Summary
En metod för att analysera lösningsmedlet tillgängligheten av tiolgruppen av cysteinrester i
Abstract
Efterlikna och utnyttja virus egenskaper och fysikalisk-kemiska och fysiska egenskaper har förutsättningar att tillhandahålla lösningar till några av världens mest akuta utmaningar. Det stora sortimentet och typer av virus i kombination med deras spännande egenskaper ger potentiellt oändliga möjligheter för applikationer i virus-baserade tekniker. Virus har förmågan att själv montera in partiklar med diskret form och storlek, specificitet symmetri, mångsidighet och stabila egenskaper under en lång rad av temperatur-och pH-förhållanden. Inte överraskande, med en sådan anmärkningsvärd uppsättning egenskaper är virus föreslagits för användning i biomaterial 9, 14 vacciner, 15, elektroniska material, verktyg kemiska och molekylär elektronisk behållare 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
För att utnyttja virus i nanoteknik, måste de ändras från sina naturliga former för att ge nya funktioner. Denna utmanande process kan utföras genom flera mekanismer, inklusive genetisk modifiering av det virala genomet och kemiskt fästa utländska eller önskad molekyler till de reaktiva viruspartikel grupperna 8. Förmågan att modifiera ett virus beror primärt på de fysiokemiska och fysikaliska egenskaper hos viruset. Dessutom genetiska eller fysiokemiska ändringar behöver göras utan att negativt påverka viruset nativa struktur och virus funktion. Majs rayado fino virus (MRFV) höljeproteiner själv montera i Escherichia coli som producerar stabila och tomma VLP som stabiliseras genom protein-protein interaktioner och som kan användas i virus-baserade tekniker applikationer 8. VLP som produceras i tobaksplantor undersöktes som en klätterställning som olika peptider kan kovalent visas 13. Här beskriver vi stegen att 1) bestämma vilka av de lösningsmedel-åtkomliga cysteiner i ett virus kapsid är tillgängliga för modifikatjon, och 2) biokonjugatet peptider till de modifierade kapsider. Genom att använda naturliga eller mutationellt-in aminosyrarester och standardkoppling teknik, har en mängd olika material visats på ytan av växtvirus såsom Brome viruset 3, Nejlika mottle virus 12, Cowpea klorotiska mottle virus 6, tobak mosaik virus 17, kålrot gul viruset 1 och MRFV 13.
Protocol
1. Virus Inokulation och VLP Rening från Nicotiana benthamiana Växter
- Producera täckta T7-RNA-transkript från potatisvirus X (PVX)-baserade vektorplasmider bär MRFV vildtyp (wt) och Cys-muterade höljeproteinet (CP) generna 12, med användning av Ambion s T7-mMessage mMachine Kit.
- För varje T7 transkript reaktion, inokulera två helt utvecklade blad av N. benthamiana med 10 pl reaktioner och inkubera anläggningar för 10 dagar i växthus, vid 60% fuktighet under 16 timmar med ljus (25,000-30,000 lux) vid 25 ° C och 8 h mörker vid 20 ° C.
- Avverkning t N. benthamiana virus-infekterade blad 10 dagar efter inokulering (dpi), väger växtvävnaden (50 gram) och placera på is.
- Homogenisera växtmaterialet i en bländare i närvaro av 100 ml av en kyld lösning av 0,5 M Na-citrat-buffert, pH 5,5 (användning 2 ml buffert per gram växtvävnad).
- Filtrera homogenat genom 3 lager av cheeseclOth och klargöra genom centrifugering vid 27.000 x g under 30 minuter. Överför supernatanten i ett kylt mätcylinder, mäta volymen, och sedan överföra till en kyld steril bägare. Kasta pelleten.
- Process supernatanten genom tillsats av 10% polyetylenglykol 8000 (PEG 8.000), rör om under 15 minuter vid 4 ° C och inkubera under ytterligare 45 min vid 4 ° C för att fälla ut virusliknande partiklar (VLP)-PEG matris.
- Centrifugera provet vid 27.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Bearbeta pelleten genom att tillsätta 8 ml 0,05 M Na-citrat-buffert, pH 5,5 innehållande 2% Triton X-100. Snurra centrifugrören väl att släppa pelleten. Överför pelleten och buffert till en kyld steril bägare. Skölj rören omedelbart med 2 ml av samma buffert och tillsätt till bägaren. Rör om suspensionen vid 4 ° C tills pelletsen löses (vanligen 1 timme).
- Förtydliga genom centrifugering under 5 minuter vid 27.000 xg, kassera pelleten, och process supernatanten genom centrifugering vid 140.000 xg under 2 h vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml 0,05 M Na-citrat-buffert, pH 5,5 och placera suspensionen på toppen av en 10-40% sukros-gradient gjord i 0,05 M Na-citrat, pH 5,5.
- Centrifugera gradienten under 3 timmar vid 140.000 xg vid 4 ° C.
- Shine en ljus över toppen av centrifugröret och samla ljusspridande övre band vid 4 cm från toppen av röret, späd med 0,05 M Na-citrat, pH 5,5, och centrifugera under 3 h vid 140.000 xg vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 0,5 ml sterilt vatten och förvara vid 4 ° C i upp till sex månader.
- Kvantifiera VLP koncentrationen genom att utföra en Bradford proteinanalys. Utbytet av VLP är mellan 1 och 3 | ig / g växtvävnad.
2. Fluorescein-5-maleimid-märkning Reactions of VLP
- Bered en 1 mM lösning av fluorescein-5-maleimid (427,37 g / mol) i 50 mM natrium phosphate-buffert, pH 7,0, 1 mM EDTA. Blanda med virveln och verifiera fullständig upplösning. Skydda röret från ljus med aluminiumfolie.
- Lägg fluorescein-5-maleimid till VLP som producerats i steg 1 och blanda. Använd en 25-faldigt molärt överskott av fluorescein-5-maleimid för molär mängd av sulfhydryler. Generellt använder 30 pl VLP vid koncentrationen 1 pg / pl och 60 pl av fluorescein-5-maleimid lösning ger acceptabla resultat.
- Inkubera reaktionsblandningen under 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Avsluta reaktionen genom att tillsätta ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration av 50 mM.
- Avlägsna icke-reagerade fluorescein med användning av en avsaltning spinnkolonn (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) och centrifugering under 2 minuter vid 1.500 xg vid rumstemperatur.
- För SDS-PAGE-analys, tillsätt 10 | il av 2 x SDS-PAGE-Laemmli provbuffert till 10 pl av varje reaktion. Förvara det märkta proteinet skyddas från ljus vid 4 ° C under upp till en månad elleri engångsbruk alikvoter vid -20 ° C upp till 3 månader.
3. Märkningsreaktionen och bestämning av biotin bolagsordningen
- Användning Avsaltning spinnkolonner (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) för att utföra en buffert utbyte från vatten till fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,0 för de VLP som producerats i steg 1.
- Bered en 20 mM stamlösning av maleimid-PEG2-biotin genom att tillsätta 190 | il PBS i nr-Väg maleimid-PEG2-biotin och blanda genom att pipettera upp och ned.
- Lägg maleimid-PEG2-biotin till VLP och blanda. Använd en 10-faldigt molärt överskott av reagens för VLP-lösningar ≤ 2 mg / ml.
- Inkubera reaktionen vid rumstemperatur under 4 timmar.
- Avlägsna icke-reagerade maleimid-PEG2-biotin med användning av en avsaltningskolonn spinnkolonn (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) och centrifugering under 2 minuter vid 1.500 xg vid rumstemperatur.
- Bestäm mol biotin per mol VLP använder Pierce Biotin Kvantifiering Kit (Thermo Scientific) och following tillverkarens anvisningar.
4. Tvärbindning av Cys 2-VLP och F Peptid
- VLP som resulterade i tillgängliga cysteinresterna för tvärbindning i steg 2 (Cys 2-VLP) används i följande steg. Bered en färsk tvärbindande stamlösning (28,63 mM) genom upplösning av 10 mg NHS-PEG4-maleimid tvärbindare i 680 pl dimetylsulfoxid.
- Lös en 17 (F)-aminosyror lång peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) i 50 pl av konjugering buffert (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) vid en koncentration av 0,1 mM.
- Tillsätt 4 | il av tvärbindare till 50 pl av det upplösta peptiden (protein-NH2) vid 1 mM slutlig koncentration (som är en 10-faldigt molärt överskott för 0,1 mM peptidlösning).
- Inkubera reaktionsblandningen under 2 h vid 4 ° C.
- Rena tvärbunden peptid med användning en avsaltningskolonn (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) jämviktad med konjugering buffert (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) genom centrifugering vid 1.500 xgunder 1 min vid rumstemperatur.
- Inrätta en reaktionsblandning kombinerar VLP (protein-SH) och tvärbundet peptid (protein-NH2) i ett molärt förhållande som bestäms av antalet tioler och aktiverade aminer är involverade i reaktionen och skillnaden i molekylvikt mellan VLP och peptid.
- Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur under 2 timmar vid 4 ° C.
- För Western blot-analys, blanda den resulterande konjugerade produkten 1:1 med Laemmli-buffert, koka i 10 minuter, och fortsätt med SDS-PAGE på en förtillverkad 10-20% Tris-glycin-gel (Invitrogen), följt av elektroblotting på ett nitrocellulosamembran (Invitrogen). Blockera membranen med 1 x PBS, pH 7,2 innehållande 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) och 5% skummjölkspulver och sond med peptid-specifika antikroppar följt av lämplig fosfatas-märkt sekundär antikropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transient uttryck av muterade MRFV (CP) höljeprotein gener i N. benthamiana växter i en PVX-baserad vektor som producerar VLP beskrivs i figur 1. Den modifierade MRFV höljesprotein-genen amplifieras med PCR och sedan placeras under den transkriptionella kontrollen av den duplicerade subgenoma CP promotor i en PVX-baserad vektor, pP2C2S 2, (en gåva från D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, England). I in vitro RNA-transkription producerar RNA-transkript som sedan används för att ympa N. benthamiana växter. I de infekterade plantorna (fig 2A) MRFV-CP subenheter bildar VLP (figur 2B) som lätt renas. Därefter VLP tvärbinds till peptider.
Ett exempel på reaktiva aminosyror av MRFV höljesproteinet visas i figur 3. Varje aminosyra vald kan användas för att fästa delar om det är ytexponerade. Den Chemical tekniker innefattar traditionella biokonjugering strategier såsom acylering av aminogruppen i lysin, alkylering av sulfhydrilic gruppen cystein, och aktivering av karboxylsyrarester och koppling med tillsats aminer. Dessutom, kan de aromatiska grupperna i tyrosin och tryptofan vara attraktiva mål för biokonjugering genom diazotering och alkylering.
Lösningsmedlet tillgängligheten av Cys-rester av VLP till tiol-specifika reagens visas i figur 4. Renat vikt-VLP (bana 4) och Cys-VLP mutanter transporterar cysteinrester i position 107-111 (spår 1) och 192-194 (spår 3) av CP-genen 12 är icke-reaktiva under nativa betingelser med tiol-specifika reagens (frånvaro av fluorescens). Fluorescein-5-maleimid ger orange fluorescens endast för Cys-VLP mutant bär cysteinrester i position 125-129 av CP-genen (spår 2). Resultatet visar att VLP i spår 2 har en geometrisk arrantering av cysteiner rester resulterar i lösningsmedel-exponerade fria tiolgrupper, medan cysteinresterna i proverna i spår 1 och 3 är kanske involverade i disulfidbryggor i vikningen av höljeproteinet.
Namnge reaktioner med maleimid-PEG2-biotin följt av en biotinylerings analys utgör ett annat exempel på analys av lösningsmedel tillgänglighet cysteinrester. Eftersom biotin är en relativt liten molekyl, kan det konjugeras i flera exemplar på VLP, som vardera kan binda en molekyl av avidin såsom visas i fig. 5. Nivån av biotinylering, indikerar 84,74 mol biotin per mol protein 13, antalet biotinmolekyler bundna till VLP och följaktligen antalet ligander som kan visas på den yttre ytan. På grund av tillgängligheten av flera tiolgrupper på VLP, kan peptider fästas genom tvärbindningsreaktioner med NHS-PEG4-maleimid. Detta reagens är en han Tero-bifunktionella tvärbindare som innehåller reaktiva ändar såsom N-hydroxisuccinimid (NHS)-ester och maleimid grupper, tillåter kovalent konjugering av amin-och sulfhydryl-innehållande molekyler. Såsom visas i figur 6A, reagerar NHS-estern med primära aminer bildar amidbindningar, medan maleimid reagerar med sulfhydrylgrupper som bildar stabila tioeterbindningar. Tvärbindande reaktionerna producerar VLP-peptidkomplex som är immunoreaktiva med de specifika antikropparna i Western blöt som visas i figur 6B.
Figur 1. Schematiskt diagram av produktionen av VLP i växter, följt av VLPs rening och efterföljande tvärbindning av peptider.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.
Figur 2. Symptomen av T7-transkript ympning på N. benthamiana växter (A) och transmissionselektronmikroskopi av de producerade VLP (B).
Figur 3. Ett protein struktur förutsägelse av vildtyp (wt)-MRFV-CP visade reaktiva cysteinaminosyror (anges med pilar).
Figur 4. SDS-PAGE-analys av renade VLP konjugerade till fluoroscein-5-maleimid. (A) Simply Blue säker färg användes för att färga proteiner. (B) fluorescein-5-maleimid detektion genom fotografering under UV-belysning. M: förfärgade brett proteinmarkör (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: renat Cys 1-VLP, 2: renat Cys 2-VLP, 3: renat Cys 3-VLP, 4: renade wt VLP. (Cys 1-VLP, Cys 2-VLP och Cys 3-VLP är Cys-MRFV-VLP mutanterna 13).
Figur 5. AT = 3 band modell av isometriska VLP visar sulfhydrylreaktiva kemi för (A) biotinmärkning och (B) fluorescein-5-maleimid märkning.
Figur 6. Diagram som illustrerar proteintvärbindning mellan Cys 2-VLP och F-peptid (A) och Western blöt (B) av Cys-VLP-F sonderades med specifika antikroppar till F-peptid. M: förfärgade brett protein markör (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F tillverkas i steg 4 Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presenteras här ger en mycket känslig och snabb analys av reaktiva cysteiner som finns på ytan av anläggningen producerade VLP samt andra proteinkomplex. Maleimider är tiol-specifika reagens, som reagerar med fria sulfhydryl-innehållande molekyler för att bilda stabila tioeterbindningar. Denna metod bygger på specificitet maleimiderna att reagera med sulfhydrylgrupperna inte deltar i interaktioner med andra aminosyror. Bevara den nativa strukturen hos VLP är mycket viktigt genom hela processen. I den beskrivna tillämpningen, är reaktionerna i nativa betingelser och vid pH 7 för att bibehålla den nativa strukturen hos VLP. Vid neutralt pH, maleimider har optimal reaktivitet med fria sulfhydrylgrupper. Detta medger märkning av VLP med antingen fluorescein eller biotin till cystein tillgänglig för ändringar.
Mild pH (6,5-7,5) och villkor buffert används också i tvärbindningreaktioner. Antalet funktionella grupper på VLP bestämmer lämpliga förhållandet mellan tvärbindare och VLP. Lägre tvärbindare till protein förhållanden kan användas i fall där det finns många funktionella grupper. Omvänt är en högre tvärbindande till protein används med färre tillgängliga funktionella grupper.
En rad faktorer, bland annat utrymme arm, klyvbarhet, kemisk sammansättning, dimension och löslighet bestämmer slutligen urval av begagnade tvärbindare. Dessutom är valet av den använda tvärbindare också en funktion av storleken av de två proteinerna (i detta fall VLP och peptid) som deltar i konjugeringen. Hetero-bifunktionella tvärbindare är idealiska för protein-peptid eller protein-protein-tvärbindning. De tillåter mer kontrollerade tvåstegs reaktioner som minimerar oönskade själv konjugering och polymerisering som uppstår när homo-bifunktionella NHS-ester reagens används. I det första steget reagerar NHS-estern with primära aminer bildar amino bindningar. I det andra steget reagerar maleimid med sulfhydrylgrupper bildar tioester bindningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ett omnämnande av de varumärken av kommersiella produkter i publikationen är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte en rekommendation av US Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
