Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Följande protokoll ger tekniker för inkapsling pankreas β-celler i steg-tillväxt PEG-peptid hydrogeler bildas av tiol-en foto-klick reaktioner. Detta material plattform inte bara erbjuder en cytocompatible mikromiljö för cellinkapsling, utan också tillåter användarstyrd snabb återhämtning av cellstrukturer bildas inom hydrogeler.

Abstract

Hydrogeler är hydrofila tvärbundna polymerer som ger en tredimensionell mikromiljö med vävnads-liknande elasticitet och hög permeabilitet för odling terapeutiskt relevanta celler eller vävnader. Hydrogeler framställda från poly (etylenglykol) (PEG)-derivat används alltmer för en mängd olika tillämpningar vävnadsutvecklingssteg, delvis på grund av deras avstämbara och cytocompatible egenskaper. I detta protokoll används vi tiol-en steg-tillväxt photopolymerizations att tillverka PEG-peptid hydrogeler för inkapsling bukspottkörteln MIN6 B-celler. Gelerna bildades av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer och en chymotrypsin känslig peptid tvärbindningsmedlet (CGGYC). Den hydrofila och icke-nedsmutsning karaktär av PEG har en cytocompatible mikromiljö för cellöverlevnad och proliferation i 3D, medan användningen av kymotrypsin-känslig peptidsekvens (C-GGYC indikerar pilen enzym klyvningsställe, medan terminal cystaeine rester lades till tiol-en tvärbindning) tillåter snabb återhämtning av cell konstruktioner som bildar inom hydrogelen. Följande protokoll utvecklar tekniker för: (1) Inkapsling av MIN6 β-celler i tiol-en hydrogeler, (2) Kvalitativa och kvantitativa cellernas viabilitet analyser för att bestämma cellöverlevnad och-proliferation, (3) Återvinning av cell sfäroider med kymotrypsin-medierad gel erosion, och (4) strukturell och funktionell analys av de återvunna sfäroider.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydrogeler är hydrofila tvärbundna polymerer med exceptionell potential som byggnadsställningar material för reparation och regenerering vävnader. 1-3 Den höga vattenhalten i hydrogeler möjliggör enkel diffusion av syre och utbyte av näringsämnen och cellulära metaboliska produkter, som alla är avgörande för att upprätthålla cellviabiliteten. Dessutom hydrogeler är utmärkta bärare för kontrollerad frisättning och cell leverans på grund sin höga avstämbarhet. 2 Syntetiska hydrogeler såsom de framställs från poly (etylenglykol) (PEG) används alltmer i applikationer vävnadsteknik, till stor del på grund av deras cytocompatibility, vävnads- såsom elasticitet och hög avstämbarhet i material fysikaliska och mekaniska egenskaper. 4-6

Även om en vanligt hydrogel plattform har studier visat att PEG-diakrylat (PEGDA) hydrogeler bildas genom kedje-tillväxt photopolymerizations har en tendens att skada inkapslade celler During-nätverk tvärbindning och in situ cell inkapsling. 7 Det cellulära skadorna till stor del hänföras till radikalspecies genereras av fotoinitiatorn molekyler, som propagerar genom vinylgrupper på PEGDA att tvärbinda polymerkedjor i hydrogeler. Tyvärr är dessa radikalspecies också orsaka spänningar och cellulär skada under cell inkapsling, särskilt för radikal-känsliga celler såsom pankreas β-celler. 8-10 För att erhålla en högre maskstorleken för bättre spridning och cellöverlevnad, högre molekylvikter PEGDA används ofta för cellinkapsling. Detta är dock kompromisser polymerisations kinetik och orsakar suboptimala gel biofysiska egenskaper. 7,11,12 Utöver de ovan nämnda nackdelarna, är det mycket svårt att återvinna cellstrukturer från PEGDA hydrogeler beroende på heterogeniteten och icke-nedbrytbara naturen hos de tvärbundna nätverk. Medan proteaskänsliga peptider kan inkorporerasi PEG makromer ryggraden för att göra annars inerta PEGDA hydrogeler känsliga för enzymatisk klyvning använder konjugering ofta dyra reagens och de resulterande nätverken fortfarande innehåller höga grad av heterogenitet på grund av typen av kedja-tillväxt polymerisation. 13-15

Nyligen, har PEG-peptid hydrogeler bildade via steg-tillväxt tiol-en fotopolymerisation visats uppvisa förmånliga egenskaper för cellinkapsling över hydrogeler bildade genom kedje-tillväxt fotopolymerisation. 7 De överlägsna gelning kinetik tiol-en hydrogeler tillskrivs "klick "natur reaktion mellan tiol och en-funktioner. Jämfört med kedja-tillväxt polymerisation av PEGDA är tiol-en reaktion mindre syre hämmade vilket resulterar i snabbare gelning takt. 16,17 Tiol-en hydrogeler också har högre polymerisa effektivitet och bättre gel biofysiska egenskaper jämfört med kedja-tillväxt PEGDA hydrogeler, 7 , 18 </ Sup> vilket resulterar i begränsad cellulär skada som orsakas av radikala arter under fotopolymerisation.

Tidigare, tiol-en hydrogeler bildas av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer och bis-cystein innehållande tvärbindare peptid, såsom proteas-känsliga peptider har använts för cellinkapsling. 7,18 Hög avstämbarhet av PEG hydrogel nätverk erbjuder en flexibel och kontrollerbar 3D mikromiljö för undersökning cellöverlevnad och aktivitet, medan användningen av proteas-känslig peptidsekvens ger en mild sätt för återvinning av cell konstruktioner bildade naturligt inom hydrogeler. I detta protokoll använder vi steg-tillväxt fotopolymeriserad tiol-en hydrogeler tillverkade användning av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) och en chymotrypsin-känslig peptid tvärbindningsmedel (CGGY ↓ C) för inkapsling av MIN6 β-celler. Detta protokoll utvecklar systematiskt tekniker för att studera överlevnad, proliferation och sfäroid bildning av MIN6β-celler i tiol-en-hydrogeler. Vi tillhandahåller ytterligare metod för β-celler sfäroid återhämtning och biologisk karakterisering av återvunna sfäroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A. makromer och peptidsyntes

  1. Syntetisera 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) och fotoinitiator Litium arylphosphanate (LAP) med fastställda protokoll. 18,19
  2. Syntetisera bis-cystein innehåller kymotrypsin-känslig peptid CGGY ↓ C (pil indikerar kymotrypsin klyvningsställe) med standard fast fas peptid i en mikrovågsugn peptidsyntetisator (CEM Discover SPS).
    1. Beräkna mängden harts (Rink-amid MBHA-harts) behov baserat på substitution mellan hartset och syntesen skalan. Svälla hartset i dimetylformamid (DMF) i ett reaktionskärl (RV) under 15 min.
    2. Avlägsna Fmoc-skyddsgruppen från hartset med användning av ett skyddsgruppsavlägsnande innehållande 20% piperidin och 0,1 M HOBt i DMF. Använd parametrar som anges i tabellen nedan för mikrovågsassisterad Fmoc-skyddsgruppsavlägsnande (för alla Fmoc-aminosyror):
      Syntes skala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Effekt 20 W 50 W
      Temperatur 75 ° C 75 ° C
      Tid 3 min 3 min
    3. Efter skyddsgruppsavlägsnande, skölj hartsen med DMF och utföra ninhydrintest att bekräfta borttagningen av Fmoc (exponering av N-terminal amin). Harts ska bli blå efter 2 minuter vid 95 ° C.
    4. Efter lyckad avskyddande, par första Fmoc-aminosyran vid C-terminalen (syntes löper från C-till N-terminalen) i en aktivator baslösning (0,28 M diisopropyletylamin (DIEA) i DMF) med de parametrar som anges i tabellen nedan .
      Syntes skala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Effekt 20 W 50 W
      Temperatur * 75 ° C 75 ° C
      Tid * 5 minuter 5 minuter

      * För Cysta och hans Använd 50 ° C och 10 minuter för att minska racemisering.
    5. Skölj hartset och utföra ninhydrintest att kvalitativt bekräfta slutförandet av kopplingen (försvinnande av N-terminala aminen). Harts bör vara tydliga efter 5 minuter vid 95 ° C. Upprepa koppling steg (A.2.d) om ninhydrintest returnerar positivt resultat (blå färg).
    6. Upprepa avskyddning (steg A.2.b) och koppling (steg A.2.d) för ytterligare aminosyror i sekvensen slutar med ett slutligt avskyddningssteg.
    7. Töm RV, skölj hartset med 25 ml diklormetan (DCM). Detta steg är att skölja av DMF, som är en bas och kommer att hindra peptidklyvning.
    8. Förbered klyvning cocktail genom att blanda 250 mg fenol i 4,75 ml trifluorättiksyra (TFA), 0,125 ml triisopropylsilan (TIS) och 0,125 ml DDH 2 O.
    9. Lägg klyvning lösning i RV och klyva under 30 min i mikrovågs peptidsyntetiserare (Effekt = 20 W, Temperatur = 38 ° C).
    10. Samla peptiden lösningen i ett 50 ml centrifugrör med vakuumförgreningsrör.
    11. Fällning kluvna peptiden i 40 ml eter, virvel röret och centrifugera vid 3.000 rpm under 5 minuter för uppsamling av peptiden.
    12. Tappa supernatanten och upprepa steg A.2.k två gånger.
    13. Samla och torka peptid i vakuum.
    14. Rena peptiden med användning av HPLC och karakterisera det med masspektrometri.

B. Material Förberedelser och sterilisering

  1. Bered 20 vikt% lösning PEG4NB i PBS, vortexa blandningen tills makromeren löses fullständigt, och sterilisera makromerlösningen användning ett sprutfilter. Förvara steriliserade lösningen på -20 ° C (förbereda portionerför långtidslagring).
  2. Förbered och sterilisera 2 vikt% fotoinitiator (LAP) lösning i PBS. Förvara den steriliserade lösningen vid rumstemperatur skyddad från ljus.
  3. Lös peptiden (CGGYC) i PBS, vortexa blandningen och sprutan filtrera lösningen för sterilisering. Alikvotera peptidlösningen och förvara vid -20 ° C tills användning (förhindra frysning-upptiningscykler).
  4. Bestäm tiol (-SH)-koncentrationen i den framställda peptiden lösningen med Ellmans reagens (följ tillverkarens protokoll). Detta steg kommer att ge korrekt peptidkoncentration (dvs. [SH] / 2) som krävs för beräkning av peptiden belopp som skall användas i tiol-en foto-klick reaktioner.
  5. Förbered gelning formar genom att skära den övre delen av av sterila 1 ml engångssprutor med ett rakblad (öppen spets för gel borttagning). Sterilisera sprutan formarna genom autoklav.
  6. Baserat på den önskade gelformuleringen (tiol till en-förhållande = 1) och koncentrationer av lager matematerial, beräkna erforderlig volym av polymer, peptid tvärbindaren, fotoinitiator, och buffert som behövs lösningar.

C. Cell Framställning

  1. Ekvilibrera cellodlingsmediet (hög glukos DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum, antibiotika-Antimykotisk med 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 250 ng / ml Fungizone och 50 iM β-merkaptoetanol), Hanks balanserade saltlösning ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + fri), och trypsin-EDTA till 37 ° C.
  2. Ta bort kolvar innehållande MIN6 β-celler från CO 2 inkubator och placera kolvarna i laminärt flöde huva.
  3. Sug cellodlingsmedia från kolvarna och skölj cellen med HBSS.
  4. Trypsinisera cellerna med användning 3 ml 2X (0,1%) trypsin-EDTA och inkubera kolvarna för 4 min vid 37 ° C och 5% COj 2.
    • Obs: Använd 2X trypsinlösning möjliggör fullständig dissociation av MIN6 β-celler till en enda cell suspension.
    </ Li>
  5. Efter inkubation trycker kolvarna på ytan av huven försiktigt att helt lösgöra cellerna. Bekräfta lösgörandet och dissociation av cellerna med användning av ett mikroskop.
  6. Lägg lika volym av cellodlingsmedium för att neutralisera trypsin. Blanda lösningen omsorgsfullt genom försiktig pipettering, sedan överföra blandningen till en kanonisk rör och centrifugera under 5 min vid 1.000 rpm.
  7. Aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i 4 till 5 ml odlingsmedium.
  8. Bestäm celltäthet med 50% trypanblått buffert i en hemocytometer.

D. Hydrogel Tillverkning och cellinkapsling

  1. När cellerna är redo, blanda (baserat på en 1:1 tiol till en-förhållande) som krävs volymer PEG4NB, CGGYC, LAP, cell-lösning, och HBSS i ett mikrocentrifugrör.
  2. Blanda lösningen försiktigt med en pipett för att erhålla en homogen blandning och tillsätt 25 pl av den resulterande lösningen till en spruta mögel. Exponera sprutan för UV-ljus (365nm, 5 mW / cm 2) under 2 min.
  3. Efter fotopolymerisation, geler dopp i en steril 24-brunnars platta innehållande cellodlingsmedium och inkubera hydrogelerna i 37 ° C och 5% CO 2.
  4. Tvätta cell-lastad hydrogeler i cellodling medium för 30 minuter för att skölja av löst fastsatta celler och un-tvärbundna makromerer. Överför gelerna till färskt medium.
  5. Refresh Cellodlingsmedia varje 2 till 3 dagar.

E. cellviabilitet Analys

Inkapslad cellmorfologi kan observeras med ljusmikroskop (eftersom de syntetiserade hydrogeler är öppna). Cellviabiliteten kan visualiseras och mätas kvalitativt med Live / Dead färgning och kvantitativt med hjälp alamarBlue reagens.

E.1. Levande / döda färgning

  1. Tina Live / Dead färgreagenser vid rumstemperatur.
  2. I en kanonisk Häll PBS enligt antalet prover (n) färgas:
    Total volym PBS = n × 500 ^
  3. Pipettera 0,25 il kalcein AM och 2 pl EthD-1 per 1 ml PBS till den kanoniska rör innehållande PBS. Vortexblanda lösningen för att blanda komponenterna.
  4. Inkubera cell-lastad hydrogeler i Live / Dead färgningslösning (0,5 ml / prov) under 1 timme vid rumstemperatur på en orbitalskakare.
  5. Med hjälp av en Pasteurpipett, ta bort färglösningen och skölj provet två gånger med PBS.
  6. Placera provet på ett täckglas eller glasplatta. Observera och celler bilden med en konfokalmikroskop.

E.2. AlamarBlue analys

  1. Bered 10 vol / vol% alamarBlue lösning i cellodlingsmedium.
  2. Ta hydrogeler från inkubatorn och aspirera media från varje brunn utan att någon kontakt med hydrogelen.
  3. Inkubera cell-lastad hydrogeler och en tom väl (negativ kontroll) i 500 pl 10%-lösning alamarBlue under 16 timmar.
  4. Efter inkubation, pipett 200 plav alamarBlue lösningen i en 96-brunnsplatta och mäta fluorescens med användning av en mikroplattläsare (excitation: 560 nm, emission: 590 nm).
    • Högre cellulär metabolisk aktivitet minskar färgen att ge högre fluorescens läsning.
    • Var noga med att inkludera åtminstone två brunnar på 10% alamarBlue lösning ämnen. Vid analys av data subtrahera genomsnittliga tomma fluorescens värde från fluorescens läsning av proverna.

F. Kymotrypsin medierad Gel Erosion och sfäroid Recovery

  1. Bered 1 mg / ml av trypsin-fri α-kymotrypsin lösning i HBBS och sterilfilter lösningen.
  2. Inkubera hydrogeler i kymotrypsin-lösning (500 pl för varje gel) vid rumstemperatur med försiktig skakning tills fullständig gel erosion uppnås.
    • För en 25 pl gel är det dags för komplett erosion ca 5 min.
  3. Placera plattan på is under några minuter för att reducera aktiviteten avkymotrypsin.
  4. Överför cellösningen i 1 ml rör och centrifugera vid 300 rpm, 4 ° C under 2 minuter.
  5. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en betesmark pipett och försiktigt återsuspendera sfäroiderna i HBSS.
  6. Överför den återvunna sfäroid lösningen till en 24-brunnsplatta och placera plattan på is för att sfäroiderna att bosätta sig.
  7. För storlek analys hämta bilder fas kontrast avvecklas sfäroiderna med ett ljusmikroskop. Mät återhämtade sfäroid diametrar använder program som Nikon Element mjukvara eller ImageJ.

G. Funktionell analys av återvunna sfäroider

G.1. Glukos stimulerad insulinsekretion från återvunna cell sfäroiderna

  1. I en 24-brunnsplatta, inkubera gelerna i 500 pl av 2 mM glukos låg Kantsten-Ringer-buffert (KRB) under 1 timme.
  2. Erode gelen och återhämta cell sfäroider med steg F.1 till F.6.
  3. Aspirera supernatanten försiktigt utan att göra någrakontakt med cellen sfäroiderna och återsuspendera sfäroiderna i 500 pl av 2 mM glukos låg KRB.
  4. Överför 100 ^ cell sfäroider lösning till en 0,6 ml rör och placera den på is för intracellulär ATP-kvantifiering.
  5. Dela den återstående cellen sfäroid lösning i halv (i två mikrocentrifugrör) och centrifugera under 2 minuter vid 300 rpm och 4 ° C.
  6. Sug supernatanten (nästan till botten) och återsuspendera den första halvan av cell sfäroiderna i 1 ml 25 mm hög glukos KRB och andra halvan i 1 ml 2 mM låg glukos KRB.
  7. Försiktigt pipett och överför lösningen innehållande återvunna cell sfäroider till en 24-brunnsplatta. Inkubera plattan under 1 timme vid 37 ° C och 5% COj 2.
  8. Efter inkubation, överför lösningen till ett mikrocentrifugrör och centrifugera under 2 minuter vid 1.000 rpm och 4 ° C.
  9. Överför 500 | il av supernatanten från den centrifugerade rör till ett annat mikrocentrifugrör och förvara vid 4 ° C för insulinELISA.
  10. Utför insulin ELISA efter tillverkarens protokoll.

G.2. CellTiter Glo-analys

  1. ATP standarder: Förbered en 10 pM ATP-lösning och utföra seriespädningar att få en serie av 8 standardlösningar.
  2. Till en vit platta med 96 brunnar, tillsätt 50 ul cell-sfäroid lösning (från steg G.1.6) och standarder.
  3. Till varje brunn innehållande prover och standarder, tillsätt 50 pl CellTiter Glo-reagens och inkubera vid rumstemperatur under 15 minuter.
  4. Efter inkubation mått luminescens räkning av prover och standarder med en mikroplattavläsare och kalibrera prov ATP-koncentrationerna med användning av en linjär regressionskurva som genereras av ATP standarder.
  5. Bestämma den totala ATP-koncentrationen i provet och multiplicera med provet spädningsfaktorn för att få den intracellulära ATP-koncentrationen i en cell-lastad hydrogel.

G.3. Bestäm insulinutsöndring

  1. Beräkna Amount av insulin som utsöndras från de återvunna sfäroiderna genom att ta förhållandet av mängden insulin som utsöndras i hög glukos-medium till mängden insulin som utsöndrades i låg glukosmedium.
  2. Normalisera kvantifierade insulinhalten i cell sfäroiderna med respektive mängd intracellulärt ATP i återvunna cell sfäroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figurerna 1-4 visar representativa resultat för inkapsling, överlevnad, proliferation, sfäroid-bildning, och sfäroid återhämtning i tiol-en-hydrogeler. Figur 1 visar reaktionen schematiskt (1) steg-tillväxt tiol-en fotopolymerisation med PEG4NB och CGGYC, och ( 2) kymotrypsin medierad gel erosion som följer en mekanism yterosion. Figurerna 2 och 3 aktuella resultat lönsamhet erhållits med Live / Dead färgning och alamarBlue analys. Vi observerar att celler prolifererade i PEG4NB-CGGYC hydrogeler även vid låg cell packningsdensitet, indikerar cytocompatibilty av tiol-en hydrogelsystem. Figur 4 visar bilder faskontrast av inkapslade och återvunna β-cell sfäroider, liksom storleken fördelningen av återvunna β-cell sfäroider.

_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk av steg-tillväxten tiol-en foto-klicka reaktion med PEG4NB och CGGYC att bilda PEG-peptidkonjugatet. Hydrogeler kan urholkas snabbt genom kymotrypsin behandling.

Figur 2
Figur 2. Inledande livskraft och cell sfäroid bildas i PEG4NB/CGGYC hydrogeler. (A) Levande / Dead färgning utfördes omedelbart efter foto-inkapsling. (B) Levande / döda färgning utfördes efter 10 dagars odling in vitro. Representativa konfokala z-stack bilder av MIN6 β-celler inkapslade i 4 vikt% PEG4NB/CGGYC hydrogeler (2 x 10 6 celler / ml, skala = 100 pm). Cellviabiliteten definierades som andelen levande (grön) celler över hela cellen (grön + röd) räknas. (2 x 10 6 celler / ml, N = 4, medelvärde ± SD).

Figur 3
Figur 3. Metabolisk aktivitet av MIN6 β-celler mätt som en funktion av tiden genom alamarBlue reagens (N = 3, medelvärde ± SD). MIN6 β-celler inkapslade i 3 vikt%, 4 vikt% och 5 vikt% hydrogeler PEG4NB/CGGYC vid 2 × 10 6 celler / ml.

Figur 4
Figur 4. Karaktärisering av återvunna MIN6 β-cell sfäroider. Cell sfäroider utvanns från PEG4NB/CGGYC använda 40 iM chymotrypsin efter 10 dagars odling in vitro. (A) representant faskontrastbilden av inkapslade β-cell sfäroider. (B) Representant faskontrastbilden av återvunna β-cell sfäroider. (C) Distribution of sfäroid diametrar (Celldensitet = 1 x 10 7 celler / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den beskrivna protokollet ger information om enkel inkapsling av celler i tiol-en hydrogeler bildas genom steg-tillväxt fotopolymerisation. Medan ett stökiometriskt förhållande av 1:1 av norbomen till tiolfunktionella grupper användes i detta protokoll, förhållandet kan justeras beroende på experimenten. Förutom en korrekt formulering, är det viktigt att bibehålla homogenitet i pre-polymer-lösning. I synnerhet kan försiktig pipettering för att säkerställa att celler väl fördelade i pre-polymer-lösning i syfte att undvika klumpning av cell och variation i gelegenskaperna. Även om en polymerisationstid av 2 minuter användes för gel-tvärbindning, är gelpunkten för tiol-en hydrogeler mindre än 10 sekunder i de flesta cell inkapsling-relevanta formuleringar (t.ex., är gel-punkt för 4 vikt% PEG4NB/CGGYC hydrogel 7 ± 2 sek och 5 vikt% är 6 ± 1 sek). Den snabba gelning av denna hydrogel systemet låser snabbt cellerna på plats, vilket resulterar i bättre celL distribution i 3D jämfört med andra fotopolymerisation system som tar minuter eller till och med timmar för att nå gelpunkt. 7,20

Dessutom var β-cell sfäroiderna naturligt bildade i tiol-en hydrogeler utvanns genom kymotrypsin-medierad gel erosion. Kymotrypsin, dock, är ett enzym i trypsin familjen och hög koncentration eller lång inkubationstid för detta enzym kan negativt påverka cell-cell-interaktioner eller störa sfäroid arkitekturen under återhämtning. För att undvika denna potentiella begränsning, kan hydrogeler tvärbindas av andra tiolerade substrat och gel erosion kan fortfarande uppnås genom lämpliga enzymer som inte orsakar skadliga cell-cell-interaktion.

Sammantaget tiol-en hydrogeler ger en cytocompatible miljö för att främja spridningen av β-celler i 3D. Detta system kan användas för att odla och studera den fysiologiska beteendet hos olika celltyper i 3D. Vidare,detta system medger enkel återvinning av cell konstruktioner bildas inuti hydrogelmatrisen för ytterligare funktionella och biologiska karakteriseringar. Denna varierande och cytocompatible hydrogel system ger gel plattform för tekniska komplexa 3D vävnader för regenerativ medicin ansökan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta projekt har finansierats av NIH (R21EB013717) och IUPUI gripit över (RSFG). Författaren tackar Ms Han Shih för hennes hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
  2. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
  3. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
  4. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
  5. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
  6. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
  7. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
  8. Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
  9. Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
  10. Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
  11. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
  12. Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
  13. Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
  14. Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
  15. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
  16. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
  17. Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
  18. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  19. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
  20. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter