Summary
En metode for å analysere løsningsmidlet tilgjengeligheten av tiolgruppe av cysteinrester av
Abstract
Etterligne og utnytte virus egenskaper og fysisk-kjemiske og fysiske egenskaper holder løftet å tilby løsninger til noen av verdens mest presserende utfordringer. Selve området og typer virus kombinert med deres spennende egenskaper potensielt gi uendelige muligheter for applikasjoner i virus-baserte teknologier. Virus har evnen til selv montere inn partikler med diskrete form og størrelse, spesifisitet symmetri, polyvalence og stabile egenskaper under et bredt temperaturområde og pH-betingelser. Ikke overraskende, med en slik bemerkelsesverdig spekter av egenskaper, er virus foreslått for bruk i biomaterialer 9, vaksiner 14, 15, elektroniske materialer, kjemiske verktøy og molekylær elektronisk 4 containere, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
For å utnytte virus i nanoteknologi, må de endres fra sine naturlige former for å formidle nye funksjoner. Dette utfordrende process kan utføres gjennom flere mekanismer inkludert genetisk modifisering av det virale genom og kjemisk feste utenlandske eller ønskede molekyler til viruspartikkel reaktive grupper 8. Muligheten til å endre et virus avhenger hovedsakelig på de fysiokjemiske og fysiske egenskaper av viruset. I tillegg, den genetiske eller fysiokjemiske modifikasjoner må utføres uten skadelig virkning på viruset innfødte struktur og virus funksjon. Mais rayado fino virus (MRFV) belegge proteiner selv sette sammen i Escherichia coli som produserer stabile og tom VLP som er stabilisert av protein-protein interaksjoner og som kan brukes i virus-baserte teknologier anvendelser 8. VLP produsert tobakksplanter ble undersøkt som et stillas som en rekke peptider kan kovalent vises 13. Her beskriver vi trinnene til 1) bestemmer hvilke av de løsningsmiddel-tilgjengelige cysteinene i et virus kapsid er tilgjengelig for modifikation, og 2) Bioconjugate peptider til de endrede capsids. Ved å bruke Native eller mutationally-innsatt aminosyrerester og standardforskruning teknologier har et bredt utvalg av materialer blitt vist på overflaten av plante virus såsom Brome mosaikk virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea anemiske mottle virus 6, tobakk mosaikk virus 17, Turnip gul mosaikk virus 1 og 13 MRFV.
Protocol
1. Virus Inokulasjon og VLP Rensing fra Nicotiana benthamiana Planter
- Produser avkortet T7-RNA transkripsjoner fra Potato virus X (PVX)-baserte vektor plasmider som bærer MRFV villtype (wt) og Cys-mutert strøk protein (CP) gener 12, med Ambion er T7-mMessage mMachine Kit.
- For hver T7 avskrift reaksjon, vaksinere to fullt utvidet blader av N. benthamiana med 10 pl reaksjoner og inkuber plantene for 10 dager i drivhus, ved 60% fuktighet i 16 timer med lys (25000-30000 lux) ved 25 ° C og 8 timers mørke ved 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana virus-infiserte blader 10 dager etter vaksinasjonen (dpi), veie plantevev (50 gram) og legg på is.
- Homogenisere plantematerialet i en blender i nærvær av 100 ml av en avkjølt oppløsning av 0,5 M Na-citrat-buffer, pH 5,5 (bruk 2 ml buffer per gram plantevev).
- Filtrere homogenat gjennom 3 lag med cheesecloth og avklare ved sentrifugering ved 27000 xg i 30 min. Overfør supernatanten til et kjølt målesylinder, måle volumet, og deretter overføre til en kjølt steril begerglass. Kast pellet.
- Behandle supernatanten ved tilsetning av 10% polyetylenglykol 8000 (PEG 8000), omrør i 15 min ved 4 ° C, og inkuber i ytterligere 45 min ved 4 ° C for å utfelle de viruslignende partikler (VLP)-PEG matrix.
- Sentrifuger prøven ved 27.000 xg i 20 min ved 4 ° C og fjerne supernatanten.
- Behandle pelleten ved tilsetning 8 ml av 0,05 M Na-citrat-buffer, pH 5,5 inneholdende 2% Triton X-100. Virvel Sentrifugerørene godt å frigjøre pelleten. Overfør pellet og buffer til en kjølt steril begerglass. Skyll rørene umiddelbart med 2 ml av den samme buffer og legge til begerglasset. Omrør suspensjonen ved 4 ° C inntil pelletsene er oppløst (vanligvis 1 time).
- Avklare ved sentrifugering i 5 min ved 27 000 xg, kast pellet, og process supernatanten ved sentrifugering ved 140.000 xg i 2 timer ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten i 1 ml 0,05 M Na-citrat-buffer, pH 5,5 og plassere suspensjonen på toppen av en 10-40% sukrosegradient laget i 0,05 M Na-citrat-buffer, pH 5,5.
- Sentrifuger gradienten i 3 timer ved 140.000 xg ved 4 ° C.
- Skinne et lys over toppen av sentrifugerøret og samle lys-spredning øvre band på 4 cm fra toppen av røret, fortynn med 0,05 M Na-citrat-buffer, pH 5,5, og sentrifuger i 3 timer ved 140.000 xg ved 4 ° C.
- Resuspender pellet i 0,5 ml sterilt vann og oppbevar ved 4 ° C i inntil seks måneder.
- Kvantifisere VLP konsentrasjonen ved å utføre en Bradford protein assay. Utbyttet av VLP er mellom 1 og 3 ug / g av plantevev.
2. Fluorescein-5-maleimid-merking Reaksjoner av VLP
- Forberede en 1 mM oppløsning av fluorescein-5-maleimid (427,37 g / mol) i 50 mM natrium Phosphate-buffer, pH 7,0, 1 mM EDTA. Bland med vortex og verifisere fullstendig oppløsning. Beskytt røret fra lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
- Legg fluorescein-5-maleimid til VLP produsert i trinn 1 og bland. Bruk en 25-ganger molart overskudd av fluorescein-5-maleimid for molare mengden av sulfhydryls. Vanligvis bruker 30 pl av VLP i konsentrasjon på 1 pg / pl og 60 pl av den fluorescein-5-maleimid løsning produserer akseptable resultater.
- Inkuber reaksjonen i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Avslutte reaksjonen ved tilsetning av ditiotreitol (DTT) til en endelig konsentrasjon på 50 mM.
- Fjerne ikke-omsatt fluorescein bruke en avsalting spinn kolonne (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) og sentrifugering i 2 minutter ved 1500 xg ved romtemperatur.
- For SDS-PAGE-analyse, tilsett 10 pl av 2 x SDS-PAGE Laemmli prøvebuffer til 10 ul av hver reaksjon. Oppbevar merket protein beskyttes mot lys ved 4 ° C i opp til en måned elleri engangsbeholdere alikvoter ved -20 ° C opp til 3 måneder.
3. Merking Reaction og Bestemmelse av Biotin innlemmelse
- Bruk avsalting spin kolonner (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) for å utføre en buffer utveksling fra vann til fosfat-bufret saltløsning (PBS), pH 7,0 av VLP fremstilt i trinn 1.
- Forberede en 20 mM stamløsning av maleimid-PEG2-biotin ved tilsetning 190 ul PBS i No-Vei maleimid-PEG2-biotin og bland ved å pipettere opp og ned.
- Legg maleimid-PEG2-biotin til VLP og bland. Bruke en 10-ganger molart overskudd av reagens for VLP løsninger ≤ 2 mg / ml.
- Inkuber reaksjonen ved romtemperatur i 4 timer.
- Fjerne ikke-reagerte maleimid-PEG2-biotin ved hjelp av en avsalting spinn kolonne (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) og sentrifugering i 2 minutter ved 1500 xg ved romtemperatur.
- Bestem mol biotin per mol VLP bruker Pierce Biotin Kvantitering Kit (Thermo Scientific) og following produsentens instruksjoner.
4. Cross-linking av Cys 2-VLP og F Peptide
- VLP som resulterte i tilgjengelige cysteinrester for tverrbinding i trinn 2 (Cys 2-VLP) blir brukt i det følgende trinn. Forbered en frisk kryssbinding stamløsningen (28,63 mM) ved å oppløse 10 mg av NHS-PEG4-maleimid tverrbindingsmidlet i 680 ul dimetylsulfoksyd.
- Oppløse en 17 (F)-aminosyre lang peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) i 50 pl av konjugering buffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) ved en konsentrasjon på 0,1 mM.
- Tilsett 4 pl tverrbindingsmidlet til 50 pl av det oppløste peptid (protein-NH2) ved 1 mM sluttkonsentrasjon (som er en 10-ganger molart overskudd i 0,1 mM peptid løsning).
- Inkuber reaksjonen i 2 timer ved 4 ° C.
- Rens tverrbundet peptid ved hjelp av en avsalting kolonne (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) ekvilibrert med konjugering buffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) ved sentrifugering ved 1500 xgi 1 min ved romtemperatur.
- Sett opp en reaksjon som kombinerer VLP (protein-SH) og kryssbundet peptid (protein-NH2) i et molart forhold bestemmes av antall av tioler og aktivert aminer involvert i reaksjonen og forskjellen i molekylvekt mellom VLP og peptid.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 2 timer ved 4 ° C.
- For Western blot-analyse, bland resulterende konjugerte produktet 1:1 med Laemmli-buffer, kok i 10 min, og fortsette med SDS-PAGE på en pre-støpt 10-20% Tris-Glycine gel (Invitrogen), etterfulgt av electroblotting på en nitrocellulose membran (Invitrogen). Blokker membraner med 1 x PBS, pH 7,2 inneholdende 0,05% Tween-20 (PBS-Tween), og 5% skummet melkepulver og sonde med peptid-spesifikke antistoffer etterfulgt av den aktuelle fosfatase-merket sekundært antistoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forbigående uttrykk av muterte MRFV frakk protein (CP) gener i N. benthamiana planter i en PVX-baserte vektor produserende VLP er beskrevet i figur 1. Modifisert MRFV belegge protein genet forsterkes ved PCR og deretter plassert under den transkripsjonelle kontroll av det dupliserte subgenome CP promoter i en PVX-basert vektor, 2 pP2C2S, (en gave fra D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, England). I vitro RNA transkripsjon produserer RNA-transkripter som deretter brukes for å inokulere N. benthamiana planter. I de infiserte plantene (figur 2A) MRFV-CP subenheter danner VLP (figur 2B) som er lett renset. Dermed blir VLP tverrbundet til peptider.
Et eksempel av reaktive aminosyrer av MRFV belegge proteinet er vist i figur 3.. Hver aminosyre valgt kan brukes til å feste delene hvis det er overflate eksponert. Den chemical teknikker inkluderer tradisjonelle bioconjugation strategier som, acylering av aminogruppen av lysin, alkylering av sulfhydrilic gruppen av cystein, og aktivering av karboksylsyren rester og kopling med ekstra aminer. I tillegg, kan de aromatiske grupper av tyrosin og tryptofan være attraktive mål for bioconjugation gjennom diazotiseringen og alkylering.
Løsningsmidlet tilgangen Cys rester av VLP til tiol-spesifikke reagenser er illustrert i Figur 4. Renset wt-VLP (felt 4) og Cys-VLP mutanter bærer cysteinrester i posisjon 107-111 (kolonne 1) og 192-194 (søyle 3) av CP genet 12 er reaktivt i native forhold med tiol-spesifikk reagens (fravær av fluorescens). Fluorescein-5-maleimid imparts oransje fluorescens bare for de Cys-VLP mutant bærer cysteinrester i posisjon 125-129 av CP genet (felt 2). Resultatet viser at VLP i felt 2 har et geometrisk arrangement av cysteinene reststoffer i oppløsningsmiddel-eksponerte frie tiolgrupper, mens cysteinrester i prøvene, i baner 1 og 3 er kanskje involvert i disulfid broer i folding av pelsen protein.
Merking reaksjoner med maleimid-PEG2-biotin fulgt av en biotinylation analysen representere et annet eksempel på analyse av oppløsningsmiddel tilgjengelighet av Cys rester. Fordi biotin er et relativt lite molekyl, kan det være konjugert i flere kopier på VLP, som hver kan binde ett molekyl av avidin som vist i Figur 5. Nivået av biotinylation indikerer 84,74 mol biotin per mol protein 13, antall av biotin molekyler festet til VLP og følgelig antall ligander som kan vises på den ytre overflate. På grunn av tilgjengeligheten av flere tiolgrupper på VLP kan peptider festes ved kryssbinding reaksjoner med NHS-PEG4-maleimid. Dette reagens er et han Tero-bifunksjonell tverrbinder som inneholder reaktive ender slik som N-hydroksysuksinimid (NHS) ester og maleimid grupper, slik kovalent konjugering av amin-og sulfhydryl-holdige molekyler. Som vist i figur 6A, reagerer NHS ester med primære aminer danner amidbindinger, mens maleimid reagerer med sulfhydrylgrupper danner stabile tioeter obligasjoner. Fornettende reaksjoner produserer VLP-peptid komplekser som er immunoreaktiv med de spesifikke antistoffer i Western blot, som vist i figur 6B.
Figur 1. Skjematisk diagram av produksjonen av VLP i planter, etterfulgt av VLP rensing og påfølgende kryssbinding av peptider.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. Symptomer produsert av T7 transkripsjoner vaksinasjon på N. benthamiana planter (A) og transmisjonselektronmikroskopi av de produserte VLP (B).
Figur 3. En proteinstruktur prediksjon av villtype (wt)-MRFV-CP som viser reaktive cystein aminosyrer (angitt med pilene).
Figur 4. SDS-PAGE-analyse av renset VLP konjugert til fluoroscein-5-maleimid. (A) Simply blå trygt flekken ble brukt til stain proteiner. (B) Fluorescein-5-maleimid deteksjon ved fotografering under UV belysning. M: Prestained bredt spekter protein markør (Bio-Rad, Hercules, CA), en: renset Cys 1-VLP, 2: renset Cys 2-VLP, 3: renset Cys 3-VLP, 4: rensede wt VLP. (Cys 1-VLP, Cys 2-VLP, og Cys 3-VLP er Cys-MRFV-VLP mutanter 13).
Figur 5. AT = 3 bånd modell av isometriske VLP viser sulfhydryl reaktive kjemi for (A) biotin merking og (B) fluorescein-5-maleimid merking.
Figur 6. Diagram illustrerer protein tverrbinding mellom Cys 2-VLP og F peptid (A) og Western blot (B) av Cys-VLP-F probet med spesifikke antistoffer til F peptid. M: Prestained bredt spekter protein markør (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F produsert i trinn 4 Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presenteres her muliggjør en meget følsom og rask analyse av reaktive cysteinene tilstede på overflaten av plante-produsert VLP samt andre protein komplekser. Maleimides er thiol-spesifikke reagenser, som reagerer med frie sulfhydryl-holdige molekyler for å danne stabile tioeter obligasjoner. Denne metoden bygger på spesifisiteten av maleimides å reagere med sulfhydryl grupper som ikke er involvert i interaksjoner med andre aminosyrer. Bevaring av lokale struktur VLP er svært viktig gjennom hele prosessen. I søknaden beskrives, blir reaksjonene utført i native forhold og ved pH 7 for å opprettholde den opprinnelige struktur av VLP. Ved nøytral pH, maleimides har optimal reaktivitet med frie sulfhydrylgrupper. Dette tillater merking av VLP med enten fluorescein eller biotin til cystein tilgjengelig for modifikasjoner.
Mild pH (6,5 til 7,5) og buffer forholdene er også anvendt i den fornettendereaksjoner. Antallet funksjonelle grupper på VLP fastsetter forholdet mellom tverrbindingsmidlet og VLP. Lavere tverrbindingsmidlet til protein forhold kan brukes i tilfeller der det er mange funksjonelle grupper. Omvendt er en høyere tverrbindingsmidlet til protein ratio ansatt med færre tilgjengelige funksjonelle grupper.
En rekke faktorer, inkludert plass arm, cleavability, kjemisk sammensetning, dimensjon og oppløselighet sist avgjør valget av kryssbindere benyttes. I tillegg, er valget av tverrbindingsmidlet benyttes også en funksjon av størrelsen av de to proteiner (i dette tilfellet VLP og peptid) involvert i konjugasjon. Hetero-bifunksjonelle tverrbindere er ideelle for protein-peptid eller protein-protein tverrbinding. De tillater mer kontrollerte to-trinns reaksjoner som minimerer den uønskede selv-konjugering og polymerisasjon som oppstår når homo-bifunksjonelle NHS-ester reagensene brukes. I det første trinn, reagerer NHS ester with primære aminer danner aminosyrer obligasjoner. I det andre trinnet, reagerer maleimid med sulfhydrylgrupper forming thioester obligasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omtale av varenavn av kommersielle produkter i publikasjonen er utelukkende i den hensikt å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av US Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
