Summary
Метод анализа растворителей доступность тиоловые группы остатков цистеина в
Abstract
Имитация и эксплуатации вирус свойства и физико-химические и физические характеристики держит обещание дать ответы на некоторые из наиболее актуальных проблем в мире. Сам диапазон и типы вирусов в сочетании с их интригующими свойствами потенциально дают бесконечные возможности для применения в вирус-технологий. Вирусы имеют возможность самостоятельно собираться в частицы с дискретной формы и размера, специфики симметрии, поливалентности и стабильные свойства в широком диапазоне температур и рН условиях. Не удивительно, что с таким замечательным набором свойств, вирусы предложены для использования в биоматериалов 9, вакцины 14, 15, электронных материалов, химических средств и молекулярных электронных контейнеров 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Для того чтобы использовать вирусы в области нанотехнологий, они должны быть изменены с их естественной формы, чтобы придать новые функции. В этом сложном пр.ocess может осуществляться посредством нескольких механизмов, включая генетические модификации вирусного генома и химически крепления иностранной или желаемой молекулы вирусной частицы реактивные группы 8. Возможность изменять вирус в первую очередь зависит от физико-химических и физических свойств вируса. Кроме того, генетические или физико-химические изменения должны быть выполнены без ущерба для нативной структуры вируса и вируса функции. Кукурузы rayado Fino вируса (MRFV) белков пальто самостоятельно собираться в кишечной палочки получения стабильных и пустые ВПЧ, которые стабилизировать белок-белковых взаимодействий и которые могут быть использованы в вирусных технологий на основе применения 8. VLPs производится в растениях табака были рассмотрены как эшафот, на котором различные пептиды могут быть ковалентно отображается 13. Здесь мы описываем шаги: 1) определить, какие из доступных растворителей цистеина в капсид вируса доступны для модификацийкатионов, и 2) Bioconjugate пептидов изменение капсид. С помощью родных или мутационно вставлен аминокислотных остатков и стандартных технологий связи, широкий спектр материалов были выставлены на поверхности вирусов растений, таких как, Brome вируса мозаики 3, гвоздика пятнистости вируса 12, Вигну хлоротичных пятнистости вирус 6, табачной мозаики Вирус 17, репа вирус желтой мозаики 1, и MRFV 13.
Protocol
1. Прививка Вирус ВПЧ и очистки от растений Nicotiana benthamiana
- Продукция ограничен T7-РНК-транскрипты из картофельного вируса X (PVX)-плазмиды на основе вектора, несущего MRFV дикого типа (WT) и Cys-мутировал белка оболочки (CP) генов 12, с использованием Ambion в T7-mMessage mMachine Kit.
- Для каждой реакции стенограммы T7, прививают два полностью расширена листьев N. benthamiana с 10 мкл реакции и инкубировать растений в течение 10 дней в теплице, при 60% влажности в течение 16 часов со светом (25,000-30,000 люкс) при 25 ° C и 8 часов темноте при 20 ° C.
- Harves т Н. benthamiana инфицированных вирусом листьев 10 дней после прививки (точек на дюйм), вес ткани растения (50 грамм) и место на льду.
- Однородный растительный материал в блендере в присутствии 100 мл охлажденной раствор 0,5 М Na-цитрат буфер, рН 5,5 (использование 2 мл буфера на грамм ткани растений).
- Фильтр гомогената через 3 слоя cheeseclOTH и уточнить путем центрифугирования при 27000 х г в течение 30 мин. Передача супернатант в охлажденный мерный цилиндр, измерения объема, а затем переносить их на охлажденное стерильным стакан. Откажитесь от гранул.
- Процесс супернатанта путем добавления 10% полиэтиленгликоля 8000 (ПЭГ 8000), перемешивают в течение 15 мин при 4 ° С, и выдержать в течение дополнительных 45 мин при 4 ° С для осаждения вирус типа частиц (VLP)-PEG матрицы.
- Центрифуга образца при 27000 х г в течение 20 мин при 4 ° C и удалите супернатант.
- Процесс гранул путем добавления 8 мл 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5, содержащего 2% Triton X-100. Swirl пробирок хорошо, чтобы освободить гранул. Передача гранул и буфер для охлажденных стерильных стакана. Промойте трубы сразу с 2 мл того же буфера и добавить в стакан. Движение суспензии при 4 ° С до растворения гранул (как правило, 1 час).
- Уточнить центрифугированием в течение 5 мин при 27000 мкг, отказаться от гранул и рrocess супернатанта центрифугированием при 140000 х г в течение 2 ч при 4 ° C.
- Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5 и поместить подвески на вершине 10-40% градиенте сахарозы, сделанные в 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5.
- Центрифуга градиент в течение 3 ч при 140000 х г при 4 ° C.
- Shine A Light поверх центрифуги трубы и собирать рассеяния света верхняя полоса на 4 см от верхней части трубки, разбавляют 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5, и центрифуги в течение 3 ч при 140000 х г на 4 ° C.
- Ресуспендируют осадок в 0,5 мл стерильной воды и хранить при температуре 4 ° С на срок до шести месяцев.
- Количественного определения концентрации ВПЧ, выполняя анализ Bradford белка. Выход ВПЧ составляет от 1 до 3 мкг / г растительной ткани.
2. Флуоресцеин-5-малеимида маркировки Реакция VLPs
- Подготовить 1 мМ раствора флуоресцеина-5-малеимида (427,37 г / моль) в 50 мМ фосфат натрияэлектронной буфера, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА. Смешать помощью вихря и проверить полного растворения. Защита труб от света с помощью алюминиевой фольги.
- Добавить флуоресцеин-5-малеимида на ВПЧ, полученного на стадии 1 и перемешать. С помощью 25-кратного молярного избытка флуоресцеин-5-малеимида для молярного количества sulfhydryls. Как правило, с использованием 30 мкл ВПЧ при концентрации 1 мкг / мкл и 60 мкл флуоресцеин-5-малеимида решение дает приемлемый результат.
- Инкубируйте реакции в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
- Завершить реакцию добавлением дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 50 мМ.
- Удалить непрореагировавшего флуоресцеина использованием обессоливания колонки спина (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) и центрифугирования в течение 2 мин при 1500 мкг при комнатной температуре.
- Для SDS-PAGE анализа, добавить 10 мкл 2 х SDS-PAGE буфере образца Laemmli до 10 мкл каждой реакции. Хранить меченых белков, защищенном от света при температуре 4 ° C в течение одного месяца илиВ одноразовые аликвоты при -20 ° C до 3 месяцев.
3. Маркировка реакции и определение о регистрации Биотин
- Используйте обессоливания спина столбцов (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) для выполнения буфер обмена из воды в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,0 из VLP, полученного на стадии 1.
- Подготовить 20 мМ исходного раствора малеимида-PEG2-биотин, добавив 190 мкл PBS в No-взвешивание малеимида-PEG2-биотин и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
- Добавить малеимида-PEG2-биотин на ВПЧ и перемешать. С помощью 10-кратного молярного избытка реагентов для VLPs решения ≤ 2 мг / мл.
- Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 4 часов.
- Удалить непрореагировавшего малеимида-PEG2-биотин использованием обессоливания спина колонки (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) и центрифугирования в течение 2 мин при 1500 мкг при комнатной температуре.
- Определить моль биотина на моль VLPs помощью Пирс Биотин Количественный Kit (Thermo Scientific) и FOllowing инструкциями производителя.
4. Перекрестное связывание Cys 2-VLPs и F пептида
- VLP, в результате которых доступны остатков цистеина для сшивания на шаге 2 (2-Cys VLP) используют в следующей стадии. Подготовьте новый сшивающий раствора (28,63 мм) растворением 10 мг NHS-PEG4-малеимид сшивающего в 680 мкл диметилсульфоксида.
- Растворите 17 (F)-аминокислота долго пептид (LLPNMOKDKEACAKAPL) в 50 мкл буфера сопряжения (1 х PBS, рН 7,2, 1 мМ ЭДТА) в концентрации 0,1 мм.
- Добавить 4 мкл сшивающий до 50 мкл растворенного пептида (белка-NH2) на 1 мм конечной концентрации (которая находится в 10-кратном молярном избытке в течение 0,1 мМ раствора пептида).
- Инкубируйте реакции в течение 2 часов при температуре 4 ° C.
- Очищают сшитый пептид использованием обессоливания колонки (Thermo Scientific Inc, Rockford IL), уравновешенную буфером сопряжения (1 х PBS, рН 7,2, 1 мМ ЭДТА) путем центрифугирования при 1500 х гв течение 1 мин при комнатной температуре.
- Настройка реакционной смеси объединения ВПЧ (белково-SH) и сшитого пептида (белка-NH2) в молярном соотношении определяется числом тиолов и аминов активированного участвующих в реакции, и различия в молекулярной массе между ВПЧ и пептидов.
- Инкубируйте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч при 4 ° C.
- Для Вестерн-блоттинга, смешать полученную сопряженных продуктов 1:1 с Laemmli буфера, кипятить 10 мин, и приступить к SDS-PAGE на сборных 10-20% Трис-глицин гель (Invitrogen), а затем на электроблоттинга нитроцеллюлозные мембраны (Invitrogen). Блок мембраны с 1 х PBS, рН 7,2, содержащем 0,05% Твин-20 (PBS-Tween) и 5% обезжиренного сухого молока и зонд с пептид-специфических антител следуют соответствующие фосфатазы-меченых вторичных антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Переходный выражение мутантного белка оболочки MRFV (CP) генов в N. benthamiana растений в PVX-вектора на основе производства VLP, представлена на рисунке 1. Изменения пальто MRFV гена белка усиливается с помощью ПЦР, а затем помещен под транскрипционный контроль дублируется промоутер CP субгеномный в PVX на основе вектора, pP2C2S 2, (подарок D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Норвич, Англия). В пробирке транскрипции РНК производит РНК-транскрипты, которые затем использовали для инокуляции N. benthamiana растений. В зараженных растений (рис. 2A) MRFV-CP подразделения образуют ВПЧ (рис. 2В), которые легко очищаются. Впоследствии, VLP, перекрестно связаны с пептидами.
Например реактивной аминокислот белковой оболочки MRFV показано на рисунке 3. Каждая аминокислота выбрана могут быть использованы для присоединения фрагментов, если это поверхность подвергается. Химикодр. методы включают в себя традиционные стратегии bioconjugation, таких как, ацилирование аминогруппы лизина, алкилирования sulfhydrilic группы цистеина, и активация остатков карбоновой кислоты и связи с добавлением аминов. Кроме того, ароматические группы тирозина и триптофана может быть привлекательными целями для bioconjugation через диазотирования и алкилирования.
Растворитель доступность Cys остатков VLPs в тиол-специфических реагентов показано на рисунке 4. Очищенный мас-ВПЧ (дорожка 4) и Cys-VLPs мутантов проведения остатками цистеина в положении 107-111 (полоса 1) и 192-194 (полоса 3) КП гена 12 являются инертным в естественных условиях с тиол-специального реагента (отсутствие флуоресценции). Флуоресцеин-5-малеимида придает оранжевую флуоресценцию только для Cys-VLPs мутант проведения остатками цистеина в положении 125-129 генов CP (дорожка 2). Результат показывает, что ВПЧ в полосе 2 имеют геометрическую Арранgement остатков цистеина в результате чего растворитель, подвергшихся воздействию бесплатно тиоловых групп, в то время как остатки цистеина в пробах на дорожках 1 и 3, возможно, участвует в дисульфидными мостиками в сворачивании белка оболочки.
Маркировка реакции с малеимида-PEG2-биотин следует биотинилирование анализа представляют собой еще один пример анализа растворителей доступность Cys остатков. Потому что биотин является относительно небольшой молекулы, оно может быть сопряжено в нескольких экземплярах на ВПЧ, каждый из которых может связывать одну молекулу авидин, как показано на рисунке 5. Уровень биотинилирование, 84,74 моль биотина на моль белка 13, указывает количество биотина молекулы прикреплены к VLP, и, следовательно, число лигандов, которые могут быть отображены на внешней поверхности. Из-за наличия нескольких тиоловых групп на ВПЧ, пептиды могут быть присоединены путем сшивания реакций с NHS-PEG4-малеимид. Этот реагент он Теро-бифункционального сшивающего агента, который содержит реактивных концов, такие как N-гидроксисукцинимид (NHS) эфира и малеимида групп, что позволяет ковалентной сопряжения амин-и сульфгидрильных-содержащих молекул. Как показано на рисунке 6а, эфир NHS вступает в реакцию с первичными аминами формирования амидных связей, в то время как малеимида реагирует с сульфгидрильные группы, образующие устойчивые связи тиоэфир. Сшивка реакции производят ВПЧ-пептидных комплексов, которые иммунореактивных с специфических антител в вестерн-блот как показано на рисунке 6B.
Рисунок 1. Принципиальная схема производства VLP, в растения, а затем VLP, очистки и последующего сшивания пептидов.JPG "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.
Рисунок 2. Симптомы производства T7 стенограммы прививки от N. benthamiana растений (A) и просвечивающей электронной микроскопии производимых ВПЧ (B).
Рисунок 3. Предсказания структуры белка дикого типа (вес)-MRFV-CP показывать реактивные аминокислоты цистеина (указаны стрелками).
Рисунок 4. SDS-PAGE анализа очищенных VLP, конъюгированные с fluoroscein-5-малеимида. (A) Просто синие пятна безопасны был использован для окрашивания белков. (B) флуоресцеин-5-малеимида обнаружения фотографий под действием УФ-освещения. М: Prestained широкого диапазона маркерного белка (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: очищали Cys 1-VLPs, 2: очищенная 2-Cys VLPs, 3: очищенный Cys 3-VLPs, 4: очищенный вес ВПЧ. (Cys 1-VLPs, 2-Cys ВПЧ, и Cys 3-ВПЧ являются Cys-MRFV-мутанты VLPs 13).
Рисунок 5. AT = 3 ленты модель изометрической VLP, показывающие сульфгидрильных реактивной химии (А), биотин маркировки и (B) флуоресцеин-5-малеимида маркировки.
Рисунок 6. Диаграмма, иллюстрирующая белка сшивки между 2-Cys VLPs и F пептида (А) и вестерн-блоттинга (Б) Cys-ВПЧ-F зондировали специфические антитела к F пептида. М: Prestained широкого диапазона маркерного белка (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-ВПЧ-F производится в шаге 4 Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный здесь, дает очень чувствительный и быстрый анализ реактивных цистеина, присутствующего на поверхности растений производства VLP, а также на других белковых комплексов. Малеимиды являются тиол-специфических реагентов, которые вступают в реакцию с свободных сульфгидрильных-содержащих молекул к образованию устойчивых связей тиоэфир. Этот метод опирается на специфику малеимиды в реакцию с сульфгидрильных групп, не участвующих во взаимодействии с другими аминокислотами. Сохранение нативной структуры VLPs очень важно на протяжении всего процесса. В заявке описано, реакция проводится в естественных условиях и при рН 7 для поддержания нативной структуры ВПЧ. При нейтральном рН малеимиды имеют оптимальную реакцию с свободных сульфгидрильных групп. Это позволяет маркировки VLP, либо с флуоресцеина или биотин в цистеин доступны для модификации.
Мягкая рН (6,5-7,5) и буфер условия применяются также в сшивающегореакциях. Число функциональных групп на ВПЧ определяет соответствующее соотношение между кросс-линкер и ВПЧ. Нижняя сшивающего к белку отношений может быть использован в тех случаях, когда существует множество функциональных групп. И наоборот, более высокий поперечных связей с белками соотношение используется с меньшим количеством доступных функциональных групп.
Множество факторов, в том числе космических руку, спайность, химический состав, размер и растворимость в конечном счете, определяют выбор сшиватели используется. Кроме того, выбор сшивающего агента используется также функция размере двух белков (в данном случае VLP, и пептид), участвующих в сопряжении. Гетеро-бифункциональных сшивающих агентов идеально подходит для белково-пептидных или белок-белковые сшивки. Они позволяют более управляемой двухступенчатой реакции, которые сводят к минимуму нежелательные самостоятельно сопряжения и полимеризации, которая происходит, когда гомо-бифункциональные NHS-эфира используются реагенты. На первом этапе, NHS эфир реагирует Wiго первичных аминов формирования аминокислот облигаций. На втором этапе, малеимида реагирует с сульфгидрильных групп, образующих тиоэфир облигаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Упоминание торговых наименований товарной продукции в публикации исключительно для целей предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Министерства сельского хозяйства США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
