Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.

Abstract

Hidrojeller kültürleme terapötik açıdan anlamlı hücreleri veya dokuları için esneklik ve yüksek düzeyde geçiş doku gibi olan bir üç-boyutlu, çapraz bağlı hidrofilik mikroçevrede sağlamak polimerlerdir. Poli (etilen glikol) (PEG) türevi kullanılarak hazırlanmıştır Hidrojeller giderek artan bir şekilde ayarlanabilir ve cytocompatible özellikleri nedeniyle kısmen, doku mühendisliği çeşitli uygulamalar için kullanılmaktadır. Bu protokol, pankreas MIN6 b-hücrelerinin kapsüllenmesinde PEG-peptid hidrojeller imal tiyol-ene adım büyüme photopolymerizations kullanılmıştır. Jeller 4 kollu PEG-norbornen (PEG4NB) makromer ve kimotripsin duyarlı peptid çaprazbaglayıcı (CGGYC) tarafından oluşturulmuştur. PEG hidrofilik olmayan kirlenme doğa, 3D hücre canlılığı ve çoğalma için cytocompatible mikroçevrede sunarken kimotripsin duyarlı peptid sekansı (kullanımı C GGY ↓ C, ok enzimi bölünme yeri gösterir iken terminali kisteine artıkları) tiol-ene çapraz bağlama için ilave edildi içinde hidrojel oluşturan hücre yapıları hızlı bir iyileşme sağlar. Aşağıdaki protokol için teknikler ayrıntılarına: tiyol-ene hidrojeller olarak MIN6 β-hücrelerinin (1) Kapsülleme, (2) nitel ve nicel hücre canlılığı deneyleri hücre hayatta kalma ve çoğalma belirlemek için, (3) hücre parçacıkları arasında Recovery kimotripsin-aracılı jel kullanılarak erozyon ve kurtarılan sferoidlerin (4) yapısal ve fonksiyonel analiz.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hidrojeller. Tamir ve rejenere dokular için iskele malzemesi olarak olağanüstü potansiyele sahip hidrofilik çapraz polimerlerdir hidrojellerin 1-3 su içeriği yüksek oksijen ve hücre canlılığı korumak için çok önemlidir her hangi besin ve hücresel metabolik ürünlerin, değişimi kolay difüzyon verir. Buna ek olarak, hidrojel kontrollü serbest bırakma ve yüksek tunability bağlı olarak hücre dağıtım için mükemmel taşıyıcılar. Örneğin poli (etilen glikol) (PEG) gibi hazırlanan 2 sentetik hidrojel artan bir şekilde büyük ölçüde onların cytocompatibility için, doku mühendisliği uygulamalarda kullanılır, doku malzemelerin fiziksel ve mekanik özellikleri gibi esneklik ve yüksek tunability. 4-6

Yaygın olarak kullanılan bir hidrojel platformu rağmen, çalışmalar zincir büyüme photopolymerizations oluşturduğu PEG diacrylate (PEGDA) hidrojellerin kapsüllü hücreleri Duri zarar eğilimi olduğunu göstermiştirng ağ çapraz ve yerinde hücre encapsulation. 7 hücresel hasarı büyük ölçüde hidrojeller içine kroslink polimer zincirleri PEGDA üzerine vinil gruplar aracılığıyla yaymak photoinitiator molekülleri tarafından oluşturulan radikal türleri bağlandı. Ne yazık ki, bu radikal türleri de özellikle pankreatik β-hücreleri gibi radikal duyarlı hücreler için, hücre kapsülleme sırasında stres ve hücre hasarına neden. 8-10 amacıyla daha iyi difüzyon ve hücre canlılığı, yüksek molekül ağırlıkları PEGDA için daha yüksek bir mesh boyutu elde etmek için genellikle hücreye yoğunlaştırmak için kullanılır. Bununla birlikte, bu polimerizasyon kinetiğini bozmakta ve sub-optimal jel biyo-fiziksel özelliklere yol açmaktadır. 7,11,12 yukarıda bahsedilen dezavantajlara ek olarak, bağlı bir heterojen ve non-parçalanabilir olmaları PEGDA hidrojeller elde edilen hücre yapıları geri kazanılması için çok zordur Çapraz bağlı ağ. Proteaz-duyarlı peptidler dahil edilebilirkenenzimatik yarılma duyarlı aksi asal PEGDA hidrojeller işlemek için PEG makromer omurga içine, konjugasyon genellikle pahalı reaktifler kullanır ve çıkan ağlar nedeniyle hala zincir polimerleşme doğası heterojenlik yüksek derecede içerir. 13-15

Son zamanlarda, adım-büyüme tiyol-ene fotopolimerizasyon yoluyla oluşmuş PEG-peptid hidrojeller zincir büyüme fotopolimerizasyon oluşan hidrojeller fazla hücre kapsülleme için tercihli özelliklerini gösterdikleri oylandı. Tiyol-ene hidrojellerin 7 üstün jelleşme kinetiği 'tık atfedilir tiyol ve ene işlevleri arasındaki reaksiyon 'doğası. PEGDA zincir-büyüme polimerizasyonu ile karşılaştırıldığında, tiyol-ene reaksiyonu olan hızlı jelleşme oranı ile sonuçlanır. Daha az oksijen 16,17 Tiyol-ene hidrojeller de yüksek polimerizasyon verimi ve zincir-büyüme PEGDA hidrojeller, 7 göre daha iyi jel biyofiziksel özelliklere sahip inhibe edilir , 18 </ Sup> hangi fotopolimerizasyon sırasında radikal türlerinin neden sınırlı hücresel hasar ile sonuçlanır.

Daha önce, tiyol-ene hidrojeller 4-kol, PEG-norbornen (PEG4NB) makromer ve bu gibi bis-sisteyin içeren peptit çapraz bağlayıcılar, oluşan proteaz-duyarlı peptidler hücre kapsülleme için kullanılmıştır. PEG hidrojel ağların 7,18 yüksek tunability bir sunmaktadır hücre canlılığı ve etkinliği araştırmak için esnek ve kontrol edilebilir 3D mikroçevrede, proteaz duyarlı peptid dizisi kullanımı hidrojeller içinde doğal olarak oluşan hücre yapıları kurtarma için hafif bir şekilde sağlıyor. Bu protokolü biz 4-kol PEG-norbornen (PEG4NB) ve MIN6 β-hücre kapsülleme için kimotripsin duyarlı peptid çaprazbaglayıcı (CGGY ↓ C) kullanarak fabrikasyon adım büyüme photopolymerized tiyol-ene hidrojeller kullanmaktadır. Bu protokol sistematik MIN6 hayatta kalma, proliferasyon ve sfero oluşumunu incelemek için teknikler ayrıntılandırdığıtiyol-ene Hidrojellerde β-hücreleri. Biz daha fazla β-hücre spheroid kurtarma ve iyileşti sferoidlerin biyolojik karakterizasyonu için bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A. makromer ve Peptid Sentezi

  1. Köklü protokolleri kullanarak 4-kol PEG-norbornen (PEG4NB) ve photoinitiator Lityum arylphosphanate (LAP). 18,19 sentezlenmesi
  2. Sentezlemek kimotripsin-duyarlı peptidi içeren bis-sisteyin CGGY ↓ C bir mikrodalga peptid sentezleyicisi (CEM Discover SPS), standart katı faz peptid sentezi ile (ok kimotripsin bölünme yeri ifade eder).
    1. Reçine ve sentez ölçek ikame oranına göre ihtiyaç reçinesi (MBHA Rink-amid reçine) miktarı hesaplanır. 15 dakika boyunca bir reaksiyon kabına (RV) olarak dimetilformamid (DMF) içinde reçine şişer.
    2. İzleme Fmoc-koruyan% 20 Piperidin ve DMF içinde 0.1 M HOBt ihtiva eden bir çözelti kullanılarak korumanın kaldırılması reçine grubu. Mikrodalga destekli Fmoc-korumasının giderilmesinden (bütün Fmoc-amino asit için) için, aşağıdaki tabloda listelenen parametrelerin kullanımı:
      Sentez ölçekli 0.1 mmol 0.2 mmol
      Güç 20 W 50 W
      Sıcaklık 75 ° C 75 ° C
      Zaman 3 dk 3 dk
    3. Deproteksiyon ardından, DMF ile reçine durulayın ve Fmoc (N-terminal amin maruziyeti) giderimi onaylamak için ninhidrin testi gerçekleştirin. Reçine 95 ° C'de 2 dakika sonra mavi açmak gerekir
    4. Başarılı bir korumanın kaldırılması, çift, aşağıdaki tabloda belirtilen parametreler ile bir aktive edici baz çözeltisi içinde C-terminali (sentezi N-terminali, C-ile çalışan) (DMF içinde 0.28 M Diizopropiletilamin (DIEA)) ilk Fmoc-amino asit sonrasında .
      Sentez ölçekli 0.1 mmol 0.2 mmol
      Güç 20 W 50 W
      Sıcaklık * 75 ° C 75 ° C
      Zaman * 5 dk 5 dk

      * Kist ve O'nun için, 50 ° C ve 10 dk rasemizasyonu azaltmak için kullanabilirsiniz.
    5. Reçine durulayın ve niteliksel kaplin tamamlanması (N-terminal amin kaybolması) onaylamak için ninhidrin testi gerçekleştirin. Reçine 95 az 5 dk sonra net olmalıdır ° C Ninhidrin testi pozitif sonuç (mavi renk) dönerse kaplin adım (A.2.d) tekrarlayın.
    6. Son bir koruma kaldırma adımı ile biten sırayla ilave amino asit için tekrarlayın deproteksiyon (adım A.2.b) ve kavrama (adım A.2.d).
    7. , RV tahliye diklorometan içindeki 25 ml (DCM) ile reçine yıkayın. Bu adım bir üs olduğunu ve peptid dilinim engel olacaktır DMF, durulayın etmektir.
    8. 250 m karıştırılarak yarılma kokteyli hazırlayın4.75 ml trifloroasetik asit (TFA), 0.125 ml Triisopropylsilane (TBS) ve 0.125 ml GKD 2 O. fenol g
    9. Mikrodalga peptid synthesizer 30 dakika RV ve çatlatma içine bölünme solüsyonu ekleyin (Güç = 20 W; Sıcaklık = 38 ° C).
    10. Vakum manifoldu kullanılarak 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne peptid solüsyonu toplayın.
    11. 40 ml eter içinde çökelti yarılan peptid, girdap 5 dakika boyunca 3000 rpm'de santrifüj tüpü ve peptid toplamak.
    12. Süpernatant süzün ve adım A.2.k iki kez tekrarlayın.
    13. Toplayın ve vakum peptid kurutun.
    14. HPLC kullanarak peptid arındırın ve kütle spektrometresi ile karakterize.

B. Malzeme Hazırlanması ve Sterilizasyonu

  1. Makromer tamamen eriyene kadar PBS, girdap karışım içinde ağırlık olarak% 20 PEG4NB çözelti hazırlayın ve bir şırınga filtresi kullanılarak makromer solüsyon sterilize edin. -20 ° C (hazırlamak alikotları de sterilize çözümü MağazaUzun süreli depolama için).
  2. PBS içinde% 2 ağ photoinitiator (LAP) çözeltisi hazırlayın ve sterilize edin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında steril çözelti saklayın.
  3. PBS içinde peptid (CGGYC) karışımı şırınga ile sterilizasyon için çözelti filtre girdap eritilir. Tablet -20 ° C'de peptide çözeltisi ve mağaza kadar (donma-çözülme döngüleri engellemek için) kullanabilirsiniz.
  4. Tiyol (-SH) Ellman maddesi kullanılarak hazırlanan peptid çözeltideki konsantrasyonu (üreticinin protokolünü takip) belirleyin. Bu adım, tiyol-ene foto-tıklamayla reaksiyonları kullanılmak üzere peptid miktarının hesaplanması için gerekli olduğunu (yani, [SH] / 2) doğru peptid konsantrasyonunu verir.
  5. Bir jilet (jel kaldırılması için açık ucu) kullanarak steril 1 ml tek kullanımlık enjektör üst kısmını keserek jelleşme kalıpları hazırlayın. Otoklav tarafından şırınga kalıpları sterilize.
  6. Istenen jel formülasyonu (ene oranı = 1 tiyol) ve stok dostum konsantrasyonları dayanarakrials, polimerin gerekli hacmi, çapraz bağlayıcı peptit, foto başlatıcı ve gerekirse tampon çözeltiler hesaplar.

C. Hücre Hazırlanması

  1. , Hank'in dengeli tuz çözeltisi (hücre kültür ortamı (;, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 250 ng / ml Fungizone ile Antibiyotik Antimikotik ve 50 uM β-merkaptoetanol yüksek glikoz DMEM,% 10 fetal bovin serumu içeren) dengelemek 37 HBSS, Ca2 +, Mg2 + boş), ve tripsin-EDTA ° C.
  2. CO 2 inkübatör MIN6 β-hücreleri içeren matara çıkarın ve laminer akış kaputu şişeler yerleştirin.
  3. Flasks hücre kültürü medya aspire ve HBSS ile hücre durulayın.
  4. 2X, 3 ml (% 0.1) Tripsin-EDTA kullanılarak hücrelerin Trypsinize ve 37 dakika süreyle 4 ° C'de inkübe şişeler ve% 5 CO2.
    • Not: Kullan 2X tripsin solüsyon tek hücre süspansiyonu haline MIN6 β-hücrelerinin tam ayrışma sağlar.
    </ Li>
  5. İnkübasyondan sonra, tamamen hücreleri ayırmak için hafifçe başlık yüzeyi üzerinde şişeler dokunun. Bir mikroskop kullanılarak hücrelerin dekolmanı ve disosiyasyon onaylayın.
  6. Tripsin nötralize etmek için hücre kültürü ortamı, eşit hacim ekleyin. Yumuşak pipetleme ile iyice karıştırın çözelti, daha sonra 1000 rpm'de 5 dakika için standart tüp ve santrifüj ile karışım aktarın.
  7. Süpernatant aspire ve yavaşça 4 hücreleri yeniden askıya - kültür ortamı 5 ml.
  8. Hemasitometre% 50 Tripan mavisi tampon kullanarak hücre yoğunluğu belirleyin.

D. Hidrojel Fabrikasyon ve Hücre Kapsülleme

  1. Hücreler hazır edildikten sonra, karışım (ene oranı 1:1 'lik bir tiyol göre) PEG4NB, CGGYC LAP, hücre solüsyonu ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde HBSS arasında gerekli miktarlar.
  2. Nazikçe homojen bir karışım elde edilir ve bir şırınga kalıp ile ortaya çıkan solüsyon 25 ul eklemek için bir pipet kullanılarak çözelti karıştırılır. UV ışık (365 şırınga Açığanm, 2 dakika için 5 mW / cm 2).
  3. Aşağıda, fotopolimerizasyon, steril bir 24 oyuklu plaka içeren bir hücre kültür ortamı içine dalma jeller ve 37 hidrojeller inkübe ° C ve% 5 CO2.
  4. 30 gevşek tutturulmuş hücreler durulayın dk ve un-çapraz makromerleri için hücre kültürü ortamında hücre yüklü hidrojellerin yıkayın. Taze ortama jeller aktarın.
  5. Yenile hücre kültürü ortamı her 2 ila 3 gün.

E. Hücre Canlılık Testi

Kapsüllü hücre morfolojisi (sentezlenmiş hidrojeller şeffaf olduğu için) ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Hücre canlılığı görüntülendi ve Ölü / canlı boyama kullanılarak ve nicelik AlamarBlue reaktifi kullanarak nitel ölçülebilir.

E.1. Ölü / canlı boyama

  1. Oda sıcaklığında Ölü / canlı boyama reaktifleri çözülme.
  2. Kurallı bir tüp içinde lekeli olmak için numune sayısı (n) göre PBS ekleyin:
    PBS = n> toplam hacmi × 500 ul
  3. Calcein AM ve PBS içeren standart tüp için PBS içinde 1 mL başına EthD-1, 2 ul pipetle 0.25 ul. Bileşenlerini karıştırmak için Vortex çözüm.
  4. Bir orbital çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında 1 saat için canlı / Ölü boyama çözeltisi içinde hücre-yüklü hidrojeller (0.5 ml / numune) inkübe edin.
  5. Bir Pasteur pipeti kullanarak, boya çözeltisi kaldırmak ve PBS ile iki kez durulama örnek.
  6. Bir kapak kayma veya cam slayt üzerine örnek yerleştirin. Gözlemleyin ve konfokal mikroskop kullanılarak görüntü hücreleri.

E.2. AlamarBlue Assay

  1. 10 v / hücre kültürü ortamında v% AlamarBlue çözeltisi hazırlayın.
  2. Inkübatör hidrojellerin çıkarın ve hidrojel ile herhangi bir temas olmadan her kuyudan medya üzerinden aspire.
  3. 16 saat boyunca% 10 AlamarBlue çözelti 500 ul hücre-yüklü hidrojeller ve içi boş bir kuyu (negatif kontrol) inkübe edin.
  4. Pipet 200 ul, inkübasyon sonrasındabir mikroplaka okuyucusu (560 nm, emisyon: 590 nm'de eksitasyon) kullanılarak 96 oyuklu plaka ve floresan ölçümü olarak AlamarBlue çözeltisi eklendi.
    • Yükseköğretim hücresel metabolik aktivitesi yüksek floresans okuma vermek için boya azaltır.
    • Boşluk olarak% 10 Alamarblue çözüm en az iki kuyu dahil ettiğinizden emin olun. Verileri analiz ederken, örneklerin floresans okuma ortalama boş floresans değeri çıkarmak.

F. kimotripsin Jel Erozyon ve Sfero Kurtarma Yönlendirilen

  1. HBBS ve steril filtre çözelti içinde serbest Tripsin-α-kimotripsin çözeltinin 1 mg / ml hazırlayın.
  2. Tam erozyon jel elde edilene kadar hafif bir sallama ile oda sıcaklığında kimotripsin çözelti, hidrojel (her bir jel için 500 ul) inkübe edin.
    • 25 ul jel için, tam erozyon süresi yaklaşık 5 dakikadır.
  3. Faaliyet azaltmak için birkaç dakika buz üzerinde plaka yerleştirinkimotripsin.
  4. 2 dakika için 300 rpm'de 1 ml tüp ve santrifüj içinde hücre çözelti, 4 ° C aktarın.
  5. Dikkatlice bir mera pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve yavaşça HBSS içinde sferoidler tekrar süspansiyon haline getirin.
  6. 24-plaka olarak kurtarılan spheroid çözümü aktarın ve sferoidler yerleşmek için izin vermek için buz üzerinde plaka yerleştirin.
  7. Boyut analizi için, ışık mikroskobu kullanılarak yerleşmiş sferoidlerin faz kontrast görüntüler elde. Tedbir gibi Nikon Eleman yazılım veya ImageJ gibi yazılımları kullanarak spheroid çapları kurtarıldı.

Kurtarılan sferoidlerin G. Fonksiyonel Tahlili

G.1. Kurtarılan hücre sferoidler gelen glikoz uyarılmış insülin sekresyonu

  1. 24 çukurlu bir plaka içinde, 1 saat boyunca 2 mM glukoz Kerbs-Ringer tampon maddesi (KRB) 500 ul içinde jeller inkübe edilir.
  2. Jel aşındırın ve F.6 adımları F.1 kullanarak cep sferoidler kurtarabilirsiniz.
  3. Herhangi yapmadan dikkatlice süpernatant aspirehücre sferoidler temas ve 2 mM glukoz KRB 500 ul sferoidler tekrar süspansiyon haline getirin.
  4. 0.6 ml tüp hücre parçacıklarının küresel çözüm 100 ul aktarın ve hücre içi ATP ölçümü için buz üzerine yerleştirin.
  5. Yarı kalan hücre küremsi çözeltisi (iki mikrosantrifüj tüpleri içine) bölünmüş ve 300 rpm, 4 az 2 dakika süreyle santrifüj ° C.
  6. Aspire süpernatant (hemen hemen altına) ve 2 mM glikoz düşük KRB 1 ml 25 mM yüksek glikoz KRB ve ikinci yarım, 1 ml hücre parçacıkları arasında birinci yarı tekrar süspansiyon.
  7. Yavaşça 24-plaka kurtarıldı cep sferoidler içeren çözelti Pipeti ve aktarmak. 37, 1 saat boyunca plaka inkübe ° C ve% 5 CO2.
  8. İnkübasyondan sonra, 2 dakika 1,000 rpm'de ve 4 ° C için bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj ile çözelti aktarmak
  9. Insülin için 4 başka bir mikrosantrifüj tüp ve mağaza ° C santrifüje tüpten 500 ul aktarınELISA.
  10. Insülin ELISA aşağıdaki üretici protokolünü uygulayın.

G.2. CellTiter Glo Assay

  1. ATP standartları: 10 uM ATP çözeltisi hazırlayın ve 8 standart çözümleri bir dizi elde etmek için seri dilüsyonları gerçekleştirin.
  2. Beyaz bir 96 kuyulu plaka 50, hücre küremsi çözeltisi ul (adım G.1.6) ve standartlar ekleyin.
  3. Her bir oyuğa içeren örnekler ve standartlar için, CellTiter Glo reaktif 50 ul ekleyin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  4. İnkübasyon sonrasında, bir mikroplak okuyucu ve ATP standartlarına göre üretilen bir lineer regresyon eğrisi kullanarak kalibre örnek ATP konsantrasyonları kullanılarak örneklerin ve standartların ölçü lüminesans sayımı.
  5. Örnekteki toplam ATP konsantrasyonunu belirleyin ve bir hücre yüklü hidrojel hücre içi ATP konsantrasyonu elde etmek için numune seyreltme faktörü ile çarpın.

G.3. Insülin salınımı belirleyin

  1. Amou hesaplayıninsülin nt düşük glikoz ortamda salgılanan insülin miktarı yüksek glikoz orta salgılanan insülin miktarı oranı alınarak geri kazanılmış sferoidler salgılanır.
  2. Kurtarılan hücre parçacıkları arasında intrasellüler ATP ilgili tutar ile hücre parçacıkları arasında sayılabilir insülin içeriği Normalize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rakamlar kapsülleme, hayatta kalma, proliferasyon, sfero oluşumu ve tiyol-ene Hidrojellerde spheroid kurtarma için 1-4 gösterisi temsilcisi sonuçlar. Şekil 1 PEG4NB ve CGGYC kullanarak (1) adım büyüme tiyol-ene fotopolimerizasyon reaksiyonu şematik ve ( Bir yüzeye erozyon mekanizması aşağıdaki 2) kimotripsin aracılı jel erozyonu. Canlı / Ölü boyama ve AlamarBlue testi kullanılarak elde edilen Şekil 2 ve 3 mevcut canlılığı sonuçlar. Biz, tiyol-ene hidrojel sisteminin cytocompatibilty gösteren, daha düşük yoğunluklu paketleme hücre az PEG4NB-CGGYC hidrojeller hızla çoğalan hücrelerin dikkate alınmalıdır. Şekil kapsüllenmiş ve geri kazanılan β-hücre parçacıkları arasında ŞEKİL 4, faz kontrast görüntüleri de boyutu dağılımının β-hücre sferoidler kurtarıldı.

_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
Şekil 1. Adım büyüme Şematik tiyol-ene fotoğrafı tıklayın PEG-peptid konjugat oluşturmak için PEG4NB ve CGGYC kullanarak reaksiyon. Hidrojeller kimotripsin ile muamele hızla yok edilebilir.

Şekil 2,
Şekil 2. PEG4NB/CGGYC hidrojeller oluşan ilk canlılık ve hücre spheroid. (A) Ölü / canlı boyama foto-kapsülleme hemen ardından yapıldı. (B) Ölü / canlı boyama in vitro kültürün 10 gün sonra yapılır. MIN6 β-hücrelerinin Temsilcisi konfokal z-yığını görüntüler 4wt% PEG4NB/CGGYC hidrojeller (2 × 10 6 hücre / ml, scale = 100 mikron) kapsüllenir. Hücre canlılığı toplam hücre (yeşil + kırmızı) sayısı üzerinden canlı (yeşil) hücrelerin yüzdesi olarak tanımlandı. (2 × 10 6 hücre / ml, N = 4, ortalama ± SD).

Şekil 3
Şekil 3. MIN6 β-hücrelerinin metabolik aktivitesini AlamarBlue reaktifi (N = 3, ortalama ± SD) ile zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür. 2 at MIN6 3wt% kapsüllü β-hücreleri, 4wt ve% 5WT% PEG4NB/CGGYC hidrojeller × 10 6 hücre / ml.

Şekil 4,
Şekil 4. Kurtarıldı MIN6 β-hücre sferoidlerin Karakterizasyonu. Hücre sferoidler PEG4NB/CGGYC in vitro kültürün 10 gün sonra 40 uM kimotripsin kullanılarak ele geçmiştir. Kapsüllü β-hücre parçacıkları arasında (a) Örnek faz kontrastlı görüntü. Kurtarılan β-hücre parçacıkları arasında (b) Örnek faz kontrastlı görüntü. (C) Dağıtım of sfero çapları (Hücre yoğunluğu = 1 × 10 7 hücre / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Açıklanan protokol adım büyüme fotopolimerizasyon oluşturduğu tiyol-ene hidrojeller hücrelerin kolay kapsülleme ilgili ayrıntılar sunuyor. Tiol fonksiyonel grupların norbornen 1:1 bir stokiyometrik oran bu protokolde kullanılan iken, oran deneyler bağlı olarak ayarlanabilir. Doğru formülasyon ilave olarak, bu ön-polimer solüsyonu içinde homojenlik sağlamak için önemlidir. Özellikle, jel özellikleri hücre ve varyasyon topaklanma önlemek için çok hücre iyi ön polimer çözeltisi içinde dağıtılır sağlamak için yumuşak bir pipetleme kullanır. 2 dakika arasında bir süre polimerizasyon jel çapraz bağlama için kullanılmış olmasına rağmen, tiyol-ene hidrojellerinin jel noktasının en çok hücre-kapsülleme uygun formülasyonlar (örneğin, daha az 10 saniye olan, ağırlık olarak% 4 PEG4NB/CGGYC hidrojel için jel noktası 7 ± 2 5 saniye ve ağırlık olarak% 6 ± 1 saniye) 'dir. Bu hidrojel sistemin hızlı jelleşme hızla daha iyi cel ile sonuçlanan, yerinde hücreleri kilitleyen3D l dağıtım jel noktasına ulaşmaya dakika hatta saat sürebilir diğer fotopolimerizasyon şemaları ile karşılaştırıldığında. 7,20

Buna ek olarak, doğal olarak tiyol-ene hidrojeller oluşan β-hücre sferoidler kimotripsin-aracılı jel erozyon yoluyla elde edildi. Kimotripsin, ancak, tripsin aile ve yüksek konsantrasyon ya da bu enzimin uzun inkübasyon süresi içinde bir enzim olan negatif olarak hücre-hücre etkileşimleri etkileyen ya da hatta iyileşme sırasında küremsi mimari bozabilir. Bu potansiyel sınırlama önlemek için, hidrojel thiolated diğer substratlar ile çapraz bağlı olabilir ve jel erozyon hala istenmeyen hücre-hücre etkileşim neden olmayan uygun enzimler ile elde edilebilir.

Genel olarak, tiyol-ene hidrojeller 3D β-hücrelerinin çoğalmasını teşvik etmek için bir cytocompatible bir ortam sağlar. Bu sistem, kültür için kullanılan ve 3B, çeşitli hücre tiplerinin fizyolojik davranışını incelemek olabilir. Ayrıca,bu sistem daha fazla fonksiyonel ve biyolojik karakterize edilmesi için, hidrojel matrisi içinde oluşturulan hücre yapıları basit iyileşme sağlar. Bu farklı ve cytocompatible hidrojel sistemi rejeneratif tıp uygulamaları için mühendislik karmaşık 3D dokular için jel platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu proje NIH (R21EB013717) ve IUPUI OVCR (RSFG) tarafından finanse edildi. Yazar, teknik yardım için Bayan Han Shih teşekkürler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
  2. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
  3. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
  4. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
  5. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
  6. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
  7. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
  8. Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
  9. Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
  10. Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
  11. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
  12. Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
  13. Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
  14. Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
  15. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
  16. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
  17. Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
  18. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  19. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
  20. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter