Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Published: April 5, 2013 doi: 10.3791/50083
* These authors contributed equally

Summary

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını göstermek

Abstract

Herhangi bir canlı hücrenin önemli görevlerinden biri sürekli değişen çevre koşulları ve intraselüler ortamda sıkışık olduğunu, yapışkan ve protein stabilitesinin 1 için tehlikeli karşısında yeni sentezlenen proteinlerin doğru katlanır sürdürmektedir. Dinamik protein üretimi, katlama ve yıkımı denge yeteneği olan mutlak bir zorunluluk zaman arızalar iyi görülmektedir yüksek uzman kalite kontrol amaçlı, ister. Böyle ALS, Alzheimer, Parkinson ve Kistik Fibrozis bazı şekilleri gibi hastalıklar protein katlanması kalite kontrol bileşenleri 2 doğrudan bir bağlantı vardır ve bu nedenle gelecekteki terapötik gelişme temel süreçlerin temel bir anlayış gerektirir. Bizim deneysel meydan hücreleri hasara sinyalleri entegre ve farklı koşullara uyarlanmış tepkileri monte nasıl anlamaktır.

Protein misfolding varoluşsal thre temsil neden birincil sebebihücreye de agrega için yanlış katlanmış proteinlerin eğilimi böylece kalabalık ve hassas intraselüler Katlama ortamının 1 küresel bir pertürbasyon neden olduğunu. Katlama sağlık veya hücresel proteomun "proteostasis," ayrıntılı bir kalite kontrol sistemi 3,4 farklı mekanistik birimlerin koordineli eylemi tarafından, hatta yaşlanma, stres ve oksidatif hasarın baskı altında tutulur. Moleküler chaperones bir uzman makine yerli olmayan polipeptitler bağlamak ve yerel devlet 1 içine katlanabilir teşvik edebilir, ubikuitin-proteazom sistemi 5 tarafından bozulması için onları hedef, ya da koruyucu toplama kapanımlar 6-9 yönlendirmek.

Juxtanuclear kalite kontrol bölmesi (JUNQ) ve çözünmeyen protein yatağı (IPOD) (- modeli Şekil 1): Ökaryotlarda sitosolik toplama kalite kontrol yük iki bölme 8-10 arasında bölüştürüldü.Protein katlanması kalite kontrol makine tarafından Ubikitine proteinler onlar proteozom tarafından yıkımı için işlenir JUNQ, teslim edilir. Ubikitine değildir katlanan proteinleri, aktif bir koruyucu bölmeye toplanır IPOD, yönlendirilir.

Bu noktaya kadar, canlı hücre floresan mikroskop metodolojik paradigması büyük ölçüde etiket proteinlere olmuştur ve iki boyutta zaman noktalarında ve genellikle belirli bir noktadaki hücre içindeki konumları izlemek. Yeni teknolojiler canlı hücrelerde deneyciler Mikronaltı ölçeğine görülmemiş erişim izni başladı gibi, sitoplazmada dinamik mimarisi deneysel karakterizasyonu için zorlu bir yeni sınır olarak görünümü haline gelmiştir. Hızla saat boyunca maya sitozol içinde birden fazla fluoresan etiketli proteinlerin 3D mekansal dağılımları izlenmesi için bir yöntem sunmaktır. 3D timelapse (4D görüntüleme) değil, sadece teknik bir sorundur; sıçanOnu, o da hücresel yapısının incelenmesinde kullanılan kavramsal çerçeve içinde dramatik bir değişim kolaylaştırır.

Biz hızlı 4D floresan görüntüleme kullanarak, hücresel agregasyon kalite kontrol katlanan proteinleri için ayrı kaderi görselleştirmek için canlı maya sitozolik bir katlama sensörü proteini kullanır. Ubc9 protein 10-12 (Ubc9 TS) ısı duyarlı mutant hücresel proteostasis bir sensörü, ve izleme toplama kalite kontrolü için bir fizyolojik örnek olarak her ikisi son derece etkilidir. Çoğu ts proteinlerde olduğu gibi, Ubc9 ts aktif hücresel şaperonlar nedeniyle ılımlı sıcaklıklarda tamamen katlanmış ve işlevseldir. 30 ° C üzerinde ya da hücre misfolding stres, Ubc9 ts misfolds yüzler ve mutasyon, ısı denatürasyon, ya da oksidatif hasara bağlı olarak katlanan olan bir yerli proteinin küresel kader izlediğinde. O Stres Foci oluşturur, ya da olduğu gibi fırınlarında bu GFP veya diğer floroforlar için, 3D izlenebilir diJUNQ veya IPOD için düzeltilmelidir.

Protocol

1. Maya Hazırlıklar

  1. Bir gal1-GFP-Y68L (UBC9 ts) kaseti taşıyan plazmid ile maya suşları Transform.
  2. 16 saat veya O / N için 24 saat süreyle% 2 rafinoz içeren sentetik medya maya büyümek ve geri% 2 galaktoz içeren ortam seyreltilir 200 rpm'de sallama sırasında 30 ° C 'de hücreler inkübe edin.
  3. Ertesi sabah, OD 600 = 0.2 için sorgu zorlanma sulandırmak. Kültürü = 0.8-1.0 OD 600 ulaşıncaya kadar 30 ° C (200 rpm) 4-6 saat boyunca çalkalayınız.
  4. Ifade (yani GFP-Ubc9 ts sadece zaten tercüme ve katlanmış havuzu izlemek için),% 2 glukoz (SD) öncesi görüntüleme için 30 dk ile takviye sentetik ortam değişikliği medya bastırmak için.
  5. Tedavi - Isı şoku 37, 20 dakika için hücreler ° C misfolding indüklemek için, ya da sürekli olarak ısı-şok protein birleştirme koşulları izlemek için mikroskop kuluçka makinesi içinde. Not - RT, ön ısıtma fo üzerinde herhangi bir sıcaklıkta mikroskop kullanıyorsanızmikroskop ve hedeflerinin gövdesi (bkz. aşağıda) boyunca sıcaklık denge sağlaması için 2 saat yaklaşık r.

2. Tabak \ Slayt Hazırlıklar

  1. Uygun plaka seçin. Ana dikkate görüntüleme edinimi sırasında odak korumak için yeteneğidir. Aşağıdaki noktaları 2B zaman geçerse veya 3D görüntüleme için 4D görüntüleme için kritik ve değildir.
    1. Çoklu kuyular plaka farklı kuyunun altındaki (yani kuyu amaç göre farklı yüksekliklerde yer alacaktır) homojen olmayabilir. Bu zor olursa olsun otomatik odaklama tekniği kullanılmış olma, xy noktaları ve zaman noktaları arasında odak sağlamak için yapacaktır.
    2. Slayt malzeme: cam vs plastik. Cam dipli slaytlar daha z-homojen kuyuları arasındaki, ancak daha pahalıdır.
    3. Plakanın alt kalınlığı: biz genellikle lamel-alt plakalar indeksi 1.5 kullanabilirsiniz, ancak endeks 1 amaca bağlı olarak da kabul edilebilir.
  2. Cov10 dakika için ConA (0.25 mg / ml) ile plaka arasında er alt \ kayar. ConA zaman içinde bir tek hücre ardından sağlayan slayt, hücre yapışma kullanılır.
  3. ConA çıkarın ve böylece aşırı ConA buharlaşıp gidecek bir kimyasal kaputu slayt inkübe.
  4. Iyi ConAed içine maya örnek Plate 200 ul (OD 600 = 0.5).
  5. Hücreler plaka yüzeyine tutunur sağlamak için olduğu gibi, 15 dakika için inkübe edin.
  6. Orta ayıklayın ve hücrelerin bir tabaka elde etmek için yeni bir orta ile üç kez yıkayın. Not: Uzun bir zaman atlamalı planlanmış ise, tohum hücreleri seyrek böylece yeni tomurcuklar doldurmak ve ilgi bölgenin engel olmayacağından emin.

3. Mikroskop Hazırlıklar

  1. Biz birkaç standart olmayan değişiklikler ile Nikon A1Rsi konfokal mikroskop kullanmak. Kadar, maya ve görüntüleme için biz 4 lazerler (ve 640 nm, 40 mW KÜP lazer; 457-514 nm, 65 mW Argon iyon lazer;; 561 nm, 50 mW Safir lazer 405 nm, 50 mW CUBE lazer) kadar kullanabilirsiniz ile donatılmış 4 Proje Yönetim Ekiplerifiltreler. Bizim görüntüleme çoğu EGFP için yeşil filtre seti ve mCherry ve tdTomato için kırmızı bir filtre seti ile yapılır. GFP ve mCherry ile orada neredeyse hiç bleedthrough, bu nedenle sık sık Eşzamanlı tarama kullanın. Bununla birlikte, çizgi tarama da o zaman meydana gelir bleedthrough önlemek için de kullanılabilir. Bizim konfokal da 2-3 saniyede z yığınlarının (30-50 bölümleri) etkinleştirerek, z 3 msn adımları yapabilirsiniz PInano Piezo aşaması (MCL) ile donatılmıştır. Bir galvano tarayıcı ve bir rezonans tarayıcı - sistemleri de bir spektral dedektörü, Perfect Odak (lazer ofset), ve iki tarayıcılar vardır.
  2. Uygun hedefi seçin. Ana konuları:
    1. Su / Yağ / Hava hedefi: ana dikkate numunenin orta vs görüntüleme ortamın kırılma indeksi olduğunu.
      1. Yağ hedefi avantajları:
        1. Yağ hedefleri yüksek sayısal diyafram (yağ sonları su daha hafif, ve bu nedenle daha fotonlar objektif geri dönmek) olabilir. Petrol hedefleri kadar olabilirNA 1.49, su için 1,27 karşılaştırılan. (Ancak, bu aslında çözünürlükte büyük bir fark değildir).
        2. Yağ kırılma indisi camın kırılma indisi eşleşir, dolayısıyla herhangi bir foton amaç için, camdan, örnek gidiş kaybolur. (Not - Hedefiniz ve lamel için uygun bir refraktif indekse sahip bir immersiyon yağı seçti).
        3. Buharlaşması olmadığından Petrol sorunsuz uzun zaman geçerse sağlar.
        Yağ Amaç dezavantajları:
        1. Hafif sulu bir ortamda (örneğin, bir hücre gibi) aracılığıyla seyahat etmek varsa yağ hedeflerinin yüksek NA tarafından etkinleştirilmiş yüksek çözünürlük hızla düşürür.
        2. Görüntüler genellikle daha küresel sapmaları var ve bir 3D efekti "uzattı".
        3. Petrol, yapışkan dağınık ve hedefleri için bir tehlike olduğunu.
      2. Su objektif avantajları
        1. Hücrenin kendini sulu, bu nedenle z daha az çarpıklıklara, bir vardırnd çözünürlük sulu bir numune içine yüksek derin kalır.
        2. Temiz ve kullanıcı dostu. Su hedefi dezavantajları: buharlaşır hızlı, hedefe devamlı su pompalamak için yapılan özel düzenlemeler olmadan uzun filmler için bu nedenle uygun değildir.
      3. Hava amacı avantajları: 1. Hiç bir malzeme çoklu nokta edinimi veya uzun bir film sırasında / buharlaşır kaybolur. 2. Temiz ve kullanıcı dostu. Dezavantajı: düşük çözünürlükte ve düşük sinyal hassasiyeti.
    2. Oda ve inkübatör sıcaklığı: değişen sıcaklık maddenin özelliklerini etkilemektedir ve narin sistemlerinde odak değiştirir. Sıcaklık edinimi için puan seçmeden önce ayarlanmalıdır. Edinimi sırasında sıcaklık değiştirme görüntüleme bozacak ve odak kaybına neden olacaktır. Biz mikroskop sistemi görüntülemesi önce istenilen sıcaklıkta 2 saat dengeye izin.
    3. Düzeltme yaka: Birçok amaçları sağlayan bir düzeltme halkası ile birlikte gelirAmaç belirli bir kapak kayma kalınlığı için ayarlanır. Biz nokta dağılım fonksiyonu görselleştirmek için floresan boncuk kullanarak düzeltme yaka ayarlamanızı öneririz. Bu, her örnek için doğru ayarları sağlayacaktır.
    4. Kararlı örnek tutucular: biz çoğu piyasada bulunan numune tutucuları mikroskop zayıf parçası olduğunu bulmak. Bunlar genellikle titrek ve düz değildir. Bu, yüksek çözünürlüklü, çoklu-nokta 4D görüntüleme için bir felaket olur. Biz düz olan kendi örnek tutucuları tasarım ve sahneye sıkıca kapanmış. Bunlar gerektiğinde aşağı cıvatalı olabilir.
    5. Çok noktalı edinimi: Bizim görüntüleme sistemi temelde bir lazer tabanlı otomatik odaklama mekanizması Nikon "Mükemmel odak" sistemi ile donatılmıştır. Sistem bir çok sürüklenme etmez, özellikle, ancak, otofokus, 4D görüntüleme ile mutlaka gerekli değildir.

4. Görüntüleme

  1. Sistemi açın: lazerler, sahne, kontrolör, kamera ve computer yazılımı.
  2. Sahnede tutucu plakayı, düzgün güvenli ve stabilize.
  3. Maya konumu ve yönünü belirlemek için göz noktası kullanın.
  4. Aydınlık kullanarak, şekil ve doku göre hücre sağlığı ve canlılığı değerlendirmek.
  5. İlgili fluorofor (GFP örn. FITC filtresi) göre epifluorescent ışık açın ve araştırma tabidir fenotipi gösteren hücreleri üzerinde durulacak. Birden fazla dalga boyunda floresan yüksek olan hücreler ve bu yüzden ölü autofluorescent olabilir. Biz bir SV40 NLS sinyali (NLS-TFP) erimiş bir tdTomato florofor ile nükleus görselleştirmek. TFP iki defa GFP boyutu ve çekirdeğin difüzyon sınırın üzerinde bu nedenle, bu nedenle de bir nükleer işaretleyici olarak çok iyi çalışır. Biz de GFP gibi aynı anda bir yeşil (488 nm) lazer ile TFP heyecanlandırmak, ama spektral çözünürlüğü için iki ayrı Proje Yönetim Ekipleri içine yeşil ve kırmızı emisyon toplayabilir.
  6. Gürültüyü en aza indirmek için aşağıdaki ayarları yapınve doygunluk:
    1. Lazer güç - photobleaching ve görüntünün fototoksisite vs parlaklığını düşünülmelidir.
    2. Kazanç: kamera hassasiyetini etkiler, böylece Sinyal Gürültü Oranı.
    3. İğne deliği çapı - kısa dalga boylu lazer göre ayarlanmalıdır. İğne deliği çapı optik bölümün kalınlığı (yüksekliği) görüntülenmiş belirler. Böylece, iğne deliği açarak daha fazla ışık (daha fotonlar izin) toplamak, ancak z (daha az confocality) çözünürlüğü düşecektir.
  7. Faydalı ipuçları:
    1. Farklı floroforlar uyuşan dalgaboyu yayarsak, sanal filtrelerin seçimi sağlayan Spectral Dedektör özelliğini kullanın. Spektral dedektörleri düzenli Proje Yönetim Ekipleri daha az duyarlı olduğunu unutmayın.
    2. Farklı floroforlar aynı lazer tarafından heyecanlıyız, satır tarama özelliğini kullanın.
    3. Bir Galvano tarayıcı daha fazla hassasiyet sağlar, ancak photobleaching için daha yüksek bir risk vardır. Bir Rezonans tarayıcı daha hızlı bir olanakcquisition, böylece photobleaching için riskini azaltarak, ama daha az duyarlıdır.
    4. İmajlar 2 ile 16 arasında değişen, ortalama gürültü oranı sinyal artırır, ama tabii ki, edinim yavaş ve yapar, lazer için numune daha fazla maruz kalma içerir.
    5. Süresi biyolojik soru (örn. JUNQ ve IPOD oluşumu ~ 2 saat sürer) edinim ile bağlıdır. Biz time-lapse 3D kadar 30 saat için rezonans tarayıcı ile maya imaged var.
    6. Zaman atlamalı aralıklarla-küçük aralıklarla daha tutarlı bir film yaratacak ancak beyazlatma ve dolayısıyla sinyal kaybı fotoğrafı neden olabilir.

Representative Results

Şekil 1
Şekil 1. . Kalite kontrol amaçlı farklı fonksiyonları ile farklı bölmelere katlanan proteinleri yönlendirir katlanan proteinleri Alt hücresel bölümlendirme: Model Çözünür proteinlerin yıkımı için hedeflenen, poli-ubikuitinasyon geçmesi ve Ju XTA-N uclear Q uality kontrol bölmesi (JUNQ gönderilir ). Ancak bunlar aktif toplama tabi burada Ubikitine edilemez çözünmeyen proteinler vakuol bitişik bir nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), karşı koruyucu haciz için gönderilir.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg "/>
Şekil 2. GFP-Ubc9 ts Modelleme proteinin hatalı katlanması. Normal şartlar altında, GFP-Ubc9 ts (yeşil) yerel katlanır ve nükleus ve sitoplazmada diffüz lokalizedir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Ubc9 ts İfade Tüm deneylerde görüntüleme öncesinde% 2 glukoz ilave edilerek kapatmak. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

  1. 37 ile ısı değişimi üzerine ° C, GFP-Ubc9 ts (yeşil) katlanan ve sitosolik gerilme Foci oluşturur. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir.
  2. 23 ° C, ısı şok kurtarma üzerine termal denatüre GFP-Ubc9 ts düşer, azaldıkça floresans düzeyi ile gösterilir.
  3. 80 Mm MG132, GFP-U ile 37 ° C ve proteazom inhibisyonu sıcaklık kayması üzerine bc9 ts JUNQ ve IPOD kapanımlar halinde katlanan ve işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir.
  4. 37 Sıcaklık kayması üzerine ° C ve ubikuitinasyon inhibisyonu, GFP-Ubc9 ts IPOD dahil içine katlanan ve işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Ubikitin Proteaz 4 (Ubp4) Ubc9 ts ubikuitinasyon engellemek için aşırı eksprese edilmektedir.

Şekil 3
Şekil 3,. JUNQ ve IPOD oluşumu Zaman atlamalı. 37'ye sıcaklık kayması üzerine ° C ve 80 Mm MG132 ile proteazom inhibisyonu, GFP-Ubc9 ts Stres Foci JUNQ ve IPOD kapanımlar halinde işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. 3D görüntüler 4 dk aralıklarla elde edildi. (Ayrıca Film 1'e bakınız).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Discussion

Biyokimyasal süreçler hakkında sezgilerimiz tepken ve ürünlerinin iyi karma çözüm bir behere dengeye ulaşmak için izin verilen masa üstü deneyler türetmek. Böyle bir ortamda, verilen bir kimyasal türlerin konsantrasyonunun bir makroskopik hacim moleküllerin bir molar miktar oranı olan bir tek sayı olarak ifade edilebilir. Hücrelerin bütün nüfusun homojenatlarında özler yürütülen batı blot, centrifugations ve spektrofotometrik ölçümler: Much biz protein yapısı ve işlevi hakkında bildiklerimizin klasik, toplu reaksiyon resmi yansıtacak yöntemler kullanılarak türetilmiştir.

Biz büyütme altında hücrelerde bakmak için kullanabilirsiniz teknolojisi çarçabuk geliştirir, çoğu biyokimyasal reaksiyonları in vivo yer aldığı koşullarda klasik masa üstü senaryo bu sadece ufak bir benzerlik olmadığı kadar açık hale gelir. Sadece cel iç kısmıdırla yoğun kalabalık etkileri büyük ölçüde çeşitli reaktifler faaliyetlerini değiştirmek hangi, aynı zamanda iyi karıştırılmış oldukça tersidir, çevre dolu. In vitro olarak ve kompleks makromoleküler reaksiyon geniş bir aralık içinde in vivo etkinlikleri arasında sık eşitsizlik için hesaplar.

Nowhere in vivo katlama, misfolding ve proteinlerin agregasyonu ile ilgili sorular gibi yanıltmak için daha eğilimli vitro biyokimyasal deneyler klasik kaynaklanan sezgileri vardır. Toplu reaksiyonlarda protein kimyası çalışmaları basit bir evet ya da hayır sorusu olarak verilen bir proteinin katlanma sorunu davranabilirsiniz Oysa bir canlı hücresinde makromoleküllerin bütün nüfus dinamiklerini izlemek için herhangi bir girişimde olası bütün dağıtım duyarlı olmalıdır bir polipeptid zincirini için müsait konformasyonel sonuçlarını ve misfolding ve toplama riski, özellikle de. Örneğin, bir toplu hücre ly incelemek olabilirWestern blotting ile bir araya protein doyurmak ve çoğunlukla protein çözünmeyen ve Ubikitine olmadığını belirler. Bununla birlikte, canlı hücre içinde birçok hücre üzerinde ortalama zaman tespit etmek zordur, protein alt-nüfusu bir ayrık, çözünür ve türlerin lokal konsantrasyonu çok yüksek ise, belirli bir bölme içinde Ubikitine olabilir. İkinci senaryoda büyük toplu alt-nüfusa oranla hücre canlılığı için önemli sonuçlar doğurabilir. Şaperonlar pleiotropik davranışları ve in vitro çeşitli fonksiyonları görüntüler ise Dahası, o hücreye kendi kesikli fonksiyonların mekansal ve zamansal olarak sınırlı olduğu açık hale geliyor.

Biyokimya anlamak için yeni ortaya çıkan paradigma, konsantrasyon hücre nano-çevre her belirli bir değişken özelliği olur ve biyolojik süreçlerin altında yatan moleküler olaylar değil sadece zaman test edilmelidir, ama aynı zamanda spac içindee. Burada sunulan 4D görüntüleme yaklaşımı, diğer biyolojik süreçlerin herhangi bir sayı incelemek için kullanılabilir ve nasıl zaman, mekan düzenlenmiştir olsa, canlı hücrelerde protein misfolding hassas modelleme sağlayan ve çevre koşullarında değişiklikler sonrasında. Bu yazıda etkili sitoplazmada protein agregasyonunu başlangıcı ile başa çıkmak için aşamaları ve seçenekleri gösterir Ubc9 ts katlama sensörü kullanın. Toplama kalite kontrol hücre biyolojisi gösteren ek olarak, bu yaklaşım, proteostasis (örneğin Ubc9 ts oksidasyon cevap olarak protein katlanması stres ölçmek için kullanılabilir üzerinde belirli düzensizliklerin veya genetik mutasyonların etki şifresini çözmek için bir güçlü bir araç olarak hizmet edebilir kalite kontrol yolu üzerinde toksik bir agrega veya mutasyonlar) ifadesi.

4D görüntüleme doğru iki farklı protein arasındaki protein yerelleştirme veya kolokalizasyon belirlemek için de önemlidirs, ve belki geçici ama önemli olması olayları algılamak için. Örneğin, özellikle bira mayası gibi küçük bir küresel organizmada, o 4D görüntüleme bu sadece muayene açısı bir dışlayıcı olduğunu ortaya çıkarabilir, oysa bir yapı veya agrega, juxtanuclear lokalizasyonu olduğu durumda görünebilir.

Burada mevcut örnekte deneyde, bir modelin kullanımı sitoplazmada zaman ve mekan içindeki agregasyonu kalite kontrol takip etmek için protein, Ubc9 ts, katlanan göstermektedir. Müsamahakâr sıcaklıkta, Ubc9 ts katlandığında ve çekirdek ve sitoplazmada dağınık. Isı kaynaklı misfolding üzerine, başlangıçta hızla proteozomal bozulması için işlenir difüzyon küçük agrega Stres Foci oluşturur. Proteazom kısmen inhibe edildiğinde, bu Stres Foci yaklaşık 2 saat boyunca JUNQ ve IPOD kapanımları dönüştürülür. Ubikuitin-aracılı yıkımı bir kalite kontrol seçeneği, Ub olarak mevcut değilsec9 ts hemen koruyucu toplama için IPOD dahil yeniden yönlendirilir. Bu araçlar agregasyon kalite kontrol dahil yeni genetik faktörler keşfetmek ve hücre kendi zamansal ve mekansal düzenleme keşfetmek için inanılmaz fırsatlar sunuyor.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MG132 Mercury mbs474790
con A Sigma C2010
Glass bottom plates ibidi ibd81158
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation
Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60x water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gershenson, A., Gierasch, L. M. Protein folding in the cell: challenges and progress. Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).
  2. Aguzzi, A., Calella, A. M. Prions: protein aggregation and infectious diseases. Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).
  3. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & development. 22, 1427-14 (2008).
  4. Cohen, E., Dillin, A. The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration. Nature reviews. Neuroscience. (2008).
  5. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, (1998).
  6. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews. Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).
  7. Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. Amyloid deposits: Protection against toxic protein species? Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).
  8. Spokoini, R., et al. Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast. Cell Rep. (2012).
  9. Weisberg, S. J., et al. Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).
  10. Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments. Nature. 454, 1088 (2008).
  11. Betting, J., Seufert, W. A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway. The Journal of biological chemistry. 271, 25790 (1996).
  12. Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal. Analytical biochemistry. 272, 263 (1999).
Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spokoini, R., Shamir, M., Keness, A., Kaganovich, D. 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells. J. Vis. Exp. (74), e50083, doi:10.3791/50083 (2013).More

Spokoini, R., Shamir, M., Keness, A., Kaganovich, D. 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells. J. Vis. Exp. (74), e50083, doi:10.3791/50083 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter