Summary
Viabilidade celular depende de uma gestão eficiente e oportuna de misfolding proteína. Descrevemos aqui um método para a visualização dos diferentes destinos potenciais de uma proteína misfolded: redobramento, degradação, ou sequestração de inclusões. Nós demonstramos a utilização de um sensor de dobragem, Ubc9
Abstract
Uma das tarefas-chave de qualquer célula viva é manter a dobradura adequada de proteínas recém-sintetizadas em face da constante mudança das condições ambientais e de um ambiente intracelular que é hermeticamente embalados, pegajoso, e perigosos para a estabilidade da proteína 1. A capacidade de equilibrar dinamicamente a produção de proteínas, dobradura e degradação exige altamente especializado de máquinas de controle de qualidade, cuja absoluta necessidade é observada melhor quando avarias. Doenças como a esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, de Parkinson, e certas formas de fibrose cística tem um link direto para proteínas componentes de qualidade dobráveis de controle 2 e, portanto, o futuro desenvolvimento terapêutico requer um conhecimento básico de processos subjacentes. Nosso desafio experimental é entender como as células integram sinais de danos e de encontrar respostas que são adaptados às diversas circunstâncias.
A principal razão pela qual misfolding proteína representa um thre existencialem que a célula é a propensão de proteínas incorrectamente dobradas para agregado, causando assim uma perturbação global do aglomerado e delicado ambiente intracelular de dobragem 1. A saúde dobrar, ou "proteostasis", do proteoma celular é mantida, mesmo sob a pressão do envelhecimento, estresse e dano oxidativo, pela ação coordenada de diferentes unidades mecanicistas em um elaborado sistema de controle de qualidade 3,4. A maquinaria especializada de chaperonas moleculares podem ligar polipeptídeos não nativos e promover a sua dobragem para o estado nativo 1, orientá-las para a degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma 5, ou encaminhá-los para inclusões de agregação de protecção 6-9.
Em eucariotas, a agregação de carga citosólica de controlo de qualidade é partilhado entre dois compartimentos 8-10: o compartimento de controle de qualidade juxtanuclear (JUNQ) e do depósito de proteína insolúvel (IPOD) (Figura 1 - modelo).Proteínas que são ubiquitinadas pelo mecanismo de controlo de qualidade de proteínas de dobragem são entregues ao JUNQ, onde eles são tratados para degradação pelo proteassoma. Proteínas deformadas que não são ubiquitinadas são desviadas para o iPod, onde eles estão ativamente agregadas em um compartimento de proteção.
Até este ponto, o paradigma metodológico de live-célula de microscopia de fluorescência tem sido largamente às proteínas de etiqueta e rastrear suas localizações na célula específica em tempo de pontos e, geralmente, em duas dimensões. Como as novas tecnologias começaram a conceder experimentadores acesso sem precedentes à escala submicron em células vivas, a arquitetura dinâmica do citosol veio vista como uma fronteira novo e desafiador para a caracterização experimental. Apresenta-se um método para monitorizar rapidamente as distribuições espaciais em 3D de múltiplas proteínas marcadas com fluorescência no citosol de leveduras ao longo do tempo. Timelapse 3D (imagens 4D) não é apenas um desafio técnico; ratoela, também facilita uma mudança dramática na estrutura conceitual usada para analisar a estrutura celular.
Utilizamos uma proteína citosólica do sensor de dobragem em levedura viva para visualizar destinos diferentes para proteínas deformadas no controle de qualidade celular agregação, utilizando imagiologia 4D rápida fluorescente. O mutante sensível à temperatura da proteína Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) é extremamente eficaz, tanto como um sensor de proteostasis celular, e um modelo fisiológico para controle de rastreamento agregação qualidade. Tal como acontece com a maioria das proteínas ts, ts Ubc9 é totalmente dobrada e funcional, a temperaturas permissivas, devido à activas chaperones celulares. Acima de 30 ° C, ou quando a célula enfrenta estresse misfolding, Ubc9 misfolds ts e segue o destino de uma proteína nativa globular que foi misfolded devido a mutação, a desnaturação pelo calor, ou o dano oxidativo. Ao fundir a GFP ou fluoróforos outros, que podem ser rastreados em 3D, como se forma stress Foci, ou é didirigido a JUNQ ou iPod.
Protocol
1. Preparativos levedura
- Transformar as estirpes de levedura com um plasmídeo contendo uma cassete de GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ts).
- Crescer levedura em meio sintético contendo rafinose a 2% durante 24 horas e diluiu-se para trás a 2% de galactose para meios contendo 16 hr ou O / N. Incube as células a 30 ° C sob agitação a 200 rpm.
- Na manhã seguinte, dilui-se a estirpe de consulta a OD 600 = 0,2. Agita-se durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) até a cultura atingir DO600 = 0,8-1,0.
- Para reprimir a expressão (assim como para monitorar apenas a piscina já traduzido e dobrado de GFP-Ubc9 ts), meios de comunicação de mudança para meio sintético suplementado com 2% de glicose (SD) 30 min antes da imagem.
- Tratamento - choque térmico das células durante 20 min a 37 ° C para induzir a misfolding, ou continuamente em microscópio incubadora para seguir a agregação de proteínas em condições de choque térmico. Nota - se você estiver usando o microscópio em qualquer temperatura acima de RT, pré-aqueça o for cerca de 2 horas para equilibrar a temperatura ao longo do corpo do microscópio e dos objectivos (ver abaixo).
2. Placa \ Preparações slides
- Escolha apropriada na placa. A principal consideração é a capacidade de manter o foco durante a aquisição de imagem. Os seguintes pontos são fundamentais para a formação de imagens 4D e não para lapsos de tempo de imagem 2D ou 3D.
- Multiple poços de placa do fundo dos poços diferentes pode não ser homogénea (isto é, os poços serão em diferentes alturas em relação ao objectivo). Isto irá tornar mais difícil manter o foco em pontos xy e pontos de tempo, independentemente da técnica de auto-focagem sendo usado.
- Material de slide: vidro vs plástico. Lâminas de vidro de fundo são mais z-homogênea entre os poços, mas são mais caros.
- Espessura da parte inferior do prato: geralmente usamos lamela-bottom placas índice de 1,5, mas um índice também é aceitável dependendo do objetivo.
- Cover inferior da placa deslizante \ com ConA (0,25 mg / ml) durante 10 min. ConA é usado na adesão de células à corrediça, o que permite seguir uma única célula ao longo do tempo.
- Remover ConA e incubar a lâmina em uma capa química, de modo que o excesso de ConA vai evaporar.
- Ul placa 200 de amostra de levedura (DO600 = 0,5) para o ConAed bem.
- Incubar durante 15 min, de modo a permitir células aderem à superfície da placa.
- Extrai-se a meio e lavar três vezes com meio de novo para obter uma camada de células. Nota: se um lapso de tempo longo é planeado, as células semente de baixa densidade, de modo que novos brotos não vai encher e interrompem a região de interesse.
3. Preparativos microscópio
- Nós usamos um microscópio Nikon A1Rsi confocal com algumas modificações não-padrão. Para imagens levedura que usar até 4 lasers (405 nm, 50 mW de laser CUBE; 457-514 nm, 65 mW Argon Ion laser; 561 nm, 50 mW Sapphire laser, e 640 nm, 40 mW de laser CUBE), e até 4 PMTs equipados comfiltros. A maioria de nossa imagem é feito com um conjunto de filtros verde para EGFP e um conjunto de filtros vermelho para mCherry e tdTomato. Com GFP e mCherry há quase bleedthrough não, portanto, muitas vezes usamos a digitalização simultânea. No entanto, a linha de varrimento também pode ser utilizado para prevenir bleedthrough quando ela ocorrer. Nossa confocal está também equipado com um estágio Piezo PInano (MCL), que pode fazer 3 etapas mseg em z, permitindo-z 2-3 pilhas (30-50 secções) por segundo. O sistema também tem um detector espectral, o foco perfeito (laser offset), e dois scanners - um scanner galvano e um scanner de ressonância.
- Escolha objetivo adequado. Principais considerações:
- Água / objectiva de óleo / ar: a consideração principal é o índice de refracção do meio de imagiologia vs o meio da amostra.
- Objetivas vantagens de petróleo:
- Objetivos do petróleo pode ter maiores aberturas numéricas (óleo leve quebra mais do que água, e, portanto, mais fótons voltar para o objectivo). Objetivos do petróleo pode ter-sea NA 1,49, em comparação com 1,27 para a água. (No entanto, este não é realmente uma enorme diferença na resolução).
- O índice de refracção do óleo corresponde ao índice de refracção do vidro, pelo que não são perdidos fotões indo a partir da amostra, através do vidro, para o objectivo. (Nota - escolheu um óleo de imersão que tem um índice de refração que é adequado para o seu objetivo e sua lamela).
- Óleo permite livre de problemas longo de tempo, uma vez que os lapsos não evapora.
- Quanto maior for a resolução activado pelo aumento do NA dos objectivos do petróleo se degrada rapidamente a luz tem que viajar através de um meio aquoso (tal como uma célula).
- Imagens normalmente têm aberrações esféricas e mais uma "esticada" efeito em 3D.
- O óleo é pegajoso, confuso, e um perigo para a objetivos.
- Objetivas vantagens de água
- A célula é aquosa, portanto, há menos distorções na Z, And a resolução permanece elevada em profundidade uma amostra aquosa.
- Limpe e amigável. Água desvantagens objectivas: evapora rapidamente, portanto, não adequados para filmes longos sem arranjos especiais que estão sendo feitos para bombear a água de forma contínua para o objetivo.
- Vantagens objectivas ar: 1. Nenhum material é perdido / evapora durante a aquisição de múltiplos pontos ou um filme longo. 2. Limpe e amigável. Desvantagem: baixa resolução e sensibilidade do sinal baixo.
- Objetivas vantagens de petróleo:
- Temperatura ambiente e incubadora: temperatura mudança afeta propriedades da matéria, e em sistemas delicados muda o foco. A temperatura deve ser ajustada antes de escolher os pontos de aquisição. Alterando a temperatura durante a aquisição de imagem e vai perturbar irá resultar na perda de focagem. Deixamos que o nosso sistema de microscópio equilibrar durante 2 h à temperatura desejada antes de imagiologia.
- Colares de correção: objetivos Muitos vêm com um anel de correção possibilitandoo objetivo de ser ajustada para uma dada espessura tampa de deslizamento. Recomendamos ajustar o colar correção, enquanto usando partículas fluorescentes para visualizar a função de propagação do ponto. Isso irá garantir configurações corretas para cada amostra.
- Porta-amostras estáveis: descobrimos que a maioria dos titulares de amostras disponíveis comercialmente são a parte mais fraca do microscópio. Elas são muitas vezes vacilante e não em linha reta. Isso é um desastre para a alta-resolução, com vários pontos de imagens 4D. Nós projetamos nossos próprios porta-amostras que são retas e encaixar bem no palco. Eles também podem ser aparafusados para baixo, quando necessário.
- Multi-ponto de aquisição: o nosso sistema de imagem é equipado com o "Perfect foco" Nikon sistema, que é basicamente uma base de laser mecanismo de auto-foco. No entanto, de auto-focagem não é necessariamente necessário, com formação de imagens 4D, em especial, se o sistema não se desvia muito.
- Água / objectiva de óleo / ar: a consideração principal é o índice de refracção do meio de imagiologia vs o meio da amostra.
4. Imagem
- Ligue o sistema: lasers, palco, controlador, câmera e compusoftware ter.
- Colocar a placa no suporte palco, devidamente protegidas e estabilizada.
- Usar porta olho para determinar a localização ea orientação de levedura.
- Usando campo claro, avaliar a saúde e viabilidade celular de acordo com a forma e textura.
- Ligar a luz de epifluorescência de acordo com o fluoróforo relevante (por exemplo FITC filtro para GFP), e concentrar-se em células que apresentam o fenótipo que está sujeita a sua pesquisa. As células que são altamente fluorescentes em mais do que um comprimento de onda podem ser mortos e, por conseguinte, autofluorescente. Nós visualizar o núcleo com um fluoróforo tdTomato fundido com um NLS sinal SV40 (NLS-TFP). TFP é duas vezes o tamanho da GFP, e é, portanto, acima do limite de difusão do núcleo, pelo que funciona muito bem como um marcador nuclear. Podemos também excitam TFP com um laser (488 nm), simultaneamente, como verde GFP, mas recolher as emissões de verde e vermelho em dois PMTs separados para resolução espectral.
- Ajuste as seguintes configurações para minimizar o ruídoe supersaturação:
- Potência do laser - fotodegradação e fototoxicidade vs brilho da imagem deve ser considerada.
- Ganho: afeta a sensibilidade da câmera, portanto, relação sinal-ruído.
- Pinhole diâmetro - deve ser ajustada de acordo com o laser com o comprimento de onda mais curto. O diâmetro do furo de pino determina a espessura (altura) da secção óptica trabalhada. Assim, a abertura do buraco coletar mais luz (deixe em mais fótons), mas vai diminuir resolução em z (menos confocalidade).
- Dicas úteis:
- Se fluoróforos emitem comprimentos de onda diferentes congruente, use o recurso Detector espectral que permite a escolha de filtros virtuais. Tenha em mente que os detectores espectrais são menos sensíveis que PMTs regulares.
- Se fluoróforos diferentes estão animados com o mesmo laser, usar o recurso de verificação de linha.
- Um scanner Galvano permite mais sensibilidade, mas tem um risco maior de fotodegradação. Um scanner de ressonância permite um mais rápidoQUISIÇÃO, diminuindo assim o risco de fotodegradação, mas é menos sensível.
- Uma média de entre 2 e 16 imagens, aumenta a relação sinal-ruído, mas torna mais lenta a aquisição e, naturalmente, implica uma maior exposição da amostra para o laser.
- Duração de aquisição depende da questão biológica (por exemplo, formação e JUNQ IPOD leva ~ 2 horas). Temos fotografada fermento com o scanner de ressonância para até 30 h em 3D lapso de tempo.
- Time Lapse intervalos menores-intervalos irá criar um filme mais coerente, mas pode causar foto de branqueamento e, portanto, perda de sinal.
Representative Results
Figura 1. Modelo:. Sub-celular compartimentalização de proteínas deformadas máquinas controle de qualidade direciona proteínas deformadas em compartimentos distintos, com funções distintas: proteínas solúveis, alvo de degradação, sofrem ubiquitinação-poli e são enviados para o XTA-N uclear Ju Q ualidade compartimento de controle (JUNQ ). Proteínas insolúveis que não pode ser ubiquitinadas são enviados para o sequestro de proteção para o I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), ao lado do vacúolo, onde se submetem a agregação ativa.
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Figura 2. Misfolding modelagem proteína com GFP-Ubc9 ts. Em condições normais, GFP-Ubc9 ts (verde) é nativamente dobrado, e está localizada difusamente no núcleo e citoplasma. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). Expressão de Ubc9 ts foi desligado pela adição de 2% de glicose antes de imagem em todos os experimentos. Clique aqui para ver maior figura .
- Após a mudança de temperatura para 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (verde) é misfolded e forma Foci stress citosólica. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho).
- Após a recuperação do choque térmico a 23 ° C, o termicamente desnaturadas GFP-Ubc9 ts é degradada, tal como indicado pela diminuição do nível de fluorescência.
- Após a mudança de temperatura para 37 C e a inibição do proteassoma ° com 80 Mm MG132, GFP-U Bc9 ts é misfolded e transformado em JUNQ e inclusões IPOD. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho).
- Após a mudança de temperatura para 37 ° C e a inibição de ubiquitinação, GFP-Ubc9 ts é misfolded e processados para a inclusão IPOD. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). A Protease Ubiquitina 4 (Ubp4) é sobre-expresso para bloquear Ubc9 ubiquitinação ts.
Figura 3. Lapso de tempo de formação e JUNQ IPOD. Ao mudança de temperatura para 37 ° C e a inibição de proteassoma com 80 Mm MG132, GFP-Ubc9 Foci stress ts são processadas em JUNQ e inclusões IPOD. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). Imagens 3D foram adquiridas em intervalos de 4 minutos. (Veja também o filme 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
Discussion
Nossas intuições sobre processos bioquímicos derivar a partir de experiências de bancada de topo em que uma solução bem misturada dos reagentes e produtos é permitido para atingir o equilíbrio num copo. Em tal situação, a concentração de uma espécie química dadas pode ser expresso como um número único, que é a razão entre a quantidade molar de moléculas a um volume macroscópico. Muito do que sabemos sobre a estrutura e função das proteínas deriva da utilização de métodos que refletem o clássico, imagem reação em massa: borrões ocidentais, centrifugações e medições espectrofotométricas realizadas em extratos de homogeneizados de populações inteiras de células.
Como a tecnologia que usamos para olhar para as células sob a ampliação melhora aos trancos e barrancos, torna-se cada vez mais claro que as condições em que a maioria das reações bioquímicas ocorrem in vivo ter apenas a menor semelhança aos do cenário clássico de bancada. Não só é o interior da cella densamente ambiente, em que os efeitos aglomeração altera substancialmente as actividades dos vários reagentes, também é o oposto de bem misturado. Isso explica a disparidade frequente entre in vitro e in vivo em eficiências de uma grande variedade de reacções macromoleculares complexos.
Em nenhum lugar são intuições decorrentes de experimentos in vitro clássica bioquímicos mais propensas a enganar como em questões referentes ao vivo em dobrar, misfolding e agregação de proteínas. Considerando que os estudos de química de proteínas em reações em massa pode tratar a questão de dobrar para uma determinada proteína como um simples sim ou não questão, qualquer tentativa de acompanhar a dinâmica de populações inteiras de macromoléculas em uma célula viva deve ser sensível a toda a distribuição de possíveis resultados conformacionais disponíveis para uma cadeia polipeptídica, e em particular para o risco de misfolding e agregação. Por exemplo, podemos examinar uma célula ly grossosate a agregação de uma proteína de transferência de western, e determinar que a proteína é essencialmente insolúvel e não ubiquitinated. No entanto, em células vivas de um discreto sub-população da proteína, é difícil detectar quando a média sobre muitas células, podem ser solúveis e ubiquitinated num compartimento especial, quando a concentração local das espécies é extremamente elevado. O último caso pode ter consequências mais importantes para a viabilidade da célula do que a maior massa sub-população. Além disso, enquanto chaperones exibir uma variedade de comportamentos e funções pleiotrópicas, in vitro, torna-se evidente que, na célula suas funções discretas são espacialmente e temporalmente limitado.
No paradigma emergente para a compreensão da bioquímica, a concentração se torna uma propriedade de cada variável específica nano-ambiente na célula, e os acontecimentos moleculares que estão na base dos processos biológicos devem ser ensaiadas não apenas no tempo, mas também em space. A imagiologia 4D abordagem aqui apresentada permite a modelagem sensível do enrolamento incorrecto da proteína em células vivas, no entanto, pode ser usado para estudar qualquer número de outros processos biológicos e de como eles são regulados no espaço, o tempo, e na sequência de alterações das condições ambientais. Neste trabalho, o uso do sensor Ubc9 ts dobrável, que demonstra eficazmente as fases e as opções para se lidar com o início da agregação de proteínas no citosol. Além de ilustrar a biologia celular de agregação de controlo de qualidade, esta abordagem pode servir como uma ferramenta poderosa para decifrar o efeito das perturbações específicas ou mutações genéticas em proteostasis (por exemplo Ubc9 ts podem ser usados para medir a proteína de stress de dobragem em resposta à oxidação, a expressão de um agregado tóxico, ou mutações na via de controlo de qualidade).
Formação de imagens 4D também é essencial para determinar com precisão a localização de proteínas ou de co-localização entre duas proteínas diferentess, e para a detecção de fenômenos que talvez ser transitórios, mas importante. Por exemplo, especialmente em um pequeno organismo esférico, tais como levedura, que pode parecer ser o caso de que uma estrutura ou agregado tem localização juxtanuclear, enquanto que imagens 4D pode revelar que este é simplesmente um artefacto do ângulo de inspecção.
No experimento de exemplo apresenta-se aqui, que demonstram a utilização de um modelo de proteína misfolded, Ubc9 ts, a seguir a agregação de controle de qualidade ao longo do tempo e espaço no citosol. À temperatura permissiva, Ubc9 ts é dobrada e difundida no núcleo e citosol. Após induzida pelo calor misfolding, inicialmente forma rápida difusão de focos pequenos agregados de estresse que são processados para a degradação proteosomal. Quando o proteassoma é parcialmente inibida, estes focos de stress são convertidos em JUNQ e inclusões IPOD ao longo de cerca de 2 horas. Se degradação mediada por ubiquitina não está disponível como uma opção de controlo de qualidade, Ubc9 ts é imediatamente redirecionado para a inclusão IPOD para agregação de proteção. Essas ferramentas oferecem oportunidades incríveis para descobrir novos fatores genéticos envolvidos na agregação de controle de qualidade, e explorar a sua regulação espacial e temporal na célula.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60x water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
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References
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