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Immunology and Infection

Cysteine ​​अवशेषों की सॉल्वेंट अभिगम्यता पर का विश्लेषण Published: February 14, 2013 doi: 10.3791/50084
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Plant Sciences Institute, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Molecular Plant Pathology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

सिस्टीन अवशेषों के की thiol समूह के विलायक पहुंच का विश्लेषण करने के लिए एक तरीका

Protocol

1. वायरस और निकोटियाना benthamiana संयंत्रों से VLPs शोधन इनोकुलेशन

  1. आलू वायरस (PVX) एक्स - आधारित वेक्टर ले जाने plasmids से छाया हुआ T7 शाही सेना टेप उत्पादन MRFV (wt) जंगली प्रकार और Cys-उत्परिवर्तित (सीपी) कोट प्रोटीन जीन 12, Ambion T7 mMessage mMachine किट का उपयोग कर.
  2. प्रत्येक T7 प्रतिलिपि प्रतिक्रिया के लिए, एन के दो पूरी तरह का विस्तार पत्तियों टीका लगाना 10 μl प्रतिक्रियाओं के साथ और 10 दिनों के लिए ग्रीन हाउस में पौधों सेते हैं, 16 घंटे के लिए 60% नमी में 25 में प्रकाश (25,000-30,000 लक्स) के साथ benthamiana डिग्री सेल्सियस और 8 अंधेरे घंटा 20 डिग्री सेल्सियस
  3. Harves टी एन benthamiana वायरस से संक्रमित पत्तियों 10 दिनों के बाद टीका (डीपीआई), संयंत्र (50 ग्राम) और ऊतक जगह बर्फ पर तौलना.
  4. एक ब्लेंडर में 0.5 एम बफर ना साइट्रेट, 5.5 पीएच (2 उपयोग संयंत्र ऊतक के प्रति ग्राम बफर मिलीलीटर) के एक ठंडा समाधान के 100 मिलीलीटर की उपस्थिति में संयंत्र सामग्री homogenize.
  5. 3 cheesecl की परतों के माध्यम से homogenate फ़िल्टरOTH और 30 मिनट के लिए 27,000 XG पर centrifugation द्वारा स्पष्ट. एक ठंडा स्नातक की उपाधि प्राप्त की सिलेंडर में तैरनेवाला स्थानांतरण, मात्रा को मापने, और तब एक ठंडा बाँझ बीकर हस्तांतरण. गोली त्यागें.
  6. 10% polyethylene glycol 8,000 (8000 खूंटी) जोड़कर तैरनेवाला प्रक्रिया, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए हलचल है, और 4 में एक अतिरिक्त 45 मिनट के लिए सेते हैं ° C वायरस की तरह (VLPs) कणों खूंटी मैट्रिक्स वेग.
  7. XG २७,००० में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने.
  8. 0.05 एम बफर ना साइट्रेट, पीएच 5.5% से युक्त 2 ट्राइटन X-100 के 8 मिलीग्राम जोड़कर गोली प्रक्रिया. भंवर अपकेंद्रित्र ट्यूबों को अच्छी तरह से गोली जारी है. गोली और बफर स्थानांतरण एक ठंडा बाँझ बीकर. ट्यूबों तुरंत ही बफर के 2 मिलीलीटर के साथ और कुल्ला बीकर के लिए जोड़ने. हिलाओ 4 बजे ° C जब तक निलंबन गुटिकाओं (आमतौर पर 1 घंटा) भंग कर रहे हैं.
  9. XG २७,००० में 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा स्पष्ट, गोली त्यागें, और पीrocess 2 घंटा के लिए 140.000 XG पर centrifugation द्वारा 4 पर तैरनेवाला ° सी.
  10. 1 मिलीलीटर 0.05 एम ना साइट्रेट बफर, 5.5 पीएच में गोली Resuspend और एक 10-40% sucrose 0.05 एम बफर ना साइट्रेट, 5.5 पीएच में बनाया ढाल के शीर्ष पर निलंबन जगह है.
  11. 140.000 XG में 4 में 3 घंटे के लिए ढाल अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  12. अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष पर एक प्रकाश चमक और ट्यूब के ऊपर से 4 सेमी पर प्रकाश बिखरने ऊपरी बैंड एकत्र करने के लिए, 3 घंटा के लिए 0.05 एम ना साइट्रेट बफर, 5.5 पीएच, और अपकेंद्रित्र के साथ 4 में 140.000 XG जलमिश्रित डिग्री सेल्सियस
  13. बाँझ पानी और दुकान के 0.5 मिलीलीटर में गोली 4 डिग्री सेल्सियस से कम छह महीने के लिए Resuspend.
  14. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख प्रदर्शन करके VLPs एकाग्रता quantitate. VLPs की उपज बीच 1 और 3 / संयंत्र ऊतक के ग्राम जी रहा है.

2. VLPs fluorescein-5-maleimide लेबलिंग प्रतिक्रियाओं

  1. Fluorescein-5 maleimide (427.37 छ / तिल) 50 मिमी सोडियम phosphat में 1 मिमी समाधान तैयारई बफर, 7.0 पीएच, 1 मिमी EDTA. भंवर का उपयोग कर मिलाई और पूरा विघटन की पुष्टि. एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से ट्यूब की रक्षा.
  2. चरण 1 और मिश्रण में उत्पादित VLPs fluorescein-5-maleimide जोड़ें. दाढ़ sulfhydryls की राशि के लिए एक 25 गुना fluorescein-5-maleimide की दाढ़ अधिक प्रयोग करें. आम तौर पर, 1 ग्राम / μl और fluorescein-5-maleimide समाधान के 60 μl की एकाग्रता में VLPs की 30 μl का उपयोग स्वीकार्य परिणाम पैदा करता है.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या रातोंरात प्रतिक्रिया सेते
  4. 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता dithiothreitol (डीटीटी) जोड़कर प्रतिक्रिया बर्खास्त.
  5. निकालें गैर प्रतिक्रिया व्यक्त fluorescein 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1,500 XG (थर्मो वैज्ञानिक इंक, रॉकफोर्ड आईएल) में एक desalting स्पिन स्तंभ और centrifugation का उपयोग कर.
  6. एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक प्रतिक्रिया के 10 μl 2 x एसडीएस पृष्ठ Laemmli नमूना बफर के 10 μl जोड़ें. एक महीने या 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से रक्षा के लिए लेबल प्रोटीन स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस में एकल उपयोग aliquots में 3 महीने के लिए.

3. रिएक्शन और बायोटिन निगमन के निर्धारण लेबल

  1. स्पिन कॉलम (थर्मो वैज्ञानिक इंक, रॉकफोर्ड आईएल) desalting का उपयोग करने के लिए पानी से फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस), चरण 1 में उत्पादित VLPs का पीएच 7.0 एक बफर विनिमय प्रदर्शन.
  2. Pipetting और नीचे द्वारा maleimide - PEG2 बायोटिन और मिश्रण नहीं, वजन में पीबीएस के 190 μl जोड़कर एक 20 मिमी maleimide - PEG2 बायोटिन की स्टॉक समाधान तैयार.
  3. VLPs और मिश्रण maleimide PEG2 बायोटिन जोड़ें. VLPs समाधान के लिए एक 10 गुना अभिकर्मक की दाढ़ अधिक का उपयोग ≤ 2 मिलीग्राम / एमएल.
  4. 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं.
  5. निकालें गैर प्रतिक्रिया व्यक्त maleimide PEG2 बायोटिन 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1500 XG पर एक desalting स्पिन (थर्मो वैज्ञानिक इंक, रॉकफोर्ड आईएल) स्तंभ और centrifugation का उपयोग कर.
  6. पियर्स बायोटिन Quantitation किट (थर्मो वैज्ञानिक) और के लिए उपयोग VLPs के moles प्रति बायोटिन की moles निर्धारितनिर्माता के निर्देशों llowing.

4. Cys 2 VLPs और एफ पेप्टाइड के क्रॉस को जोड़ने

  1. VLPs जिसके परिणामस्वरूप 2 कदम (Cys दो VLPs) में पार से जोड़ने के लिए उपलब्ध सिस्टीन अवशेषों में निम्नलिखित कदम में किया जाता है. डाइमिथाइल sulfoxide के 680 μl में एनएचएस - PEG4 maleimide पार linker की 10 मिलीग्राम भंग द्वारा तैयार एक ताजा स्टॉक पार से जोड़ने समाधान (28.63 मिमी).
  2. 17 (एफ) भंग एमिनो एसिड विकार बफर के 50 μl (1 x Pbs, 7.2 पीएच, 1 मिमी EDTA) में लंबी पेप्टाइड (LLPNMOKDKEACAKAPL) 0.1 मिमी की एकाग्रता पर.
  3. 1 मिमी अंतिम एकाग्रता (जो एक 10 गुना पेप्टाइड समाधान के 0.1 मिमी के लिए दाढ़ अधिक है) में 50 μl भंग पेप्टाइड (प्रोटीन NH2) के पार linker के 4 μl जोड़ें.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते
  5. 1500 XG पर centrifugation द्वारा पार से जुड़े एक desalting (थर्मो वैज्ञानिक इंक, रॉकफोर्ड आईएल) विकार बफर (1 मिमी EDTA, 1 x PBS, पीएच 7.2) के साथ equilibrated स्तंभ का उपयोग पेप्टाइड शुद्धकमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए.
  6. एक प्रतिक्रिया (प्रोटीन एसएच) VLPs और एक दाढ़ thiols और सक्रिय प्रतिक्रिया और VLPs और पेप्टाइड के बीच आणविक भार में अंतर में शामिल amines की संख्या द्वारा निर्धारित अनुपात में पार से जुड़े पेप्टाइड (प्रोटीन NH2) के संयोजन मिश्रण सेट.
  7. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते
  8. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, 10 मिनट के लिए फोड़ा, Laemmli बफर, के साथ जिसके परिणामस्वरूप संयुग्मित उत्पाद 01:01 मिश्रण और एक 10-20% Tris-Glycine जेल (Invitrogen) पूर्व डाली पर एसडीएस पृष्ठ के साथ आगे बढ़ना, एक पर electroblotting द्वारा पीछा nitrocellulose झिल्ली (Invitrogen). 1 x PBS, पीएच 7.2 0.05% बीच 20 (पीबीएस के बीच) और 5% स्किम दूध पाउडर और पेप्टाइड विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी फॉस्फेट लेबल द्वारा पीछा जांच युक्त झिल्ली के साथ ब्लॉक.

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Representative Results

उत्परिवर्ती MRFV एन में कोट प्रोटीन जीन (सीपी) के क्षणिक अभिव्यक्ति एक PVX आधारित वेक्टर उत्पादन VLPs में benthamiana पौधों चित्रा 1 में वर्णित है. संशोधित MRFV कोट प्रोटीन जीन पीसीआर से परिलक्षित होता है और एक वेक्टर PVX आधारित, 2 pP2C2S, (डी. Baulcombe, Sainsbury प्रयोगशालाओं, नॉर्विच, इंग्लैंड की एक उपहार) में दोहराया subgenomic सी.पी. प्रमोटर के transcriptional नियंत्रण के तहत फिर से रखा. इन विट्रो आरएनए प्रतिलेखन शाही सेना टेप कि फिर एन टीका लगाना करने के लिए उपयोग किया जाता है benthamiana पौधों. संक्रमित पौधों में (चित्रा 2A) MRFV सी.पी. सब यूनिटों VLPs (चित्रा 2B) है, जो आसानी से शुद्ध कर रहे हैं के रूप में. बाद में, VLPs पेप्टाइड्स पार से जुड़ा हुआ है.

MRFV कोट प्रोटीन की प्रतिक्रियाशील अमीनो एसिड का एक उदाहरण चित्रा 3 में दिखाया गया है. प्रत्येक अमीनो एसिड चयनित moieties देते हैं अगर यह सतह उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रासयानिकअल तकनीक इस तरह के रूप में, लाइसिन, सिस्टीन की sulfhydrilic समूह के alkylation के एमिनो समूह के, acylation और कार्बोक्जिलिक एसिड अवशेषों की सक्रियता और जोड़ा amines साथ युग्मन पारंपरिक bioconjugation रणनीति में शामिल हैं. इसके अलावा, tyrosine और tryptophan के खुशबूदार समूहों के माध्यम से diazotization और alkylation bioconjugation के लिए आकर्षक लक्ष्य हो सकता है.

thiol विशिष्ट अभिकर्मकों VLPs Cys अवशेषों की विलायक पहुंच 4 चित्र में सचित्र है. WT-VLPs शुद्ध (4 लेन) और Cys VLPs स्थिति में सिस्टीन अवशेषों ले जाने के म्यूटेंट 107-111 (1 लेन) और सी.पी. 12 जीन के 192-194 (3 लेन) देशी परिस्थितियों में thiol विशिष्ट (अभिकर्मक अभाव साथ unreactive प्रतिदीप्ति). Fluorescein-5-maleimide Cys VLPs उत्परिवर्ती सी.पी. जीन (2 लेन) 125-129 की स्थिति में ले जाने सिस्टीन अवशेषों के लिए केवल नारंगी प्रतिदीप्ति प्रदान करता है. परिणाम से पता चलता है कि 2 लेन में VLPs एक ज्यामितीय Arrancysteines अवशेषों की gement विलायक उजागर मुक्त thiol समूहों में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि गलियों 1 और 3 में नमूने में सिस्टीन अवशेषों शायद कोट प्रोटीन की तह में Disulphide पुलों में शामिल कर रहे हैं.

साथ लेबल प्रतिक्रियाओं maleimide PEG2 - बायोटिन एक biotinylation परख द्वारा पीछा Cys अवशेषों की विलायक पहुंच के विश्लेषण का एक और उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. क्योंकि बायोटिन एक अपेक्षाकृत छोटे अणु है, यह कई प्रतियों में संयुग्मित VLPs पर किया जा सकता है जिनमें से प्रत्येक का avidin की एक अणु को बाध्य के रूप में चित्रा 5 में दिखाया जा सकता है. 13 प्रोटीन की तिल प्रति biotinylation के स्तर, 84.74 बायोटिन की तिल, बायोटिन VLPs के लिए जुड़ी अणुओं की संख्या को इंगित करता है और फलस्वरूप कि ligands बाहरी सतह पर प्रदर्शित किया जा सकता है की संख्या. VLPs पर कई thiol समूहों की उपलब्धता की वजह से, पेप्टाइड्स पार से जोड़ने एनएचएस - PEG4 maleimide साथ प्रतिक्रियाओं द्वारा संलग्न किया जा सकता है. यह अभिकर्मक वह एक है टेरो bifunctional पार linker जो N-hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर और maleimide समूहों के रूप में प्रतिक्रियाशील छोर हैं, amine और sulfhydryl युक्त अणुओं के सहसंयोजक विकार की अनुमति है. रूप में 6A चित्र में दिखाया गया है, एनएचएस एस्टर प्राथमिक amines एमाइड बांड बनाने के साथ प्रतिक्रिया करता है, जबकि maleimide sulfhydryl स्थिर thioether बांड बनाने समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है. पार से जोड़ने की प्रतिक्रियाओं VLPs पेप्टाइड परिसरों है कि वेस्टर्न ब्लॉट में विशिष्ट एंटीबॉडी रूप में चित्र 6B में दिखाया साथ immunoreactive हैं उपज.

चित्रा 1
चित्रा 1 पौधों, VLPs शुद्धि और पेप्टाइड्स के बाद पार से जोड़ने के द्वारा पीछा में VLPs के उत्पादन के योजनाबद्ध आरेख.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 एन T7 transcripts टीका द्वारा उत्पादित लक्षण benthamiana पौधों (ए) और संचरण उत्पादित VLPs (बी) के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी.

चित्रा 3
चित्रा 3. जंगली प्रकार (wt) प्रतिक्रियाशील सिस्टीन अमीनो एसिड (तीर द्वारा इंगित) दिखा MRFV - सी.पी. के एक प्रोटीन संरचना भविष्यवाणी.

चित्रा 4
चित्रा 4 fluoros संयुग्मित VLPs शुद्ध विश्लेषण एसडीएस पृष्ठCEIN-5-maleimide (ए) Simply Blue सुरक्षित प्रोटीन दाग दाग के लिए इस्तेमाल किया गया था, (बी) रोशनी के तहत यूवी और Fluorescein-5-maleimide पता लगाने फोटोग्राफी. Prestained व्यापक रेंज प्रोटीन मार्कर (जैव रेड, हरक्यूलिस, सीए), 1: एम शुद्ध Cys 1-VLPs, 2: शुद्ध Cys 2 VLPs, 3: शुद्ध wt VLPs: Cys 3-VLPs, 4 शुद्ध. (1-VLPs Cys दो VLPs, और Cys तीन VLPs Cys Cys - MRFV VLPs म्यूटेंट 13).

चित्रा 5
5 = 3 (ए) बायोटिन लेबलिंग और (बी) fluorescein-5-maleimide लेबलिंग के लिए isometric sulfhydryl प्रतिक्रियाशील रसायन विज्ञान दिखा VLPs के रिबन मॉडल चित्रा.

चित्रा 6 चित्रा 6 आरेख प्रोटीन पार Cys दो VLPs और एफ पेप्टाइड (A) और वेस्टर्न ब्लॉट के बीच जोड़ने (बी) Cys VLPs एफ के विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एफ पेप्टाइड की जांच की. Illustrating Prestained व्यापक रेंज प्रोटीन मार्कर (जैव रेड, हरक्यूलिस, सीए), 1: एम चरण 4 में उत्पादित Cys VLPs एफ बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि प्रतिक्रियाशील cysteines संयंत्र उत्पादन VLPs की सतह पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रोटीन परिसरों पर वर्तमान के एक बहुत ही संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. Maleimides thiol विशिष्ट अभिकर्मकों, है जो मुफ्त sulfhydryl युक्त अणुओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए स्थिर thioether बांड फार्म हैं. इस विधि maleimides sulfhydryl अन्य एमिनो एसिड के साथ बातचीत में शामिल नहीं समूहों के साथ प्रतिक्रिया की विशिष्टता पर छोड़ता है. VLPs की मूल संरचना के संरक्षण पूरी प्रक्रिया के माध्यम से बहुत महत्वपूर्ण है. आवेदन में वर्णित है, प्रतिक्रियाओं देशी परिस्थितियों में प्रदर्शन कर रहे हैं और 7 पीएच में VLPs की मूल संरचना को बनाए रखने. तटस्थ पीएच में maleimides मुफ्त sulfhydryl समूहों के साथ जेट इष्टतम है. यह या तो fluorescein या बायोटिन साथ VLPs के संशोधनों के लिए सुलभ सिस्टीन लेबलिंग की अनुमति देता है.

हल्के पीएच (6.5-7.5) और बफर की स्थिति भी पार से जोड़ने में कार्यरत हैंप्रतिक्रियाओं. VLPs पर कार्य समूहों की संख्या पार linker और VLPs के बीच उचित अनुपात निर्धारित करता है. कम प्रोटीन अनुपात को पार linker मामलों में जहां कई कार्य समूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, एक उच्च प्रोटीन अनुपात पार linker कम उपलब्ध कार्य समूहों के साथ कार्यरत है.

अंतरिक्ष हाथ, cleavability, रासायनिक संरचना, आयाम, और विलेयता सहित कारकों की एक सरणी अंततः पार linkers के चयन का निर्धारण करते हैं. इसके अलावा, इस्तेमाल पार linker के चुनाव भी दो प्रोटीन के आकार के (VLPs और पेप्टाइड इस मामले में) विकार में शामिल एक समारोह है. असमलैंगिक bifunctional पार linkers प्रोटीन पेप्टाइड या प्रोटीन, प्रोटीन पार से जोड़ने के लिए आदर्श होते हैं. वे अधिक नियंत्रित दो कदम प्रतिक्रियाओं है कि आत्म विकार अवांछित और polymerization जो तब होता है जब होमोसेक्सुअल bifunctional एन एच एस एस्टर अभिकर्मकों का इस्तेमाल कर रहे हैं कम से कम देते हैं. पहले चरण में, एन एच एस एस्टर वाई प्रति प्रतिक्रिया करता हैवें प्राथमिक अमीनो बांड बनाने amines. दूसरे चरण में, maleimide sulfhydryl thioester बांड बनाने समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है.

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Disclosures

प्रकाशन में वाणिज्यिक उत्पादों के व्यापार के नाम का उल्लेख विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए पूरी तरह से है और सिफारिश या अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा बेचान संकेत नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107
10-20 % Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107

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References

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Cysteine ​​अवशेषों की सॉल्वेंट अभिगम्यता पर का विश्लेषण<em&gt; मक्का rayado FINO वायरस</em&gt; वायरस की तरह कण में उत्पादित<em&gt; निकोटियाना benthamiana</em&gt; पौधों और VLPs पेप्टाइड्स के पार से जोड़ने
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Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis … More

Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

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