Summary
Un metodo per analizzare l'accessibilità al solvente del gruppo tiolo della cisteina residui di
Abstract
Imitare e sfruttando le proprietà e le caratteristiche fisico-chimiche dei virus e fisico promette di fornire soluzioni ad alcune delle sfide più pressanti del mondo. La gamma pura e tipi di virus insieme con le loro proprietà potenzialmente intriganti dare infinite opportunità per le applicazioni in tecnologie basate su virus. Virus hanno la capacità di auto-assemblano in particelle di forma e dimensioni discrete, specificità di simmetria, polivalenza e proprietà stabili in un'ampia gamma di condizioni di temperatura e di pH. Non sorprendentemente, con una notevole gamma di proprietà, i virus sono proposti per l'uso in vaccini biomateriali 9, 14, 15, materiali elettronici, strumenti chimici e molecolare elettronica contenitori 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Al fine di utilizzare i virus in nanotecnologie, devono essere modificati dalle loro forme naturali per impartire nuove funzioni. Questo impegnativo process può essere effettuato attraverso meccanismi diversi tra modificazione genetica del genoma virale e attaccare chimicamente molecole estranee o desiderato per i gruppi reattivi delle particelle virali 8. La possibilità di modificare un virus dipende principalmente dalle proprietà fisico-chimiche e fisiche del virus. Inoltre, le modifiche genetiche o fisico-chimiche devono essere eseguite senza alterare la struttura originaria del virus e la funzione virus. Mais Rayado Fino virus (MRFV) proteine di rivestimento auto-assemblano in Escherichia coli che producono VLP stabili e vuoti che sono stabilizzati da proteina-proteina interazioni e che possono essere utilizzati in applicazioni basate su virus tecnologie 8. VLPs prodotte in piante di tabacco sono stati esaminati da impalcatura su cui una varietà di peptidi possono essere covalentemente visualizzato 13. Qui, descriviamo la procedura per 1) determinare quale dei solventi accessibili cisteine in un capside del virus sono disponibili per modifizione, e 2) Bioconjugate peptidi alle capsidi modificati. Utilizzando nativi o mutationally-inserito residui di aminoacidi e tecnologie standard di accoppiamento, una grande varietà di materiali sono stati visualizzati sulla superficie del virus vegetali come, virus del mosaico Brome 3, virus della screziatura Carnation 12, Cowpea clorotiche mottle virus 6, mosaico del tabacco virus 17, Rapa virus del mosaico giallo 1, e MRFV 13.
Protocol
1. Virus Inoculazione e purificazione VLP da piante di Nicotiana benthamiana
- Produrre ricoperti T7-RNA trascritti da Virus X della patata (PVX) basati su plasmidi vettori che trasportano MRFV wild-type (WT) e proteina di rivestimento Cys-mutato (CP) geni 12, utilizzando Ambion il T7-mMessage mmachine kit.
- Per ogni reazione di trascrizione T7, inoculare due foglie completamente espanse di N. benthamiana con 10 reazioni e incubare le piante per 10 giorni in serra, al 60% di umidità per 16 ore di luce (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 ore buio a 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana infettate da virus foglie di 10 giorni dopo l'inoculazione (dpi), pesare il tessuto vegetale (50 grammi) e posto sul ghiaccio.
- Omogeneizzare il materiale vegetale in un frullatore in presenza di 100 ml di una soluzione fredda di 0,5 M Na-citrato, pH 5,5 (uso 2 ml di tampone per grammo di tessuto vegetale).
- Filtrare omogeneizzato attraverso 3 strati di cheeseclOTH e chiarire mediante centrifugazione a 27.000 xg per 30 min. Trasferire il surnatante in un cilindro graduato refrigerati, misurarne il volume, e poi trasferire in un recipiente freddo sterile. Eliminare il pellet.
- Elaborare il surnatante aggiungendo glicole polietilenico 8000 10% (PEG 8000), agitare per 15 min a 4 ° C, e incubare per altri 45 min a 4 ° C per precipitare le particelle simili a virus (VLPs)-PEG matrice.
- Centrifugare il campione a 27.000 xg per 20 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Elaborare il pellet aggiungendo 8 ml di 0,05 M Na-citrato, 5,5 contenente 2% Triton X-100 pH. Swirl tubi la centrifuga bene a rilasciare il pellet. Trasferire il pellet e buffer a un beaker refrigerati sterile. Sciacquare i tubi immediatamente con 2 ml dello stesso tampone e aggiungere al becher. Agitare la sospensione a 4 ° C fino a quando i pellet vengono disciolti (generalmente 1 ora).
- Chiarificare mediante centrifugazione per 5 minuti a 27.000 xg, scartare il pellet, e pPROCESSO surnatante mediante centrifugazione a 140.000 xg per 2 ore a 4 ° C.
- Risospendere il pellet in 1 ml di 0,05 M Na-citrato, pH 5,5 e posizionare la sospensione su un gradiente di saccarosio 10-40% made in 0,05 M Na-citrato, pH 5,5.
- Centrifugare il gradiente per 3 ore a 140,000 xg a 4 ° C.
- Accendere una luce sopra la parte superiore della provetta e raccogliere la luce-dispersione banda superiore a 4 cm dalla sommità del tubo, diluire con 0,05 M Na-citrato, pH 5,5, e centrifugare per 3 ore a 140.000 xg a 4 ° C.
- Risospendere il pellet in 0,5 ml di acqua sterile e conservare a 4 ° C per un massimo di sei mesi.
- Quantificare la concentrazione VLPs eseguendo un saggio di proteina Bradford. La resa di VLPs è tra 1 e 3 mg / g di tessuto vegetale.
2. Fluoresceina-5-maleimide-etichettatura Reazioni di VLP
- Preparare una soluzione 1 mM di fluoresceina-5-maleimide (427,37 g / mole) in 50 mM di sodio Phosphate tampone, pH 7,0, 1 mM EDTA. Mescolare con il vortice e verificare la completa dissoluzione. Proteggere il tubo dalla luce con un foglio di alluminio.
- Aggiungi fluoresceina-5-maleimide a VLPs prodotte nel passaggio 1 e mescolare. Utilizzare di 25 volte l'eccesso molare di fluoresceina-5-maleimide per quantità molare di sulfidrili. Generalmente, utilizzando 30 ml di VLPs alla concentrazione di 1 pg / pl e 60 pl della fluoresceina-5-maleimide soluzione produce risultati accettabili.
- Incubare la reazione per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Terminare la reazione mediante aggiunta di ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 50 mM.
- Rimuovere non reagito fluorescina utilizzando una colonna dissalazione spin (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugazione per 2 min a 1500 xga temperatura ambiente.
- Per analisi SDS-PAGE, aggiungere 10 ml di 2 x SDS-PAGE tampone Laemmli a 10 pl di ciascuna reazione. Memorizzare la proteina marcata protetto dalla luce a 4 ° C per un mese omonouso in aliquote a -20 ° C fino a 3 mesi.
3. Etichettatura di reazione e la determinazione di Costituzione Biotina
- Utilizzare spin column desalificazione (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) per eseguire uno scambio di buffer dall'acqua al tampone fosfato salino (PBS), pH 7,0 delle VLPs prodotte nel passo 1.
- Preparare una soluzione stock 20 mM di maleimide-PEG2-biotina aggiungendo 190 microlitri di PBS in n-maleimide-PEG2 Pesare-biotina e mescolare pipettando su e giù.
- Aggiungi maleimide-PEG2-biotina alle VLP e mescolare. Utilizzare un 10-fold eccesso molare di reagente per soluzioni VLPs ≤ 2 mg / ml.
- Incubare la reazione a temperatura ambiente per 4 h.
- Rimuovere non reagito maleimide-PEG2-biotina utilizzando una colonna di spin dissalazione (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugazione per 2 min a 1500 xga temperatura ambiente.
- Determinare le moli di biotina per moli di VLP utilizzando la Pierce Biotina quantificazione Kit (Thermo Scientific) e following istruzioni del produttore.
4. Cross-linking di Cys 2-VLP e F Peptide
- VLPs che portano a residui di cisteina disponibili per reticolazione nella fase 2 (2-Cys VLPs) vengono utilizzati nel passaggio seguente. Preparare un nuovo cross-linking soluzione madre (28,63 mM) sciogliendo 10 mg di NHS-PEG4-maleimide reticolante in 680 ml di dimetilsolfossido.
- Sciogliere un 17 (F)-amino peptide acido lunga (LLPNMOKDKEACAKAPL) in 50 pl di tampone di coniugazione (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) ad una concentrazione di 0,1 mM.
- Aggiungere 4 ml di reticolante a 50 microlitri del peptide disciolto (proteina-NH2) ad una concentrazione di 1 mM finale (che è di 10 volte l'eccesso molare di 0,1 mM di soluzione di peptide).
- Incubare la reazione per 2 ore a 4 ° C.
- Purificare reticolato peptide utilizzando una colonna dissalazione (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrata con tampone di coniugazione (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) per centrifugazione a 1500 xgper 1 min a temperatura ambiente.
- Impostare un mix di reazione combinando VLPs (proteina-SH) e reticolato peptide (proteina-NH2) in un rapporto molare determinata dal numero di tioli e ammine attivati coinvolte nella reazione e la differenza di peso molecolare tra VLP e peptidi.
- Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 ore a 4 ° C.
- Per l'analisi Western blot, miscelare il prodotto risultante coniugato 1:1 con tampone di Laemmli, bollire per 10 min, e procedere con SDS-PAGE su un pre-cast 10-20% Tris-glicina gel (Invitrogen), seguita da elettroblotting su una membrana di nitrocellulosa (Invitrogen). Bloccare le membrane con 1 x PBS, pH 7,2 contenente 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) e 5% di latte scremato in polvere e sonda con peptide anticorpi specifici seguiti dal appropriata fosfatasi-anticorpo secondario marcato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Espressione transitoria di cappotto mutanti MRFV proteine (CP) geni in N. benthamiana piante in un PVX basati VLPs vettore producono è descritto nella Figura 1. Il mantello modificato MRFV proteina gene viene amplificato mediante PCR e quindi posto sotto il controllo trascrizionale del promotore subgenomico duplicato CP in un PVX-based vettore, pP2C2S 2, (un dono di D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inghilterra). In vitro la trascrizione di RNA produce trascritti di RNA che vengono poi utilizzati per inoculare N. benthamiana piante. Nelle piante infette (Figura 2A) MRFV-CP subunità formare VLPs (Figura 2B) che sono facilmente purificati. Successivamente, le VLP sono reticolate a peptidi.
Un esempio di reattivi aminoacidi della proteina di rivestimento MRFV è mostrato in Figura 3. Ogni amminoacido selezionato può essere utilizzato per collegare porzioni se è superficie esposta. La chimicaAl tecniche includono strategie bioconjugation tradizionali come, l'acilazione del gruppo amminico della lisina, alchilazione del gruppo sulfhydrilic di cisteina, e l'attivazione di residui di acido carbossilico e di accoppiamento con ammine aggiunti. Inoltre, i gruppi aromatici di tirosina e triptofano possono essere bersagli interessanti per bioconjugation tramite diazotazione e alchilazione.
L'accessibilità al solvente di residui Cys di VLPs a tiolo-specifici reagenti è illustrato nella figura 4. Purificato wt-VLPs (corsia 4) e Cys-VLPs mutanti trasportano residui di cisteina in posizione 107-111 (corsia 1) e 192-194 (corsia 3) del gene CP 12 sono non reattivi in condizioni native con tiolo-reagente specifico (assenza di fluorescenza). Fluoresceina-5-maleimide impartisce fluorescenza arancio solo per i residui mutanti Cys-cisteina VLPs trasportano in posizione 125-129 del gene CP (corsia 2). Il risultato dimostra che VLP in corsia 2 hanno una geometrica arranstione di residui di cisteine conseguente gruppi liberi solvente esposti tiolo, mentre i residui di cisteina nei campioni in corsie 1 e 3 sono forse coinvolti in ponti disolfuro nel ripiegamento della proteina di rivestimento.
Reazioni Etichettatura con maleimide-PEG2-biotina seguito da un saggio biotinilazione rappresentano un altro esempio di analisi di accessibilità al solvente di residui di Cys. Perché biotina è una molecola relativamente piccola, può essere coniugato in diverse copie sulle VLP, ciascuno dei quali può legare una molecola di avidina come mostrato in Figura 5. Il livello di biotinilazione, 84,74 mole di biotina per mole di proteina 13, indica il numero di molecole di biotina attaccate alle VLPs e di conseguenza il numero di leganti che possono essere visualizzati sulla superficie esterna. Grazie alla disponibilità di diversi gruppi tiolici sulle VLP, peptidi può essere collegato mediante reticolazione reazioni con NHS-PEG4-maleimide. Questo reagente è un lui Tero-bifunzionale cross-linker che contiene le estremità reattive come N-idrossisuccinimmide (NHS) estere e gruppi di maleimmide, consentendo coniugazione covalente delle molecole di ammina-e contenenti sulfidrile. Come mostrato nella Figura 6A, l'estere NHS reagisce con ammine primarie che formano legami ammidici, mentre maleimmide reagisce con gruppi sulfidrilici formano legami stabili tioetere. Reticolazione reazioni producono VLP-peptide che sono immunoreattivo con gli anticorpi specifici in Western blot come mostrato in Figura 6B.
Figura 1. Schema della produzione di VLPs in piante, e purificata VLP e successiva reticolazione di peptidi.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Sintomi Figura 2. Prodotte da T7 trascritti inoculazione su N. benthamiana piante (A) e microscopia elettronica a trasmissione delle VLPs prodotte (B).
Figura 3. Una previsione della struttura delle proteine wild-type (WT)-MRFV-CP mostra acidi cisteina reattivi amminoacidi (indicato dalle frecce).
Figura 4. SDS-PAGE analisi purificata VLP coniugati fluorosCEIN-5-maleimide. (A) Semplicemente blu macchia sicuro è stato utilizzato per colorare le proteine. (B) Fluoresceina-5-maleimide rilevamento dalla fotografia in presenza di luce UV. M: Prestained ampia gamma marcatore proteico (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: 1-Cys purificata VLP, 2: 2-Cys purificata VLP, 3: 3-Cys purificata VLP, 4: VLPs purificate wt. (1 Cys-Cys VLPs, 2-VLP, e Cys 3-VLP sono Cys-MRFV-VLPs mutanti 13).
Figura 5. AT = 3 modello nastro di VLPs isometriche mostrano la chimica solfidrile reattivo per (A) etichettatura biotina e (B) fluorescein-5-maleimide etichettatura.
Figura 6. Diagramma proteina reticolazione tra Cys 2-VLPs e F peptide (A) e Western blot (B) di Cys-VLP-F sondati con anticorpi specifici per F peptide. M: marcatore proteico Prestained ampio range (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F prodotta nel passaggio 4 Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo qui presentato permette una analisi molto sensibile e rapido delle cisteine reattive presenti sulla superficie delle piante prodotte VLPs nonché su complessi di proteine. Maleimmidi sono tiolo-specifici reagenti, che reagiscono con liberi sulfidrilici contenenti molecole di formare legami stabili tioetere. Questo metodo disegna sulla specificità delle maleimmidi di reagire con i gruppi sulfidrilici non coinvolti in interazioni con altri aminoacidi. Mantenendo la struttura nativa delle VLPs è molto importante durante l'intero processo. Nell'applicazione descritta, le reazioni vengono eseguite in condizioni native ed a pH 7 per mantenere la struttura nativa delle VLPs. A pH neutro, maleimmidi hanno reattività ottimale con gruppi sulfidrilici liberi. Questo permette etichettatura delle VLPs sia con fluoresceina o biotina a cisteina accessibile a modifiche.
Tenue pH (6,5-7,5) e condizioni del tampone sono utilizzate anche nel cross-linkingreazioni. Il numero di gruppi funzionali sulle VLPs determina il rapporto adeguato tra cross-linker e VLPs. Inferiore cross-linker a rapporti di proteine può essere utilizzato nei casi in cui vi sono molti gruppi funzionali. Viceversa, più di un cross-linker di proteine è impiegato con meno gruppi funzionali disponibili.
Una serie di fattori tra cui il braccio spazio, cleavability, composizione chimica, dimensione, e la solubilità in definitiva determinano la selezione di reticolanti utilizzate. Inoltre, la scelta del cross-linker utilizzato è anche funzione delle dimensioni delle due proteine (in questo caso VLPs e peptidi) coinvolti nella coniugazione. Etero-bifunzionali RETICOLANTI sono ideali per proteina-peptide o proteina-proteina cross-linking. Essi consentono più controllati due fasi reazioni che minimizzano l'indesiderato self-coniugazione e polimerizzazione che si verifica quando homo-bifunzionali NHS-estere reagenti sono impiegati. Nella prima fase, l'estere NHS reagisce wi° ammine primarie che formano legami amminici. Nella seconda fase, la maleimmide reagisce con i gruppi sulfidrilici formanti ponti tioestere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Menzione dei nomi commerciali dei prodotti commerciali nella pubblicazione è al solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
