Summary
Vitalità cellulare dipende dalla gestione puntuale ed efficiente di misfolding. Qui si descrive un metodo per la visualizzazione dei destini diversi potenziali di un misfolded proteine: ripiegamento, degradazione, o sequestro in inclusioni. Dimostriamo l'uso di un sensore di piegatura, Ubc9
Abstract
Uno dei compiti principali di ogni cellula vivente è mantenere il ripiegamento corretto delle proteine di nuova sintesi di fronte a condizioni ambientali mutevoli e un ambiente intracellulare che è strettamente imballati, appiccicoso, e pericolosi per la stabilità della proteina 1. La capacità di bilanciare dinamicamente produzione di proteine, piegatura e la degradazione richiede altamente specializzato macchine a controllo di qualità, la cui assoluta necessità si osserva meglio in caso di malfunzionamento. Malattie come la SLA, l'Alzheimer, il Parkinson, e alcune forme di fibrosi cistica hanno un collegamento diretto con componenti di qualità pieghevoli controllo proteine 2, e quindi il futuro sviluppo terapeutico richiede una conoscenza di base dei processi sottostanti. La nostra sfida sperimentale è quello di capire come le cellule integrare i segnali di danni e montare le risposte su misura per le diverse circostanze.
Il motivo principale per cui misfolding rappresenta un thre esistenzialea alla cella è la propensione di proteine non correttamente ripiegate per aggregare, causando una perturbazione globale del affollato e delicato ambiente intracellulare pieghevole 1. La salute piegatura, o "proteostasis," del proteoma cellulare viene mantenuta, anche sotto la costrizione di invecchiamento, stress e danno ossidativo, mediante l'azione coordinata di diverse unità meccanicistiche in un complesso sistema di controllo di qualità 3,4. Un macchinari specializzati di chaperon molecolari possono legarsi non nativi polipeptidi e promuovere la loro piegatura nello stato nativo 1, loro destinazione per la degradazione del sistema ubiquitina-proteasoma 5, o indirizzarli a inclusioni di aggregazione di protezione 6-9.
Negli eucarioti, la qualità citosolico carico aggregazione controllo è partizionato tra due compartimenti 8-10: il vano juxtanuclear controllo di qualità (JUNQ) e il deposito proteina insolubile (IPOD) (Figura 1 - modello).Proteine che sono ubiquitinate dalla piegatura macchine controllo qualità delle proteine vengono consegnati al JUNQ, dove vengono elaborati per la degradazione da parte del proteasoma. Proteine mal ripiegate che non sono ubiquinate vengono deviate al IPOD, dove sono attivamente aggregati in un vano di protezione.
Fino a questo punto, il paradigma metodologico di live-cell microscopia a fluorescenza è stato in gran parte alle proteine etichette e seguire le loro posizioni nella cella specifica time-point e di solito in due dimensioni. Come le nuove tecnologie hanno iniziato a concedere un accesso senza precedenti sperimentatori alla scala submicron in cellule viventi, l'architettura dinamica del citosol è entrato in vista come una frontiera sfida nuova per la caratterizzazione sperimentale. Presentiamo un metodo per monitorare rapidamente le distribuzioni 3D spaziali di più proteine fluorescenti marcate nel citosol lievito nel tempo. 3D timelapse (4D) non è solo una sfida tecnica; rattolei, facilita anche un radicale cambiamento nella struttura concettuale utilizzata per analizzare la struttura cellulare.
Utilizziamo una proteina citosolica sensore pieghevole in lieviti vivi per visualizzare destini diversi per le proteine mal ripiegate nel cellulare il controllo di qualità di aggregazione, con una rapida imaging a fluorescenza 4D. Il mutante termosensibile della proteina Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) è estremamente efficace sia come sensore di proteostasis cellulare, e un modello fisiologico per il controllo di qualità di tracciamento aggregazione. Come la maggior parte delle proteine ts, ts Ubc9 è completamente piegata e funzionale a temperature permissive a causa di attivi accompagnatori cellulari. Oltre 30 ° C, o quando la cellula deve affrontare lo stress misfolding, UBC9 misfolds ts e segue il destino di una proteina globulare nativa che è stato misfolded dovuta ad una mutazione, denaturazione al calore, o di danno ossidativo. Attraverso la fusione di GFP o altri fluorofori, può essere monitorato in 3D perché forma stress Foci, o è directed a JUNQ o IPOD.
Protocol
1. Lievito Preparazione
- Trasforma ceppi di lievito con un plasmide che porta un GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ts) cassetta.
- Crescere lievito in supporti sintetici contenenti il 2% raffinosio per 24 ore e ritorno diluito al 2% galattosio supporti contenenti, per 16 ore o di O / N. Incubare le cellule a 30 ° C agitando a 200 rpm.
- La mattina seguente, diluire il ceppo query per OD 600 = 0,2. Agitare per 4-6 ore a 30 ° C (200 rpm) fino a che la coltura raggiunga OD 600 = 0,8-1,0.
- Per reprimere l'espressione (in modo da monitorare solo la piscina già tradotto e piegato di GFP-Ubc9 ts), supporto cambio a supporti sintetici integrati con 2% di glucosio (SD) 30 minuti prima di imaging.
- Trattamento - shock termico le cellule per 20 min a 37 ° C per indurre misfolding o permanente, in incubatore microscopio a seguire aggregazione di proteine da shock termico in condizioni. Nota - se si utilizza il microscopio a qualsiasi temperatura sopra la TA, pre-riscaldamento for circa 2 ore per equilibrare la temperatura lungo il corpo del microscopio e gli obiettivi (vedi sotto).
2. Piatto \ preparati su vetrino
- Scegliere piatto appropriato. La considerazione principale è la capacità di mantenere la concentrazione durante l'acquisizione di immagini. I seguenti punti sono fondamentali per l'imaging 4D e non per il time-lapse immagini 2D o 3D.
- Multiple pozzetti di piastra fondo dei pozzetti differenti possono non essere omogeneo (cioè il pozzetti saranno ad altezze diverse rispetto all'obiettivo). Questo renderà difficile mantenere attivo attraverso punti xy e punti di tempo, indipendentemente dalla tecnica utilizzata fuoco automatica.
- Materiale Slide: vetro contro plastica. Diapositiva su vetro fondo sono più z-omogeneo tra i pozzi, ma sono più costosi.
- Spessore della parte inferiore della piastra: di solito uso coprioggetto con fondo piastre indice di 1,5, ma indice 1 è accettabile anche a seconda dell'obiettivo.
- Cover inferiore della piastra \ vetrino con ConA (0,25 mg / ml) per 10 min. ConA usato per far aderire le cellule alla slitta, che permette a seguito di una singola cella nel tempo.
- Rimuovere ConA e incubare il vetrino in una cappa chimica in modo che ConA eccesso evaporare.
- Piastra 200 microlitri di campione lievito (OD 600 = 0.5) nella ConAed bene.
- Incubare per 15 minuti, per consentire cellule aderire alla superficie della piastra.
- Estrarre il supporto, e lavare tre volte con nuovo mezzo per ottenere uno strato di cellule. Nota: se un lasso di tempo lungo è previsto, seme le cellule scarsamente in modo che nuovi germogli non si riempirà e interrompere la regione di interesse.
3. Microscopio Preparazioni
- Usiamo un microscopio confocale Nikon A1Rsi con poche modifiche non standard. Per l'imaging lievito che usiamo fino a 4 laser (405 nm, 50 mW laser CUBE, 457-514 nm, 65 mW laser a ioni argon, 561 nm, 50 mW Sapphire laser, e 640 nm, 40 mW CUBE laser), e fino a 4 PMT dotatifiltri. La maggior parte del nostro dell'imaging avviene con filtro verde per EGFP e un insieme filtro rosso per mCherry e tdTomato. Con la GFP e mCherry non c'è quasi bleedthrough, pertanto si usano spesso la scansione simultanea. Tuttavia, la linea di scansione può essere utilizzato anche per prevenire bleedthrough quando si verifica. Nostro confocale è inoltre dotato di uno stadio PInano Piezo (MCL), che può fare 3 passaggi msec in z, consentendo 2-3 z-stacks (30-50 sezioni) al secondo. Il sistema ha anche un rivelatore spettrale, fuoco perfetto (laser offset), e due scanner - uno scanner e un galvano scanner risonante.
- Scegliere obiettivo appropriato. Considerazioni principali:
- Acqua / olio / aria obiettivo: la considerazione principale è l'indice di rifrazione del mezzo di imaging vs mezzo del campione.
- Olio oggettivi vantaggi:
- Obiettivi di olio possono avere maggiori aperture numeriche (olio leggero pause più dell'acqua, e fotoni quindi più tornare all'obiettivo). Obiettivi di olio possono avere finodi NA 1.49, rispetto a 1,27 per l'acqua. (Tuttavia, questo non è effettivamente una grande differenza nella risoluzione).
- L'indice di rifrazione di olio corrisponde l'indice di rifrazione del vetro, quindi non si perdono fotoni andando dal campione, attraverso il vetro, l'obiettivo. (Nota - ha scelto un olio di immersione che ha un indice di rifrazione che è appropriato per il vostro obiettivo e la vostra coprioggetto).
- Olio permette senza problemi lungo di tempo decade in quanto non evapora.
- La risoluzione superiore abilitata dal NA superiore di obiettivi olio degrada rapidamente se la luce deve viaggiare attraverso un mezzo acquoso (ad esempio una cella).
- Immagini in genere hanno più aberrazioni sferiche e "disteso" effetto in 3D.
- Il petrolio è appiccicoso, disordinato, e un pericolo per obiettivi.
- Acqua oggettivi vantaggi
- La cellula stessa è acquosa, quindi ci sono meno distorsioni in z, and la risoluzione rimane alta profondità in un campione acquoso.
- Pulire e facile da usare. Acqua svantaggi oggettivi: evapora rapidamente, quindi non adatto per i film lunghi senza accordi speciali compiuti per pompare l'acqua di continuo allo scopo.
- Vantaggi oggettivi aria: 1. Nessun materiale è perso / evapora durante l'acquisizione punto multipla o un film lungo. 2. Pulire e facile da usare. Svantaggi: bassa risoluzione e sensibilità segnale basso.
- Olio oggettivi vantaggi:
- Temperatura ambiente e incubatore: temperatura cambia influisce sulle proprietà della materia, e in sistemi delicati cambia la messa a fuoco. La temperatura deve essere regolata prima di scegliere i punti per l'acquisizione. Modifica della temperatura durante l'acquisizione delle immagini e interromperà comporterebbe la perdita di messa a fuoco. Abbiamo lasciato il nostro sistema microscopio equilibrare per 2 ore alla temperatura desiderata prima di imaging.
- Collari di correzione: molti obiettivi sono dotati di un anello di correzione che consentel'obiettivo di essere regolato per una data copertura antiscivolo spessore. Si consiglia di regolare il collare di correzione durante l'utilizzo di perline fluorescenti per visualizzare la funzione di diffusione del punto. Ciò garantirà impostazioni corrette per ogni campione.
- Portacampioni stabili: si scopre che la maggior parte dei porta-campioni disponibili in commercio sono la parte più debole del microscopio. Sono spesso traballante e non diritto. Questo è un disastro ad alta risoluzione, multi-point di imaging 4D. Progettiamo i nostri porta-campioni che sono propri diritti e aderire perfettamente sul palco. Possono anche essere serrato giù quando necessario.
- Multi-point di acquisizione: il nostro sistema di imaging è equipaggiato con la Nikon "perfetta messa a fuoco" del sistema, che è fondamentalmente un laser a base di meccanismo di messa a fuoco automatica. Tuttavia, messa a fuoco automatica non è necessariamente necessario con imaging 4D, specialmente se il sistema non deriva molto.
- Acqua / olio / aria obiettivo: la considerazione principale è l'indice di rifrazione del mezzo di imaging vs mezzo del campione.
4. Imaging
- Accendere il sistema: laser, stage, controller, telecamera e computer software.
- Collocare la piastra di supporto palco, perfettamente fissati e stabilizzati.
- Utilizzare la porta occhio per determinare la posizione e l'orientamento di lievito.
- Usando chiaro, valutare la salute e la vitalità cellulare in base alla forma e consistenza.
- Accendere la luce epifluorescente secondo il fluoroforo corrispondente (per esempio FITC filtro per GFP), e concentrarsi sulle cellule che espongono il fenotipo che è soggetto alla tua ricerca. Cellule che sono altamente fluorescenti in più di una lunghezza d'onda può essere morto e quindi autofluorescente. Abbiamo visualizzare il nucleo con un fluoroforo tdTomato fuse ad una NLS SV40 segnale (NLS-TFP). TFP è il doppio di GFP, e quindi al di sopra del limite di diffusione del nucleo, quindi funziona molto bene come marcatore nucleare. Possiamo anche eccitare TFP con un verde (488 nm) del laser simultaneamente come GFP, ma raccogliere le emissioni verde e rosso in due PMT separate per risoluzione spettrale.
- Regolate le seguenti impostazioni per ridurre al minimo il rumoree sovrasaturazione:
- Potenza laser - photobleaching e fototossicità vs luminosità dell'immagine deve essere considerata.
- Guadagno: colpisce la sensibilità della telecamera, quindi Rapporto segnale-rumore.
- Diametro pinhole - deve essere regolata in base al laser con lunghezza d'onda più corta. Il diametro del foro determina lo spessore (altezza) della sezione ottica ripreso. Così, aprendo il foro stenopeico raccoglie più luce (per non più fotoni in), ma diminuisce risoluzione in z (meno confocality).
- Consigli utili:
- Se fluorofori diversi emettono lunghezze d'onda congruente, utilizzare la funzione spettrale del rivelatore che permette la scelta di filtri virtuali. Tenete a mente che i rilevatori spettrali sono meno sensibili PMT regolari.
- Se diversi fluorofori sono eccitati dal laser stesso, utilizzare la funzione di scansione in linea.
- Uno scanner Galvano consente maggiore sensibilità, ma ha un rischio più elevato per photobleaching. Uno scanner di risonanza consente una più velocecquisition, riducendo così il rischio di photobleaching, ma è meno sensibile.
- Media tra 2 e 16 immagini, esalta rapporto segnale-rumore, ma rende acquisizione più lento e, naturalmente, comporta una maggiore esposizione del campione al laser.
- Durata della acquisizione dipende dalla domanda biologici (ad esempio JUNQ e formazione IPOD prende ~ 2 ore). Abbiamo ripreso il lievito con lo scanner di risonanza per un massimo di 30 ore in 3D time-lapse.
- Tempo lapse-intervalli più piccoli intervalli creerà un film più coerente, ma può causare foto sbiancamento e quindi perdita di segnale.
Representative Results
Figura 1. Modello:. Sub-cellulare compartimentalizzazione di proteine mal ripiegate di comando delle macchine di qualità dirige le proteine mal ripiegate in compartimenti distinti con funzioni distinte: proteine solubili, mirati per la degradazione, sottoposti a poli-ubiquitinazione e vengono inviati al XTA-N vano Ju ucleare controllo Q ualità (JUNQ ). Proteine insolubili che non possono essere ubiquinate vengono inviati per sequestro di protezione al I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), adiacente al vacuolo, dove subiscono aggregazione attiva.
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Figura 2. Modellazione misfolding con GFP-Ubc9 ts. In condizioni normali, GFP-Ubc9 ts (verde) è nativamente piegato, ed è localizzata diffusamente nel nucleo e il citoplasma. Il nucleo è etichettato da NLS-TFP (rosso). L'espressione di Ubc9 ts è stato spento con l'aggiunta del 2% di glucosio prima di imaging in tutti gli esperimenti. Clicca qui per ingrandire la figura .
- Al cambio di temperatura a 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (verde) è misfolded e forma citosolica Foci dello stress. Il nucleo è etichettato da NLS-TFP (rosso).
- Dopo il recupero da shock termico a 23 ° C, la termicamente denaturata GFP-Ubc9 ts è degradato, come indicato dalla diminuzione del livello di fluorescenza.
- Al cambio di temperatura a 37 ° C e l'inibizione del proteasoma MG132 con 80 Mm, GFP-U BC9 ts è misfolded e trasformati in JUNQ e inclusioni IPOD. Il nucleo è etichettato da NLS-TFP (rosso).
- Su cambiamento di temperatura a 37 ° C e l'inibizione ubiquitinazione, GFP-Ubc9 ts è misfolded e trasformato in dell'inclusione IPOD. Il nucleo è etichettato da NLS-TFP (rosso). La proteasi ubiquitina 4 (Ubp4) è iperespresso per bloccare Ubc9 ubiquitinazione ts.
Figura 3. Lasso di tempo di JUNQ e formazione IPOD. Dopo cambio di temperatura a 37 ° C e l'inibizione del proteasoma MG132 con 80 Mm, GFP-UBC9 Foci stress ts vengono trasformati in JUNQ e inclusioni IPOD. Il nucleo è etichettato da NLS-TFP (rosso). Le immagini 3D sono state acquisite ad intervalli di 4 min. (Vedi anche video 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Discussion
Le nostre intuizioni sui processi biochimici derivano da esperimenti da banco in cui è consentito un ben miscelato soluzione di reagenti e prodotti per raggiungere l'equilibrio in un bicchiere. In tale contesto, la concentrazione di una specie chimiche che può essere espressa come un numero unico, che è il rapporto di una quantità molare di molecole ad un volume macroscopico. Molto di ciò che sappiamo sulla struttura e funzione delle proteine deriva da usare metodi che riflettano il classico, foto di massa di reazione: Western blot, centrifugazioni, e misurazioni spettrofotometriche effettuate su estratti di omogenati di intere popolazioni di cellule.
Poiché la tecnologia che usiamo per osservare le cellule sotto ingrandimento aumenta a passi da gigante, diventa sempre più chiaro che le condizioni in cui le reazioni più biochimiche avvengono in vivo portano solo la minima somiglianza con quelli dello scenario classico banco. Non solo l'interno della celLa densamente ambiente, in cui effetti affollamento modificare sostanzialmente le attività dei vari reagenti, è anche l'opposto di ben miscelato. Questo spiega la disparità tra frequente in vitro e in vivo l'efficienza di una vasta gamma di reazioni macromolecolari complessi.
Da nessuna parte sono intuizioni derivanti da esperimenti in vitro classica biochimici più inclini ad indurre in errore, come nelle questioni relative alla piegatura in vivo, misfolding e aggregazione di proteine. Considerando che gli studi di chimica delle proteine nelle reazioni rinfusa può trattare il problema di piegatura per una data proteina, come un semplice sì o no domanda, qualsiasi tentativo di rintracciare le dinamiche di popolazioni di macromolecole in una cella vivo deve essere sensibile alla distribuzione intera possibili risultati conformazionali disponibili per una catena polipeptidica, e in particolare al rischio di misfolding e aggregazione. Per esempio, si potrebbe esaminare un ly massa cellularesate di una proteina aggregazione mediante western blotting, e determinare che la proteina è principalmente insolubile e non ubiquitinate. Tuttavia, in una cellula vivente discreto sub-popolazione della proteina, difficile da rilevare quando la media su molte cellule, possono essere solubili e ubiquitinato in un compartimento particolare quando la concentrazione locale di specie è estremamente elevata. Lo scenario quest'ultimo può avere conseguenze più importanti per la vitalità della cellula che la maggior parte più grande sotto-popolazione. Inoltre, considerando che accompagnatori visualizzare una varietà di comportamenti pleiotropici e funzioni in vitro, sta diventando evidente che nella cella loro funzioni discrete sono spazialmente e temporalmente confinata.
Nel paradigma emergente per la comprensione biochimica, concentrazione diventa una proprietà variabile di ciascuna specifica nano-ambiente nella cella, e gli eventi molecolari che sottendono processi biologici devono essere analizzati non solo nel tempo, ma anche in space. L'approccio qui presentato imaging 4D consente la modellazione sensibile misfolding in cellule vive, anche se può essere usato per studiare un numero qualsiasi di altri processi biologici e come vengono regolati nello spazio, il tempo, e dopo cambiamenti delle condizioni ambientali. In questo lavoro si usa il sensore Ubc9 pieghevole ts, che dimostra in modo efficace le fasi e le opzioni per trattare con l'insorgenza di aggregazione proteica nel citosol. Oltre a illustrare biologia cellulare del controllo di qualità aggregazione, questo approccio può servire come un potente strumento per decifrare l'effetto di perturbazioni specifici o mutazioni genetiche sulla proteostasis (per esempio Ubc9 ts può essere utilizzato per misurare lo stress ripiegamento delle proteine in risposta a ossidazione, l'espressione di un aggregato tossici, o mutazioni nella via di controllo qualità).
Imaging 4D è essenziale anche per determinare con precisione la localizzazione delle proteine o colocalizzazione tra due proteine diverses, e per la rilevazione di fenomeni che forse essere transitoria ma importante. Per esempio, specialmente in un organismo sferico piccolo come il lievito, può sembrare essere il caso che una struttura o aggregata ha localizzazione juxtanuclear, mentre 4D può rivelare che questo è semplicemente un artefatto dell'angolo di ispezione.
Nell'esperimento di esempio abbiamo qui presenti, ci viene illustrato l'utilizzo di un modello di proteine mal ripiegate, Ubc9 ts, a seguire il controllo di qualità di aggregazione nel tempo e nello spazio nel citosol. Alla temperatura permissiva, Ubc9 ts è piegato e diffusa nel nucleo e citoplasma. Al indotta dal calore misfolding, forma inizialmente rapidamente diffondendo piccoli Foci stress aggregati che vengono elaborati per la degradazione proteasoma. Quando il proteasoma è parzialmente inibita, questi Foci stress sono convertiti in JUNQ e inclusioni IPOD nel corso di circa 2 ore. Se ubiquitina-mediata degradazione non è disponibile come opzione di controllo della qualità, Ubc9 ts viene immediatamente re-indirizzato all'inclusione IPOD per l'aggregazione di protezione. Questi strumenti offrono incredibili opportunità di scoprire nuovi fattori genetici coinvolti nel controllo di qualità di aggregazione, e di esplorare la loro regolazione spaziale e temporale nella cella.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60x water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
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References
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