Summary
Um método para analisar a acessibilidade do solvente do grupo tiol de resíduos de cisteína de
Abstract
Imitando e explorar as propriedades e características físico-químicas, vírus e física tem a promessa de fornecer soluções para alguns dos desafios mais prementes do mundo. A variedade e tipos de vírus, juntamente com suas propriedades intrigantes, potencialmente, dar oportunidades infinitas para aplicações em tecnologias baseadas em vírus. Vírus têm a capacidade de se auto-organizar em partículas com forma e tamanho discreto, a especificidade de simetria, polivalência e propriedades estáveis sob uma variedade de condições de temperatura e pH. Não surpreendentemente, com uma gama tão extraordinária de propriedades, os vírus são propostas para uso em biomateriais 9, 14, 15 vacinas, materiais eletrônicos, ferramentas químicas e molecular recipientes eletrônico 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
A fim de utilizar os vírus em nanotecnologia, eles devem ser modificados a partir de suas formas naturais para conferir novas funções. Este pr desafiadorocesso pode ser realizada através de vários mecanismos, incluindo a modificação genética do genoma virai e a fixação de moléculas quimicamente estrangeiras ou desejado para as partículas de vírus grupos reactivos 8. A capacidade de modificar vírus principalmente depende das propriedades físico-químicas e físicas do vírus. Além disso, as modificações genéticas ou físico-química precisam ser executadas sem afectar adversamente a estrutura do vírus nativo e função do vírus. Maize rayado fino vírus proteínas (MRFV) revestimento auto-montar em Escherichia coli produtoras de VLPs estáveis e vazios que são estabilizadas por proteína-proteína interações e que pode ser usado em aplicações baseadas em tecnologias vírus 8. VLPs produzidas em plantas de tabaco foram examinados como um andaime sobre o qual uma grande variedade de péptidos pode ser covalentemente exibida 13. Aqui, descrevem-se as etapas de: 1) determinar quais as cisteínas solventes acessíveis em um capsídeo do vírus estão disponíveis para modificaçãocação, e 2) Bioconjugate péptidos aos capsídios modificados. Usando nativas ou mutationally-inserido resíduos de aminoácidos e as tecnologias de acoplamento normalizados, uma grande variedade de materiais tem sido apresentados na superfície de vírus de plantas, tais como, o vírus do mosaico Brome 3, vírus Carnation mottle 12, Cowpea cloróticas mottle virus 6, do mosaico do tabaco 17 vírus, o vírus do mosaico do nabo amarelo 1, e MRFV 13.
Protocol
1. A inoculação do vírus e purificação de VLPs Plantas de Nicotiana benthamiana
- Produzir seladas T7-RNA transcritos a partir de Potato virus X (PVX) baseados em plasmídeos vector transportando MRFV de tipo selvagem (wt) e da proteína de revestimento Cys-mutada (CP) genes 12, utilizando T7-mMessage Ambion de mMachine Kit.
- Para cada reacção de transcrição de T7, inocular duas folhas completamente expandidas de N. benthamiana com 10 ul de reacções e incuba-se as plantas durante 10 dias em estufa, a uma humidade de 60% durante 16 h com luz (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 horas escuro a 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana infectadas por vírus folhas 10 dias após a inoculação (dpi), pesar o tecido vegetal (50 gramas) e colocar em gelo.
- Homogeneizar o material de planta em um misturador em presença de 100 ml de uma solução gelada de 0,5 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5 (o uso de 2 ml de tampão por grama de tecido de planta).
- Filtrar homogenato através de 3 camadas de cheeseclOTH e clarificar através de centrifugação a 27.000 xg durante 30 min. Transferir o sobrenadante em um cilindro refrigerado graduada, medir o volume, e depois transferir para um copo gelado estéril. Descartar o sedimento.
- Processar-se o sobrenadante por adição de polietileno glicol 8000 a 10% (PEG 8000), agita-se durante 15 min a 4 ° C, e incubar durante mais 45 minutos a 4 ° C para precipitar as partículas semelhantes a vírus (VLPs) de PEG-matriz.
- Centrifugar a amostra a 27.000 xg durante 20 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante.
- Processar o sedimento, adicionando 8 ml de 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5, contendo 2% de Triton X-100. Redemoinho tubos da centrífuga bem para liberar o sedimento. Transferir o sedimento e tampão para um copo de gelado estéril. Enxaguar imediatamente os tubos com 2 ml do mesmo tampão e adicionar ao copo. Agita-se a suspensão a 4 ° C até que os grânulos são dissolvidos (em geral 1 hora).
- Clarificar por centrifugação durante 5 min a 27.000 xg, rejeitar o sedimento, e process o sobrenadante por centrifugação a 140000 xg durante 2 horas a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de 0,05 M de Na-citrato, pH 5,5 e colocar a suspensão no topo de um gradiente de sacarose 10-40% feita em 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5.
- Centrifuga-se o gradiente durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C.
- Brilhar uma luz sobre o topo do tubo da centrífuga e recolher a banda de dispersão da luz superior a 4 cm a partir do topo do tubo, diluiu-se com 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5.5, e centrifuga-se durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 0,5 ml de água estéril e armazenar a 4 ° C durante até seis meses.
- Quantificar a concentração de VLPs por realização de um ensaio de proteína de Bradford. O rendimento de VLPs está entre 1 e 3 ng / g de tecido da planta.
2. Fluoresceína-5-maleimida rotulagem Reações de VLP
- Prepara-se uma solução 1 mM de f luoresceina-5-maleimida (427,37 g / mole) em 50 mM de sódio phosphate tampão, pH 7,0, 1 mM de EDTA. Misturar utilizando o vórtice e verificar dissolução completa. Proteger o tubo de luz, utilizando uma folha de alumínio.
- Adicionar fluoresceína-5-maleimida de VLPs produzidas no passo 1 e misturar. Usar um excesso de 25 vezes molar de f luoresceina-5-maleimida para a quantidade molar de sulfidrilos. Geralmente, utilizar-se 30 ul de partículas VLP, na concentração de 1 ug / ul e 60 ul da solução de fluoresceína-5-maleimida produz resultados aceitáveis.
- Incubar a mistura reaccional durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Terminar a reacção por adição de ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 50 mM.
- Remover não reagidos fluoresceína, utilizando uma coluna de spin de dessalinização (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugação durante 2 minutos a 1500 xg à temperatura ambiente.
- Por análise de SDS-PAGE, adicionam-se 10 ul de 2 x tampão de amostra de SDS-PAGE de Laemmli a 10 ul de cada reacção. Armazenar a proteína marcada ao abrigo da luz a 4 ° C, durante até um mês oude utilização única em alíquotas a -20 ° C até 3 meses.
3. Reação rotulagem e determinação de Incorporação Biotina
- Use colunas de centrifugação de dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) para realizar uma permuta de tampão de água a uma solução de tampão fosfato salino (PBS), pH 7,0 as VLPs produzidas no passo 1.
- Prepare uma solução de 20 mM de maleimida-PEG2-biotina, adicionando 190 ul de PBS em No-Pesar maleimida PEG2-biotina e misture pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar maleimida-PEG2-biotina para as VLPs e misturar. Usar um excesso molar de 10 vezes de reagente de VLPs soluções ≤ 2 mg / ml.
- Incubar a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas.
- Remover não reagidos maleimida-PEG2-biotina, utilizando uma coluna de dessalinização de spin (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugação durante 2 minutos a 1500 xg à temperatura ambiente.
- Determinar as moles de biotina por moles de VLPs utilizando o Kit Pierce Quantitation Biotina (Thermo Scientific) e following instruções do fabricante.
4. A ligação cruzada de 2-Cys e VLPs Peptide F
- VLPs que resultou em resíduos de cisteína disponível para a ligação cruzada no passo 2 (2-Cys VLPs) são utilizados no passo seguinte. Preparar uma solução-mãe fresca de reticulação (28,63 mM) por dissolução de 10 mg de agente de reticulação-NHS-PEG4-maleimida em 680 uL de sulfóxido de dimetilo.
- Dissolver a 17 (F)-amino ácido do péptido longo (LLPNMOKDKEACAKAPL) em 50 ul de tampão de conjugação (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM de EDTA) a uma concentração de 0,1 mM.
- Adicionar 4 ul de agente de reticulação de 50 ul de péptido dissolvido (proteína-NH2) a uma concentração de mM final (que é um excesso molar de 10 vezes para 0,1 mM de solução de péptido).
- Incubar a mistura reaccional durante 2 horas a 4 ° C.
- Purificar reticulado péptido utilizando uma coluna de dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrada com tampão de conjugação (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) por centrifugação a 1500 xg, durante 1 minuto à temperatura ambiente.
- Defina-se a mistura de reacção combinando VLPs (proteína-SH) e de ligação cruzada de péptidos (proteína-NH2), em uma proporção molar determinada pelo número de aminas e tióis activados envolvidos na reacção e a diferença de peso molecular entre VLPs e peptídicas.
- Incubar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas a 4 ° C.
- Para a análise de Western blot, misturar o produto resultante conjugado de 1:1 com tampão Laemmli, deixar ferver por 10 minutos, e continuar com SDS-PAGE num molde pré-10-20% de Tris-Glicina gel (Invitrogen), seguido de electrotransferência para uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen). Bloquear as membranas com 1 x PBS, pH 7,2, contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) e leite em pó desnatado a 5% e com sonda de anticorpos específicos do péptido, seguido pelo anticorpo marcado com fosfatase secundário apropriado.
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Representative Results
Expressão transitória de mutantes casaco MRFV proteína (PB) genes em N. benthamiana plantas em um PVX VLPs baseadas em vetor produção está descrito na Figura 1. A modificação MRFV gene da proteína da cápside é amplificado por PCR e, em seguida, colocado sob o controlo transcricional do promotor duplicado subgenómico CP num vector baseado PVX, pP2C2S 2, (uma oferta de D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inglaterra). Na transcrição de ARN in vitro produz transcritos de RNA que são então usados para inocular N. plantas benthamiana. Nas plantas infectadas (figura 2A) MRFV-CP subunidades formam VLP (Figura 2B), que são facilmente purificados. Posteriormente, as VLPs são reticuladas a peptídeos.
Um exemplo de aminoácidos reactivos da proteína de revestimento MRFV é mostrado na Figura 3. Cada aminoácido seleccionado pode ser utilizado para ligar porções se for superfície exposta. O chemictécnicas al bioconjugação incluem estratégias tradicionais, tais como, a acilação do grupo amino da lisina, a alquilação do grupo sulfhydrilic de cisteína, e activação de resíduos de ácido carboxílico e acoplamento com aminas adicionados. Além disso, os grupos aromáticos da tirosina e triptofano podem ser alvos atraentes para bioconjugação através de diazotização e alquilação.
A acessibilidade de solvente de resíduos Cys de VLPs a reagentes específicos tiol é ilustrado na Figura 4. Wt-VLP purificada (pista 4) e Cys-VLP mutantes que transportam os resíduos de cisteína na posição 107-111 (pista 1) e 192-194 (pista 3), do gene PC 12 não são reactivos nas condições nativas com tiol reagente específico (ausência de fluorescência). F luoresceina-5-maleimida transmite fluorescência laranja apenas para os mutantes Cys-VLP que transportam resíduos de cisteína na posição 125-129 do gene da CP (pista 2). O resultado mostra que as VLPs do poço 2 têm um arran geométricagamento dos resíduos de cisteínas, resultando em solvente expostas grupos tiol livres, ao passo que os resíduos de cisteína nas amostras nas pistas 1 e 3 são talvez envolvidos em pontes de dissulfureto na dobra da proteína de revestimento.
As reacções de etiquetagem com maleimida-PEG2-biotina, seguido por um ensaio de biotinilação representam um outro exemplo de análise de acessibilidade de solvente de resíduos de Cys. Porque a biotina é uma molécula relativamente pequena, pode ser conjugado em várias cópias nas VLPs, cada um dos quais pode ligar uma molécula de avidina, como mostrado na Figura 5. O nível de biotinilação, 84,74 mol de biotina por cada mole de proteína 13, indica o número de moléculas de biotina ligados às VLPs e, consequentemente, o número de ligantes que podem ser apresentados sobre a superfície exterior. Devido à disponibilidade de vários grupos tiol sobre as VLP, os péptidos podem ser ligados por ligações cruzadas reacções com NHS-PEG4-maleimida. Este reagente é ele tero-bifuncional agente de reticulação que contém extremidades reactivas, tais como N-hidroxissuccinimida (NHS) e grupos maleimida, permitindo a conjugação covalente de moléculas de amina e contendo sulfidrilo. Como mostrado na Figura 6A, o éster de NHS reage com aminas primárias que formam ligações de amida, enquanto que maleimida reage com os grupos sulfidrilo formando ligações tioéter estáveis. As reacções de ligação cruzada produzir VLPs-péptido, que são imunorreactivos com os anticorpos específicos em Western blot, como mostrado na Figura 6B.
Figura 1. Representação esquemática da produção de VLPs nas plantas, seguido por purificação de VLPs e subsequente reticulação dos péptidos."target =" _blank jpg "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 2. Sintomas produzidos por T7 transcrições inoculação em N. benthamiana plantas (A) e microscopia electrónica de transmissão das VLPs produzidas (B).
Figura 3. A previsão da estrutura de proteínas do tipo selvagem (wt)-MRFV-CP mostrando ácidos aminados cisteína reactivos (indicados por setas).
Figura 4. Análise SDS-PAGE da VLP purificada conjugados com fluoroscopiaCEIN-5-maleimida. (A) Simplesmente mancha azul cofre foi usado para manchar proteínas. (B) a detecção de fluoresceína-5-maleimida pela fotografia sob iluminação UV. M: marcador de proteína pré-corados largo intervalo (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: 1-Cys purificada VLPs, 2: 2-Cys purificada VLPs, 3: 3-Cys purificada VLPs, 4: VLP purificadas em peso. (1-Cys Cys VLPs, 2-VLP e Cys 3-VLP são Cys-MRFV-VLP mutantes 13).
Figura 5. AT = modelo 3 fita de VLPs isométrica mostrando a química sulfidrilo reactivo para (A) e rotulagem biotina (B) de rotulagem de fluoresceína-5-maleimida.
Figura Diagrama 6. Ilustrando proteína de ligação cruzada entre Cys 2-VLP e péptido F (A) e Western blot (B) de VLP-Cys-F sondadas com anticorpos específicos para F peptídeo. M: marcador de proteína pré-corados largo intervalo (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-F-VLPs produzidas no passo 4 para ver figura maior .
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Discussion
O método aqui apresentado permite uma análise muito sensível e rápida de cisteínas reactivos presentes na superfície das plantas produzidas VLPs, bem como em outros complexos de proteínas. As maleimidas são específicas de reagentes de tiol, que reagem com o grupo sulfidrilo livre que contêm moléculas de modo a formar ligações tioéter estáveis. Este método baseia-se na especificidade das maleimidas para reagir com grupos sulfidrilo que não estão envolvidos em interacções com outros aminoácidos. A preservação da estrutura nativa das VLPs é muito importante em todo o processo. Na aplicação descrita, as reacções são realizadas em condições nativas e a pH 7 para manter a estrutura nativa das VLPs. A pH neutro, maleimidas tenha reactividade óptima com grupos sulfidrilo livres. Isto permite que a rotulagem das VLPs com fluoresceína ou biotina ou a cisteína acessível para modificações.
Ligeiro pH (6,5-7,5) e as condições de tampão são também utilizados na reticulaçãoreacções. O número de grupos funcionais nas VLPs determina a relação apropriada entre o agente de reticulação e as partículas VLP. Lower cross-linker para proporções de proteína pode ser utilizada em casos em que há muitos grupos funcionais. Por outro lado, um agente de reticulação superior a proporção de proteína é empregue com menos grupos funcionais disponíveis.
Uma matriz de factores, incluindo o braço de espaço, cleavability, composição química, dimensão, e em última análise, determinar a solubilidade da selecção de reticuladores utilizados. Além disso, a escolha do agente de reticulação utilizado é também uma função do tamanho das duas proteínas (neste caso, as partículas VLP e peptídicos) envolvido na conjugação. Hetero-bifuncionais reticulantes são ideais para a proteína ou péptido-proteína-proteína de reticulação. Eles permitem que mais controlados de duas etapas, que minimizam as reacções a indesejável de auto-e a conjugação de polimerização a qual ocorre quando homo-bifuncionais NHS de éster e os reagentes são utilizados. No primeiro passo, o éster de NHS reage with aminas primárias que formam ligações amino. No segundo passo, a maleimida reage com os grupos sulfidrilo formando ligações tioéster.
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Disclosures
Menção dos nomes comerciais de produtos comerciais na publicação é exclusivamente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
