Summary
のシステイン残基のチオール基の溶媒アクセス可能性を分析する手法
Abstract
ウイルスの特性と物理化学的および物理的特性を模倣して、利用することは、世界の最も緊急の課題のいくつかの解決策を提供する可能性を秘めています。薄手の範囲およびそれらの魅力的な特性と相まってウイルスの種類は潜在的にウイルスベースの技術でのアプリケーション用に無限の機会を与える。ウイルスは温度とpH幅広い条件下で離散形状や大きさ、対称性の特異性、多原子価、安定した特性を有する粒子に自己組織化する能力を持っています。驚くことではないが、プロパティのような顕著な範囲で、ウイルスが生体材料9、ワクチン14、15、電子材料、化学ツール、および分子の電子コンテナ4、5、10、11、16、18、12で使用するために提案されている。
ナノテクノロジーでウイルスを利用するためには、それらが新たな機能を付与するために彼らの自然なフォームから変更する必要があります。この挑戦的なPRocessはウイルスゲノムの遺伝子改変を含むいくつかのメカニズムを介して行われ、化学的にウイルス粒子の反応性基を8に外国又は所望の分子を結合することができます。ウイルスを変更する機能は、主にウイルスの物理化学的および物理的特性に依存します。また、遺伝的または物理化学的修飾は、悪影響ウイルスネイティブ構造とウイルス機能に影響を与えずに実行する必要があります。 トウモロコシrayadoフィノウイルス （MRFV）コートタンパク質は、タンパク質-タンパク質によって安定化されて安定しており、空のVLPを生産する大腸菌で自己集合相互作用とそのウイルスベースの技術アプリケーション8で使用することができます。タバコ工場で生産VLPはペプチドの様々な共有結合13に表示することが可能な足場として検討した。ここで、我々は、1）の手順について説明しMODIFIできますウイルスキャプシドの溶剤アクセスシステインの判別陽イオンと、2）修正されたカプシドにペプチドをバイオコンジュゲート。ネイティブまたはmutationally -挿入されたアミノ酸残基および標準カップリング技術を使用することにより、多種多様な材料は、 ブロムモザイクウイルス 3、 カーネーション斑紋ウイルス 12、 ササゲ退緑斑紋ウイルス 6、 タバコモザイクなどの植物ウイルスの表面に表示されているウイルス 17、 カブ黄斑モザイクウイルス 1、MRFV 13。
Protocol
1。 Nicotiana benthamianaの植物からウイルス接種とVLPの精製
- ポテトウイルス X（PVX）ベース運ぶベクタープラスミドから頂いた、T7-RNA転写産物を生成MRFV野生型（WT）およびCys変異コートタンパク質（CP）遺伝子12、AmbionのT7-mMessage mMachineキットを使用しています。
- 各T7転写反応には、Nの2の完全展開葉に接種10μlの反応と、25で光（25,000-30,000ルクス）で16時間、60％の湿度で、温室内で10日間インキュベートbenthamianaの植物を20℃と暗8時間℃の
- ハーベストンN. benthamianaのウイルスに感染した葉は10日後に接種（DPI）は、氷の上で植物組織（50グラム）と場所を量る。
- 0.5Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）（植物組織1グラムあたり緩衝液2mlを使用）の冷却溶液を100mlの存在下でブレンダーで植物材料をホモジナイズする。
- cheeseclの3つの層を通ってホモジネートをフィルタリングOTH、30分間27000×gで遠心分離することにより明らかにする。冷やしたメスシリンダーに上清を移し、体積を測定した後、冷却した無菌のビーカーに移す。ペレットを廃棄します。
- 、10％ポリエチレングリコール8000（PEG 8000）を添加することにより上清を処理し、4℃で15分間撹拌し、4℃でさらに45分間インキュベート℃のウイルス様粒子（VLP）-PEGのマトリックスを沈殿させる。
- 4℃で20分間27000×gで遠心し、上清を除去します。
- pH5.5のTriton X-100を2％含む、0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液8mlを加えることによってペレットを処理します。渦巻遠心管はよくペレットを解放します。チルド滅菌ビーカーにペレットとバッファを転送します。同じ緩衝液2mlで直ちにチューブをすすぎ、ビーカーに加える。ペレットは（一般的に1時間）に溶解するまで4℃で懸濁液をかき混ぜる。
- 27000×gで5分間遠心分離することにより明らかにし、ペレットを廃棄し、process 4℃で2時間14万xgで遠心分離により上清℃、
- 1ミリリットルの0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）でペレットを再懸濁し、0.05Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）で行われた百分の10から40のショ糖勾配の上に懸濁液を配置します。
- 4℃14万xgで3時間勾配を遠心
- 遠心管の上に光を当て、管の上部から4 cmの光散乱上部のバンドを集めて、4℃で0.05Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）、14万×gで3時間遠心機で薄める℃の
- 6ヶ月まで4℃で滅菌水、店舗の0.5mlにペレットを再懸濁します。
- Bradfordタンパク質アッセイを行うことにより、VLPの濃度を定量する。 VLPの収量は植物組織の1〜3μg/ gである。
2。 VLPのフルオレセイン-5 - マレイミド標識反応
- 50mMリン酸ナトリウムphosphatにおけるフルオレセイン-5 - マレイミド（427.37グラム/モル）の1mM溶液を調製電子緩衝液（pH7.0）、1 mMのEDTA。ボルテックスを用いて混和し完全に溶解させていることを確認します。アルミ箔を使用して光からチューブを保護します。
- ステップ1とミックスで生産のVLPにフルオレセイン-5 - マレイミドを追加します。スルフヒドリル基のモル量のフルオレセイン-5 - マレイミドの25倍モル過剰に使用します。一般的に、1μg/μLのとフルオレセイン-5 - マレイミド溶液60μlの濃度でVLPの30μlを使用すると、許容可能な結果を生成します。
- 4℃の室温で、または一晩で2時間反応をインキュベート
- 50mMの最終濃度までジチオスレイトール（DTT）を加えて反応を終了します。
- 削除する非反応は室温で1500×gで2分間脱塩スピンカラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォードIL）と遠心分離を用いてフルオレセイン。
- SDS-PAGE分析では、各反応液10μlに2×SDS-PAGEのLaemmliサンプルバッファー10μlを加える。 4℃で光から保護標識タンパク質を格納するまでの1ヶ月間、Cまたは最大3ヶ月まで-20°Cで単回使用アリコートインチ
3。ビオチン定款のラベリング反応と定量
- 水からのリン酸緩衝食塩水（PBS）、ステップ1で作製したVLPのpH7.0に緩衝液交換を実行するために脱塩スピンカラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォード、IL）を使用します。
- ピペッティングによりマレイミド-PEG2-ビオチンとミックスを無計量でのPBS 190μlを添加してマレイミド-PEG2-ビオチンの20mMストック溶液を調製します。
- VLPおよびミックスにマレイミド-PEG2-ビオチンを追加します。 VLPのソリューション≤2 mg / mlのための試薬の10倍モル過剰に使用します。
- 4時間室温で反応をインキュベートする。
- マレイミド-PEG2-ビオチンは、室温で1500×gで2分間脱塩スピンカラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォードIL）と遠心分離法を用いて非反応削除します。
- ピアースビオチン定量キット（サーモサイエンティフィック）とFOを使用したVLPのモル当たりビオチンのモル数を決定するメーカーの指示に従ってllowing。
4。 Cysは2-VLPおよびFのペプチドの架橋
- （2-VLPはCys）は、ステップ2で、架橋のために利用可能なシステイン残基をもたらしVLPは、次のステップで使用されます。ジメチルスルホキシドの680μlのNHS-PEG4-マレイミド架橋剤10mgを溶解させることにより、新鮮な架橋原液（28.63 mM）を準備します。
- 0.1 mMの濃度で、結合緩衝液50μlの17（F）-アミノ酸長のペプチド（LLPNMOKDKEACAKAPL）（1mM EDTAを1×PBS緩衝液、pH7.2）に溶解する。
- 1mMの最終濃度（ペプチド溶液の0.1mMのために、10倍モル過剰である）で溶解したペプチド（タンパク質-NH2）50μlに架橋剤の4μlを添加する。
- 4℃で2時間反応をインキュベート
- 1500 xgで遠心分離により、結合緩衝液（1mM EDTAを1×PBS、pH 7.2）で平衡化した脱塩カラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォード、IL）を用いて架橋されたペプチドを精製する室温で1分間。
- VLPは（タンパク質-SH）と反応し、VLPおよびペプチドの間の分子量の差に関与チオールと活性アミンの数によって決定されるモル比で架橋されたペプチド（タンパク質-NH2）を組み合わせた反応混合物を設定します。
- 4℃で2時間室温で反応混合物をインキュベート
- ウェスタンブロット分析は、Laemmli緩衝液、10分間沸騰させ、結果として得られると共役製品1:1に混ぜて10〜20％Tris-グリシンゲル（Invitrogen）プレキャストのSDS-PAGEに進み、上にエレクトロ続くニトロセルロース膜（Invitrogen社）。 1×PBS緩衝液（pH7.2）、0.05％のTween-20（PBS-Tween）でかつ適切なホスファターゼ標識二次抗体、ペプチド特異的抗体を用いて、5％スキムミルク粉末及びプローブを含有する膜をブロックします。
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Representative Results
Nの変異MRFVコートタンパク質（CP）遺伝子の一過性発現PVXベースのベクター生産VLPにおけるbenthamianaの植物は、 図1に記載されている。修正MRFVコートタンパク質遺伝子をPCRで増幅された後、PVX-basedベクター、pP2C2S 2、（D. Baulcombeの贈り物、セインズベリー研究所、ノーリッチ、イギリス）で重複サブゲノムCPのプロモーターの転写制御下に置かれた。 にあるインビトロ RNA転写はその後Nを接種するために使用されるRNA転写産物を生成benthamianaの植物 。感染した植物では（ 図2A）MRFV-CPのサブユニットは容易に精製されたVLP（ 図2B）を形成する 。その後、VLPはペプチドに架橋されています。
MRFVコートタンパク質の反応性アミノ酸の例を図3に示します。それが表面に露出している場合、選択した各アミノ酸は、部分を取り付けるために使用することができます。 chemicらの技術は、リジン、システインのsulfhydrilic基のアルキル基のアミノ基のアシル、カルボン酸残基の活性化などを追加しましたアミンとカップリング伝統的なバイオコンジュゲーション戦略が含まれています。また、チロシンおよびトリプトファンの芳香族基としては、ジアゾ化とアルキル化を通じて、バイオコンジュゲーションのための魅力的な標的であることができます。
チオール特異的試薬へのVLPのCys残基の溶媒アクセシビリティは、図4に示されている。 CP遺伝子12の精製された重量のVLP（レーン4）と位置107から111にシステイン残基を運ぶのCys-VLPの変異体（レーン1）及び192から194（レーン3）チオール特異的試薬（欠席したネイティブな条件で反応しない蛍光の）。フルオレセイン-5 - マレイミドのみCP遺伝子（レーン2）の位置が125から129でのCys-VLPの変異運ぶのシステイン残基のためにオレンジ色の蛍光を与える。結果は、レーン2のVLPは幾何学的なアランを持っていることを示しレーン1と3のサンプル中のシステイン残基は、おそらくコートタンパク質のフォールディングにおけるジスルフィド架橋に関与しているのに対し、溶剤に暴露遊離チオール基が生じるシステイン残基のgement。
ビオチン化アッセイ続いマレイミド-PEG2-ビオチンによる標識反応はCys残基の溶媒アクセシビリティの分析の他の一例を表しています。ビオチンは比較的小さな分子であるので、 図5に示すように、アビジンの1分子に結合することができ、それぞれが、VLPの上でいくつかのコピーに結合させることができる。ビオチン化のレベルは、タンパク質13のモル当たりビオチンの84.74モルは、VLPのに接続されているビオチン分子の数を示し、その結果、外面上に表示することができる配位子の数。なぜならVLPの上のいくつかのチオール基が利用できる、ペプチドは、NHS-PEG4-マレイミドとの架橋反応により結合させることができる。この試薬は彼ですアミンおよびスルフヒドリル含有分子の共有結合を可能にする、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル、マレイミド基などの反応性末端を含んでテロ二官能性架橋剤。マレイミドは、安定なチオエーテル結合を形成するスルフヒドリル基と反応するのに対し、 図6（a）に示すように、NHSエステルは、アミド結合を形成する第一級アミンと反応します。架橋反応は、 図6（b）に示すように、ウェスタンブロットにおいて特異的な抗体との免疫反応性であるのVLP-ペプチド複合体を生成します。
図1のVLPの精製やペプチドの架橋後続に続く植物におけるVLPの生産の模式図。JPG "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図2 NにT7転写産物接種によって生成症状benthamianaの植物 （）と生産のVLP（B）の透過型電子顕微鏡。
図3反応性システインアミノ酸（矢印で示されている）を示す野生型（wt）-MRFV-CPのタンパク質構造予測。
fluorosに共役のVLPの精製した図4のSDS-PAGE分析CEIN -5 -マレイミド。（a）単に青い金庫汚れは、タンパク質を染色するために使用された。紫外線照射下で（B）のフルオレセイン-5 -マレイミド検出グラフィ。 M：ジウム広範囲のタンパク質マーカー（Bio-Rad社、ヘラクレス、CA）を、1：のCys 2-VLPは、3を精製：Cysを1-VLPは、2を精製4,3-VLPのCysを精製：重量VLPを精製した。 （システイン1-VLPは、Cysは2-VLPを、およびCys 3-VLPは13のCys-MRFV-VLPの突然変異体である）。
図5（A）ビオチン標識および（B）フルオレセイン-5 -マレイミド標識のためスルフヒドリル反応性化学を示す等角VLPの= 3リボンATモデル。
図6図タンパク質架橋のCys 2-VLPおよびFのペプチド（a）及びウェスタンブロットの間を示す（B）はのCys-VLPは-fのはFペプチドに特異的な抗体でプローブした。 M：ジウム広範囲のタンパク質マーカー（Bio-Rad社、ヘラクレス、カリフォルニア）、1：ステップ4で製造したのCys-VLPは-Fが大きい図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ここで紹介する方法は、植物生産VLPの表面上だけでなく、他のタンパク質複合体上に存在する反応性のシステインの非常に高感度で迅速な分析を可能にします。マレイミドは安定なチオエーテル結合を形成する遊離スルフヒドリル含有分子と反応チオールに特異的な試薬である。この方法は、他のアミノ酸との相互作用に関与していないスルフヒドリル基と反応するマレイミドの特異性を利用している。 VLPのネイティブ構造を維持するのは、全体のプロセスを介して非常に重要です。記述されたアプリケーションでは、反応がVLPの本来の構造を維持するために、ネイティブの条件で、pH 7で実行されます。中性pHにおいて、マレイミドは遊離スルフヒドリル基との最適な反応性を有する。これは、モディフィケーションにアクセス可能なシステインにフルオレセインまたはビオチンのいずれかで、VLPのラベル付けができます。
軽度のpH（6.5から7.5）と緩衝液の条件はまた、架橋に用いられている反応。 VLPは上の官能基の数は、架橋剤とVLPの間の適切な比率を決定する。タンパク質の比が低い架橋剤は多くの官能基が存在する場合に使用することができます。逆に、タンパク質の比率を高く架橋剤は、より少ない使用可能な官能基で採用されている。
スペースアーム、開裂性、化学組成、寸法、および溶解性などの要因の配列は、最終的に使用される架橋剤の選択を決定する。また、使用する架橋剤の選択はまた、共役に関与する2つのタンパク質のサイズ（この場合VLPおよびペプチド）の関数である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質 - タンパク質の架橋のために理想的です。彼らはホモ二官能性NHS-エステル試薬が使用されているときに発生する自己共役望ましくない重合を最小限に抑える、より制御され2段階反応を可能にします。最初のステップでは、NHSエステルはwiを反応アミノ結合を形成番目の第一級アミン。第二段階では、マレイミドはチオエステル結合を形成するスルフヒドリル基と反応する。
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Disclosures
パブリケーション内の商用製品の商標名への言及は、特定の情報を提供する目的のためだけであり、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
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