Summary
Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.
Abstract
Genomische studies van menselijke kankers heeft geleid tot een schat aan informatie over genen die veranderd in tumoren 1,2,3. Een uitdaging van deze studies is dat veel genen gewijzigd en het kan moeilijk zijn om genetische veranderingen die tumorigenese van dat die incidenteel ontstaan tijdens de transformatie reed onderscheiden. Om dit onderscheid is het nuttig om een assay die kwantitatief meten van het effect van een veranderd gen op tumor initiatie en andere processen waarmee tumoren aanhouden en verspreiden. Hier wordt een snelle manier om grote aantallen kandidaat melanoom modifiers screenen zebravis met een autochtone tumor model 4 die stappen voor melanoom initiëren en onderhouden omvat. Een belangrijk reagens in deze test is de miniCoopR vector voor koppeling een wildtype kopie van het mitfa melanocyt specificatie factor een Gateway cassette recombinatie waarin kandidaat melAnoma genen worden gerecombineerd 5. De vector miniCoopR een mitfa redding minigen dat de promoter, open reading frame en 3'-ongetranslateerde gebied van het wild-type gen bevat mitfa. Het stelt ons in staat om constructies met behulp van volledige lengte open reading frames van kandidaat-melanoom modifiers. Deze individuele klonen kunnen vervolgens worden geïnjecteerd in een enkele cel Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) zebravis embryo's. De miniCoopR vector wordt geïntegreerd door Tol2-gemedieerde transgenese 6 en redt melanocyten. Omdat deze fysiek gekoppeld met de mitfa rescuing minigen worden kandidaatgenen uitgedrukt in gered melanocyten, waarvan sommige transformeren en ontwikkelen tot tumoren. Het effect van een kandidaat gen op melanoom initiatie en melanoomcellijnen eigenschappen kan worden gemeten met melanoma-overleving curves, invasie assays, antilichaamkleuring en transplantatie assays.
Protocol
1. Screening op Melanoom Begin Modifiers
- Gateway maken middelste item klonen van PCR amplificeren van de volledige lengte open leesraam van genen van belang (GOI) en genereert in pDONR 221 met BP clonase II (Invitrogen). Gebruik Multisite Gateway-technologie (Invitrogen) te recombineren p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 en miniCoopR 5 tot genen van interesse onder het mitfa promoter in de vector miniCoopR (Figuur 1A).
- Injecteer 25 picogram van elke kloon samen met 25 picogram Tol2 transposase mRNA in een cel Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) drievoudig homozygoot zebravis embryo's, zoals eerder beschreven 7. Incubeer de geïnjecteerde embryo's op 28,5 ° C. Verwijder alle dode embryo's bij 24 hpf.
- Selecteer transgene dieren gered melanocyten bij 72 hpf Door de petrischaal met geïnjecteerde embryo's op een dissectie microscoope onder invallend licht tegen een witte achtergrond (Figuur 1A).
- Overdracht dieren 3 L tanks in de kwekerij van de zebravis-faciliteit op 4 dpf zoals eerder beschreven 8.
- Bij 2 maanden, selecteert de dieren met ten minste een gebied van melanocyt rescue groter dan 4 mm 2 (Figuur 1A). Er bestaat een sterke correlatie tussen de mate van melanocyt redding op 72 hpf en de mate van melanocyt reddingsacties op 2 maanden. Wanneer embryo rescue met melanocyten worden opgenomen bij 72 hpf, zal het merendeel (~ 80%) ten minste een gebied van melanocyt rescue groter dan 4 mm 2 bij 2 maanden.
- Screen de geselecteerde dieren wekelijks de aanwezigheid van tumoren (Figuur 1B). Er is een sterke correlatie tussen histopathologische en morfologische veranderingen. Overgang van goedaardige naar kwaadaardige wordt erkend als een morfologische verandering als laesies worden opgeheven van de oppervlakte van het dier. Isoleer tumor dragende animals voor studie.
- Tekenen melanoma-overleving curves met de leeftijd in weken op de abscis en melanoma-percentage overleving op de ordinaat. Dieren met melanocyten die een gen van interesse worden vergeleken met controledieren die express EGFP (enhanced green fluorescent protein) in melanocyten (Figuur 1C). De mediane tumor onset voor dieren geïnjecteerd met miniCoopR-EGFP ongeveer 18 weken. Bepaal of de twee curven zijn statistisch verschillend gebruik van een log rank test.
2. Tumor Invasion Assay
- Selecteer geïsoleerd zebravis die dorsaal tumoren ontwikkelen, in een gebied tussen de achterste begrenzing van de achterhersenen en voorste rand van de rugvin (Figuur 2A).
- Twee weken na melanoom begin euthanaseren de vis volgens de richtlijnen die door de American Veterinary Medical Association Euthanasie-panel en goedgekeurd door de Universiteit van Massachusetts Medical School Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Specifiek wordt een vis geplaatst in een schaal met 0,6 mg / ml tot tricaine gill beweging stopt.
- Een insnijding in de peritoneale holte van de vis met een scalpel en daarna overnacht plaats de vis in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C voor fixatie.
- Overnacht behandelen met 0,5 M EDTA bij 4 ° C te ontkalken.
- Vast met formaline in cassette s nachts drogen gedurende 1 uur, duidelijk met xyleen 3 keer gedurende 1 uur en vervolgens behandelen met paraffine 2 maal gedurende 2 uur elk bij 60 ° C.
- Embed het weefsel in paraffine in een vorm en laat het stollen gedurende 30 minuten tot 1 uur.
- Maak 5 micrometer secties, een per 50 pm. De secties moet dwars en door de gehele laesie zodat het diepste punt van inval kan worden geïdentificeerd. Volg door hematoxyline en eosine kleuring.
- Beoordeel tumor invasie door het meten van de vraag of tumorcellen blijven buiten de collagene stratum compactum, binnen te vallen in de dorsalespiermassa of verder binnendringen in de wervelkolom (Figuur 2B, C). Bepaal statistisch verschil tussen de twee series monsters.
3. Antilichaam Kleuring van Scale Melanocyten
- Maken PO4 buffer met 80 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 en 20 ml 0,1 M NaH 2PO 4. Zorg ervoor dat de pH-waarde is 7,3. Maken 2x fix buffer bevattende 8,0 g sucrose, 0,15 ml 0,2 M CaCl2 en 90 ml 0,2 M PO 4 buffer, pH 7,3. Indien nodig de pH op 7,3 met NaOH of HCl vervolgens aan tot 100 ml met PO 4 buffer.
- Wegen tot 300 mg vaste PFA en aan een microcentrifugebuis. Voeg 5 mM NaOH tot een volume gelijk aan 4,5 x massa in mg van PFA (bijv. 450 ul 5 mM NaOH tot 100 mg PFA). Warmte bij 60-70 ° C met af en toe schudden tot de PFA opgelost. Spin down resterende deeltjes en herstellen 20% PFA supernatant. Maak verse elke keer.
- Bereid fixatie oplossing die 1x fix buffer en 4% PFA.
- Verdoven de vissen in 0,17 mg / ml tricaine.
- Met behulp van invallend licht onder een dissectie microscoop te plukken dorsale schalen met behulp van scherpe puntig pincet, zorg ervoor dat u de melanocyt-bevattende helft van de schaal (Figuur 3A) beschadigen. De weegschaal rechtstreeks van de forceps in 1 ml fixatie-oplossing en incubeer bij kamertemperatuur, terwijl u voor ≥ 2 uur. Breng de vis in vis water en toezicht op de vis om succesvol herstel te bevestigen.
- Het bleken gepigmenteerde melanocyten wassen vaste schalen in PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 maal gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml vers bleekoplossing die 0,4 ml 10% KOH en 0,15 ml 30% H 2 O 2 in 5 ml met dH 2 O. Zet parafilm of pet sloten te voorkomen dat gas barst de buizen open. Verder bleken tot pigment is verdwenen (10 min typisch) (Figuur 3B, C). Wassen in PBST vier maal gedurende 5 min bij kamertemperatuurdoor temperatuurschommelingen.
- Block ten minste 30 min in blokkeeroplossing uit 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN3 en 2% lam serum. Weglaten NaN 3 als het ontwikkelen van met HRP reactie.
- Incuberen met primair antilichaam in blokkeeroplossing nacht bij kamertemperatuur. U ten minste 400 ul oplossing hebben in de monsters ondergedompeld te houden.
- Was de schalen 3 keer 30 min in PBST bij kamertemperatuur.
- Incuberen met secundair antilichaam van 2 uur tot overnacht in blokkeeroplossing bij kamertemperatuur.
- Vlek gedurende 10 minuten met PBST + 0,1 uM DAPI.
- Was 3 keer gedurende 5 minuten met PBST.
- Monteer de weegschaal op een glasplaatje in een druppel Vectashield, zodat de holle kant van de weegschaal naar beneden in de richting van de glijbaan en plaats een glazen dekglaasje over hen. Verzegel de randen van de dia met duidelijke nagellak en let op de dia's onder een fluorescentie microscoop (figuur 3D, E, F, G
4. Transplantatie Assay
- Bereid ontvanger 2-3 maanden oude casper 9 vissen door bestraling met 25 Gy gammastraling dag vóór de transplantatie 10. Laat de vis te herstellen in vis water.
- Euthanaseren een tumordragende vis zoals eerder beschreven (paragraaf 2.2).
- Snijd de tumor en het in een petrischaal met ongeveer 5 ml filter gesteriliseerd 0.9x PBS met 5% FBS. Snijd de tumor met een scheermes, terwijl in oplossing.
- Werken bij kamertemperatuur, fijnstampen met een P1000 pipet om enkele cellen te krijgen. Vul de maatkolf aan tot 25 ml met filter gesteriliseerd 0,9 x PBS met 5% FBS.
- Filtreer door 40 uM gaasfilter.
- Draaien in een Eppendorf 5810R tafelblad centrifuge bij 1500 rpm (453 RCF) gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant en maken celsuspensie tot ongeveer gewenste concentratie (neem 10 7 cellen voor een 100 mm 3 tumor).
- Bereken thij exact aantal cellen met een hemocytometer en verdun de celsuspensie zodat de laatste injectie is ongeveer 5 pl. Als bijvoorbeeld 50.000 cellen worden geïnjecteerd, moet de celsuspensie worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen / ul. Flick de buis met de celsuspensie om de paar minuten om klonteren van de cellen te voorkomen.
- 2-3 keer wassen een 26s gauge (schuine tip) 701 N 10 ul Hamilton spuit met 100% ethanol en 0,9 x PBS. Plaats de spuit met 5 pi van de celsuspensie.
- Verdoof de bestraalde ontvanger vis in 0,17 mg / ml tricaine. Plaats vis op zijn kant op een vochtige Kimwipe (Figuur 4A).
- Het stabiliseren van de vis met de ene hand en steek de naald met de schuine kant naar boven in een hoek van 45 ° in de flank van de vis boven de peritoneale holte ongeveer halverwege tussen de achterste begrenzing van de achterhersenen en voorste rand van de rugvin. Voorzichtig op de zuiger (Figuur 4B). </ Li>
- Laat de vis te herstellen in verse vis water en dagelijks houden aan de vis voor tumor innesteling (Figuur 4C). Als aanslaan is opgetreden, kan verdere groei en ontwikkeling van de ziekte in acht worden genomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eencellige Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf) mitfa (lf) zebravis embryo's werden geïnjecteerd met de miniCoopR vector die het melanoma oncogen SETDB1 5 of EGFP, elk onder de controle van de promoter mitfa. Embryo's met melanocyt rescue werden geselecteerd en rijpen. Op 2 maanden dieren melanocyt rescue groter dan 4 mm 2 werden geselecteerd. De dieren werden wekelijks onderzocht melanomen. Tumorincidentie curves voor volwassenen bleek dat de SETDB1 oncogen aanzienlijk melanoma onsetas versneld vergeleken met de EGFP controle (Fig. 1). Dieren die tumoren ontwikkeld tussen de achterste begrenzing van de achterhersenen en de voorste rand van de rugvin (figuur 2A) werden geïsoleerd. Twee weken na het begin melanoma werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, in secties verdeeld en gekleurd met hematoxyline en eosine voor melanoom invasie beoordelen in underliggende weefsels. Melanomen uiten SETDB1 waren meer lokaal invasief dan EGFP controle melanomen (figuur 2C). Om te zoeken naar expressie van een kandidaat-gen werden rugschubben geplukt een wildtype zebravis en gekleurd met een 1:100 verdunning van een primair antilichaam dat erkent Mitfa transcriptiefactor gevolgd door een 1:1000 verdunning van geit anti FITC -konijn IgG antilichaam (figuur 3). Om transplantability van de tumor te beoordelen, werden melanoomcellen geïsoleerd uit een Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) vis geïnjecteerd met miniCoopR-EGFP. 50.000 cellen werden subcutaan geïnjecteerd in een ontvanger casper mutant die waren bestraald de vorige dag met 25 Gy. Door 2 weken oud werden gepigmenteerde donor afgeleide cellen te herkennen (figuur 4).
o: src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" />
Figuur 1. Screening voor melanoom onset modifiers met de miniCoopR assay. A) Schematische voorstelling van de miniCoopR assay. Embryo gered melanocyten (pijlpunt) met de miniCoopR vector en het gen van belang. Scale bar = 250 uM. Volwassene met meer dan 4 mm 2 melanocyten rescue (pijlpunt). Scale bar = 500 uM B) MiniCoopR-EGFP gered zebravis met een amelanotisch en een gepigmenteerde tumor (pijlpunten). C) Vertegenwoordiger melanoom-vrije overleving curve vergelijken tumoren die oncogen SETDB1 en een controle-EGFP-gen (p = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
2.jpg "/>
Figuur 2. Tumor invasie assay. A) MiniCoopR-geredde zebravis met een dorsale tumor (pijlpunt) tussen de achterste begrenzing van de achterhersenen en de voorste rand van de rugvin. B) Dwarsdoorsnede toont stratum compactum (SC), schalen, schaal-geassocieerde melanocyten (SAM) (inzet, schaal bar = 50 uM), spier (M) en wervelkolom (SPC). Scale bar = 200 pM. C) Dwarsdoorsneden met een niet-invasieve miniCoopR-EGFP tumor (T) (links) en een miniCoopR-SETDB1 tumor (rechts) dat is binnengedrongen door het stratum compactuminto spier (M) en de wervelkolom. Scale bar = 200 pM.
Figuur 3. Antilichaam kleuring van schaal melanocyten. A) Weegschalen worden geplukt van een verdoofde miniCoopR-EGFP zebravis. B) ongebleekt schaal met gepigmenteerde melanocyten en C) gebleekt scale van miniCoopR-EGFP zebravis. Schaal bar = 100 uM. Ongebleekt schaal gekleurd met een D) Mitfa antilichaam en E) DAPI. Gebleekte schaal gekleurd met een F) Mitfa antilichaam en G) DAPI. Scale bar = 40 uM.
Figuur 4. Transplantatie van melanoomcellen. A) niet-geïnjecteerde casper zebravis. Scale bar = 500 uM. B) Subcutaan transplantatie site (pijlpunt) op bestraalde casper ontvanger onmiddellijk na injectie met 50.000 melanomacellen. Scale bar = 200 pM. C) Bestraalde casper ontvanger geeft tumor implantatie (pijlpunt) twee weken na injectie met 50.000 melanomacellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De miniCoopR methode maakt het mogelijk de expressie van genen van belang in zebravis melanocyten. Deze benadering maakt gebruik van het feit dat de zebravis mitfa gen werkt cellen autonoom. Daarom melanocyten gered door de miniCoopR vector zeker het minigen en elk gen van belang waaraan het fysiek gekoppeld bevatten. Gered melanocyten zijn duidelijk zichtbaar en kunnen worden verkregen in dieren die zijn geïnjecteerd als eencellige embryo. Een gespecificeerde mate van chimerisme is geselecteerd, en dieren overtreffen deze cutoff kan worden gescoord voor tumor ontstaan of andere kenmerken. Een groot voordeel van de methode is dat miniCoopR dieren voldoende chimerisme kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en scoorde zonder stabiele transgene lijnen overeenkomt met elk gen van belang te verkrijgen getest. Tijd, moeite en kosten worden opgeslagen in verhouding tot het aantal genen van belang zijn worden onderzocht.
Zoals eerder gerapporteerd 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken dr. Leonard I. Zon in wiens laboratorium deze technieken werden in eerste instantie ontwikkeld, Kristen Kwan en de late Chi-Bin Chien voor geschenken van plasmiden gebruikt in dit werk, James Lister en David Raible voor hulp bij antilichaamkleuring, en James Neiswender voor het micro-injectie video. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie R00AR056899-03 naar CJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
