypsine-vrije α-chymotrypsine oplossing HBBS en steriele filter de oplossing.
  2. Incubeer hydrogels in chymotrypsine oplossing (500 ul per gel) bij kamertemperatuur onder zacht schudden totdat volledige gel erosie bereikt.
    • Voor een 25 pi gel, de tijd voor volledige erosie ongeveer 5 minuten.
  3. Plaats de plaat op ijs gedurende enkele minuten om de activiteit van verminderingchymotrypsine.
  4. Breng de celoplossing in 1 ml en centrifugeer bij 300 rpm, 4 ° C gedurende 2 minuten.
  5. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een weiland pipet en voorzichtig resuspendeer de sferoïden in HBSS.
  6. Breng de herstelde bolvormige oplossing voor een 24-well plaat en plaats de plaat op ijs, zodat de bolletjes om te settelen.
  7. Voor maat-analyse, verwerven fasecontrast beelden van de vaste sferoïden met behulp van een lichtmicroscoop. Meet hersteld sferoïde diameters met behulp van software zoals Nikon Element software of ImageJ.

G. functionele test van Hersteld sferoïden

G.1. Glucose gestimuleerde insuline secretie van de herstelde cel sferoïden

  1. In een plaat met 24 putjes, incubeer de gels in 500 ui 2 mM glucose laag trottoirbanden-Ringer buffer (KRB) gedurende 1 uur.
  2. Eroderen de gel en herstellen cel sferoïden met stappen F.1 te F.6.
  3. Zorgvuldig Zuig het supernatans zonder enigecontact met de cellen en resuspendeer de sferoïden sferoïden in 500 ui 2 mM glucose laag KRB.
  4. Breng 100 pl van cel sferoïden oplossing voor een 0,6 ml buis en plaats het op het ijs voor intracellulaire ATP kwantificering.
  5. Splitsen de resterende cel sferoïde oplossing helft (in twee microcentrifugebuizen) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 300 rpm en 4 ° C.
  6. Zuig supernatant (bijna tot op de bodem) en resuspendeer de eerste helft van de cel sferoïden in 1 ml 25 mM hoge glucose KRB en de tweede helft in 1 ml van 2 mM lage glucose KRB.
  7. Voorzichtig pipetteren en breng de oplossing die herstelde cel sferoïden om een ​​24-well plaat. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  8. Na incubatie, breng de oplossing een microcentrifuge en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1000 rpm en 4 ° C.
  9. Breng 500 pi van het supernatant van gecentrifugeerde buis naar een andere microcentrifugebuis en bewaar bij 4 ° C voor insulineELISA.
  10. Voer insuline ELISA volgende fabrikant protocol.

G.2. CellTiter Glo Assay

  1. ATP normen: Bereid een 10 uM ATP oplossing en seriële verdunningen een reeks van 8 standaardoplossingen voeren.
  2. Om een ​​witte plaat met 96 putjes, voeg 50 ul van de cel sferoïde (uit stap G.1.6) en normen.
  3. Aan elk putje bevattende monsters en standaarden, voeg 50 ul CellTiter Glo reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  4. Na incubatie meten van de luminescentie aantal monsters en standaarden met een microplaatlezer en kalibreren monster ATP-concentraties met een lineaire regressie kromme gegenereerd door de ATP normen.
  5. Bepaal de totale ATP-concentratie in de steekproef en vermenigvuldig dit met het monster verdunningsfactor van de intracellulaire ATP-concentratie te krijgen in een cel-beladen hydrogel.

G.3. Bepaal insulinesecretie

  1. Bereken de Amount van insuline afgescheiden van de gewonnen sferoïden door de verhouding van de hoeveelheid insuline afgescheiden in hoog glucose medium te hoeveelheid insuline afgescheiden in laag glucose medium.
  2. Normaliseren gekwantificeerde insulinegehalte van cel Steroiden met respectieve hoeveelheid intracellulair ATP van de herstelde cel sferoïden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuren 1-4 tonen representatieve resultaten voor inkapseling, overleving, proliferatie, vorming sferoïdaal en sferoïde herstel van thiol-hydrogels. Figuur 1 toont schematisch de reactie van (1) stap-groei thiol-fotopolymerisatie met PEG4NB en CGGYC en ( 2) chymotrypsine gemedieerde gel erosie die een erosie mechanisme volgt. figuren 2 en 3 aanwezig levensvatbaarheid resultaten met Live / Dead kleuring en AlamarBlue assay. We merken op dat cellen vermeerderd in PEG4NB-CGGYC hydrogels zelfs bij lage cel pakkingsdichtheid, waarin de cytocompatibilty van thiol-hydrogelenysteem. Figuur 4 toont beelden van fasecontrast ingekapseld en teruggewonnen β-cel Steroiden, alsmede de grootteverdeling van de teruggewonnen β-cel sferoïden.

_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schema van de stap-groei thiol-een foto-klik reactie met gebruikmaking van PEG4NB en CGGYC aan PEG-peptide conjugaat te vormen. Hydrogelen snel aangetast door chymotrypsine behandeling.

Figuur 2
Figuur 2. Eerste levensvatbaarheid en cel sferoïde gevormd in PEG4NB/CGGYC hydrogelen. (A) Live / Dead kleuring werd uitgevoerd onmiddellijk na de foto-inkapseling. (B) Live / Dead kleuring na 10 dagen in vitro kweek. Representatieve confocale z-stack beelden van MIN6 β-cellen ingekapseld in 4 gew% PEG4NB/CGGYC hydrogels (2 x 10 6 cellen / ml, schaal = 100 pm). Cellevensvatbaarheid werd gedefinieerd als het percentage levende (groene) cellen over de gehele cel (groen + rood) tellen. (2 x 10 6 cellen / ml, N = 4, gemiddelde ± SD).

Figuur 3
Figuur 3. Metabole activiteit van MIN6 β-cellen gemeten als functie van de tijd door AlamarBlue reagens (N = 3, gemiddelde ± SD). MIN6 β-cellen ingekapseld in 3 gew%, 4 gew% en 5 gew% PEG4NB/CGGYC hydrogels bij 2 x 10 6 cellen / ml.

Figuur 4
Figuur 4. Karakterisering van teruggewonnen MIN6 β-cel sferoïden. Cell sferoïden werden uit PEG4NB/CGGYC met 40 uM chymotrypsine na 10 dagen in vitro kweek. (A) Representative fasecontrastbeeld van ingekapseld β-cel sferoïden. (B) Vertegenwoordiger fasecontrastbeeld van teruggewonnen β-cel sferoïden. (C) Distributie of sferoïde diameters (Celdichtheid = 1 x 10 7 cellen / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De beschreven protocol bevat details over eenvoudige inkapseling van cellen in thiol-hydrogelen gevormd door stap-groei fotopolymerisatie. Terwijl een stoichiometrische verhouding van 1:1 van norborneen met thiol functionele groepen werd in dit protocol kan de verhouding worden aangepast afhankelijk van de experimenten. Naast een juiste formulering is belangrijk om homogeniteit in de pre-polymeeroplossing. Met name het gebruik zacht pipetteren opdat cellen zijn goed verdeeld in de pre-polymeeroplossing om klonteren voorkomen van cel en variatie in geleigenschappen. Hoewel een polymerisatieduur van 2 min werd gebruikt voor gel verknoping het gelpunt van thiol-hydrogels minder dan 10 seconden in de meeste cel inkapseling relevante preparaten (bijvoorbeeld gel punt voor 4 gew% PEG4NB/CGGYC hydrogel 7 ± 2 sec en 5 gew% is 6 ± 1 sec). De snelle gelering van deze hydrogel systeem vergrendelt snel de cellen in de plaats, wat resulteert in een betere cell distributie in 3D in vergelijking met andere fotopolymerisatie regelingen die minuten of zelfs uren duren om te gel punt te bereiken. 7,20

Bovendien werden β-cel spheroids natuurlijk gevormd in thiol-hydrogels teruggewonnen door chymotrypsine-gemedieerde gel erosie. Chymotrypsine, echter een enzym trypsine in de familie hoge concentratie of lange incubatietijd van dit enzym negatief beïnvloeden cel-cel interacties of de bolvormige architectuur verstoren tijdens het herstel. Om deze potentiële beperking voorkomen kunnen hydrogels worden verknoopt door andere gethioleerde substraten en gel erosie nog worden bereikt door geschikte enzymen die geen nadelige cel-cel interactie.

Overall, thiol-hydrogels een cytocompatible omgeving voor het bevorderen van de proliferatie van β-cellen in 3D. Dit systeem kan worden gebruikt voor cultuur en de fysiologische gedrag van verschillende celtypes in 3D. BovendienDit systeem maakt gemakkelijke terugwinning van celpreparaten gevormd in de hydrogel matrix voor verdere functionele en biologische karakteristieken. Deze diverse en cytocompatible hydrogel systeem biedt gel platform voor engineering complexe 3D-weefsel voor regeneratieve geneeskunde toepassing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit project werd gefinancierd door NIH (R21EB013717) en IUPUI OVCR (RSFG). De auteur dankt mevrouw Han Shih voor haar technische bijstand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
  2. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
  3. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
  4. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
  5. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
  6. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
  7. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
  8. Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
  9. Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
  10. Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
  11. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
  12. Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
  13. Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
  14. Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
  15. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
  16. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
  17. Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
  18. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  19. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
  20. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter