Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Summary

Eine schnelle Weg zum Bildschirm für die Melanom-Modifikatoren mit einem Zebrafisch autochthonen Tumormodell vorgestellt. Es nutzt die miniCoopR Vektor, der zur Expression von Melanom-Kandidat Gene in Melanozyten ermöglicht. Verfahren zur Melanom Überleben Kurven, eine Invasion Assay, ein Protokoll für Antikörperfärbung Maßstab von Melanozyten und Melanomzellen eine Transplantation Assay erhalten werden beschrieben.

Abstract

Genomic Studien der menschlichen Krebsarten haben eine Fülle von Informationen über die Gene, die in Tumoren ^1,2,3 verändert werden erbracht. Eine Herausforderung, die aus diesen Studien ist, dass viele Gene verändert werden, und es kann schwierig sein, genetische Veränderungen, Tumorgenese aus, dass diejenigen entstanden zeitweilig während der Transformation fuhren zu unterscheiden. Um diesen Unterschied zu zeichnen ist es vorteilhaft, einen Assay, die quantitativ messen kann die Wirkung eines veränderten Gens auf Tumorinitiation und andere Prozesse, die Tumoren zu persistieren und verbreiten ermöglichen müssen. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle Möglichkeit, eine große Anzahl von Kandidaten Melanom Modifikatoren im Zebrafisch mit einem autochthonen Tumormodell ^4, Schritte zur Melanom Initiierung und Wartung umfasst screenen. Ein Schlüssel Reagenz in diesem Assay ist die miniCoopR Vektor, welche Paare eine Wildtyp-Kopie des mitfa Melanocyt Spezifikation Faktor an einen Gateway Rekombinationskassette in welche Kandidaten melAnomalien Gene ⁵ rekombiniert werden. Der Vektor weist eine miniCoopR mitfa rettende Minigen, der den Promoter, offenen Leserahmen und 3'-untranslatierten Region des Wildtyp-mitfa Gen enthält. Es ermöglicht uns, Konstrukte mit voller Länge open reading frames von Kandidaten Melanom Modifikatoren. P53 (lf);; mitfa (lf) Zebrafischembryonen: Diese einzelnen Klone können dann in einzelne Zelle Tg (BRAF ^V600E mitfa) injiziert werden. Die miniCoopR Vektor wird von Tol2-vermittelte Transgenese ⁶ integriert und rettet Melanozyten. Weil sie physisch mit dem mitfa rettende Minigen gekoppelt sind, werden Kandidatengene gerettet Melanozyten, von denen einige zu transformieren und entwickeln sich zu Tumoren exprimiert. Die Wirkung eines Kandidatengens auf Melanom Initiierung und Melanomzelle Eigenschaften können unter Verwendung Melanom Überleben Kurven Invasionsassays, Antikörperfärbung und Transplantation Assays werden.

Protocol

Ein. Screening für Melanom Onset Modifiers

1. Erstellen Gateways Mitteleinstieg Klone durch PCR Amplifikation des Volllängen-offenen Leserahmen von Genen von Interesse (GOI) und Rekombinieren in pDONR 221 mit BP Clonase II (Invitrogen). Verwenden Multisite Gateway-Technologie (Invitrogen) zu rekombinieren p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit Nr. 302 p3E_SV40polyA ⁶ und miniCoopR ⁵ bis Genen von Interesse unter der mitfa Promotors Platz in der miniCoopR Vektor (Abbildung 1A).
2. Injizieren 25 Picogramm eines jeden Klons zusammen mit 25 Picogramm Tol2 Transposase mRNA in ein-Zell Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (lf); mitfa (lf) dreifach homozygot Zebrafischembryonen wie zuvor ⁷ beschrieben. Inkubieren Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 ° C. Entfernen Sie alle toten Embryonen bei 24 hpf.
3. Wählen transgene Tiere mit geretteten Melanozyten bei 72 hpf, indem Sie die Petrischale mit injizierten Embryonen auf einem Seziertisch mikroskopische im Auflicht vor einem weißen Hintergrund (Abbildung 1A).
4. Übertragen Tiere 3 L Tanks in der Kinderstube des Zebrafisch-Anlage bei 4 dpf wie zuvor ⁸ beschrieben.
5. Nach 2 Monaten, wählen die Tiere mit mindestens einer Fläche von Melanozyten Rettungs größer als 4 mm ² (Abb. 1A). Es besteht eine starke Korrelation zwischen dem Grad der Melanozyten Rettung bei 72 hpf und dem Grad der Melanozyten Rettung auf 2 Monate. Wenn Embryonen mit Melanocyt Rettungs bei 72 hpf gepflückt wird die Mehrzahl von ihnen (~ 80%) über mindestens eine Fläche von Melanozyten Rettungs größer als 4 mm ² bei 2 Monaten.
6. Bildschirm die ausgewählten Tieren wöchentlich für das Vorhandensein von Tumoren (Abbildung 1B). Es besteht eine starke Korrelation zwischen histologischen und morphologischen Veränderungen. Übergang von gutartigen zu malignen als morphologische Änderung, wenn Läsionen werden von der Oberfläche des Tieres angehoben erfasst. Isolieren tumortragenden animals für die Studie.
7. Zeichnen Melanom-free Überlebenskurven mit dem Alter in Wochen auf der Abszisse und Prozent Melanom-freies Überleben auf der Ordinate. Tiere mit Melanozyten, ein Gen von Interesse exprimieren, werden im Vergleich zu Kontrolltieren, dass ausdrückliche EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) in Melanozyten (1C). Die mediane Tumor Einsetzen für Tiere mit miniCoopR-EGFP injiziert wird etwa 18 Wochen. Bestimmen Sie, ob sich die beiden Kurven statistisch unterschiedlich sind mit einem Log-Rank-Test.

2. Tumor Invasion Assay

1. Wählen getrennt Zebrafisch zu entwickeln, dass Tumore dorsal, in einem Bereich zwischen dem hinteren Rand des Rautenhirn und vorderen Rand der Rückenflosse (Abbildung 2A).
2. Zwei Wochen nach Melanom Beginn einschläfern die Fische nach den Richtlinien der American Veterinary Medical Association Panel on Euthanasie spezifiziert und von der University of Massachusetts Medical School Ins zugelassentitutional Animal Care und Use Committee (IACUC). Insbesondere ist ein Fisch in einer Schüssel mit 0,6 mg / ml Tricain gelegt, bis gill Bewegung stoppt.
3. Einen Einschnitt in die Bauchhöhle des Fisches mit einem Skalpell und dann den Fisch in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C zur Fixierung.
4. Gönnen mit 0,5 M EDTA über Nacht bei 4 ° C bis zu entkalken.
5. Fix mit Formalin in Kassette Nacht für 1 Stunde zu entwässern, klar mit Xylol 3 mal 1 Stunde und dann behandeln mit Paraffin 2 mal für 2 Stunden jeweils bei 60 ° C.
6. Einbetten des Gewebes in Paraffin in einer Form und lassen es für 30 min bis 1 h zu verfestigen.
7. Machen Sie 5 &mgr; m Schnitte, einer alle 50 um. Die Abschnitte sollten quer und durch die gesamte Läsion so daß der tiefste Punkt der Invasion identifiziert werden kann. Folgen von Hämatoxylin und Eosin-Färbung.
8. Bewerten Tumorinvasion durch Messung, ob Tumorzellen außerhalb der kollagenen Schicht compactum bleiben, in den dorsalen eindringenMuskulatur oder weiteren dringen in die Wirbelsäule (Abbildung 2B, C). Bestimmen statistische Differenz zwischen den beiden Sätzen von Abtastwerten.

3. Antikörperfärbung of Scale Melanozyten

1. Make-up PO4-Puffer mit 80 ml ​​0,1 M Na ₂ HPO ₄ und 20 ml 0,1 M NaH ₂ PO _4. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert beträgt 7,3. Schmink 2x fix Puffer enthaltend 8,0 g Saccharose, 0,15 ml 0,2 M CaCl ₂ und 90 ml 0,2 M PO _4-Puffer, pH 7,3. Falls notwendig den pH-Wert auf 7,3 mit NaOH oder HCl dann bis zu 100 ml mit PO _4-Puffer.
2. Wiegen bis zu 300 mg feste PFA und fügen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen 5 mM NaOH bis zu einem Volumen gleich 4,5 x Masse in mg, PFA (z. B. 450 ul 5 mM NaOH bis 100 mg PFA). Wärme bei 60-70 ° C unter gelegentlichem Schütteln, bis das PFA gelöst ist. Spin down verbleibenden Partikeln und erholen 20% PFA Überstand. Machen frischen jeder Zeit.
3. Bereiten Fixierung Lösung mit 1x fix Puffer und 4% PFA.
4. Anästhesieren den Fisch in 0,17 mg / ml Tricain.
5. Mit einfallende Licht unter einem Binokular zupfen Rückenschuppen mit scharfen spitzen Pinzette, kümmert sich nicht um die Melanozyten-haltige Hälfte der Skala (3A) zu beschädigen. Skalen erfolgt direkt von der Zange in 1 ml Fixierungslösung und inkubieren bei Raumtemperatur, Drehen, für ≥ 2 hr. Übertragen Sie die Fische in Fisch Wasser und überwachen die Fische erfolgreiche Wiederherstellung zu bestätigen.
6. Zum Bleichen pigmentierten Melanozyten waschen Pauschaltabellen in PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 mal für 5 min bei Raumtemperatur. 1 ml frisch zubereiteten Bleichlösung mit 0,4 ml 10% KOH und 0,15 ml 30% H ₂ O ₂ in 5 ml mit dH ₂ O. Setzen Sie auf Parafilm oder Kappe Sperren Gas aus Platzen die Röhren offen zu verhindern. Weiter Bleichen bis Pigment ist weg (10 min ist typisch) (3B, C). Waschen in PBST viermal 5 min bei Raumtemptur.
7. Block für mindestens 30 min in Block Lösung aus 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN ₃ und 2% Lammserum hergestellt. Weglassen NaN _3, wenn die Entwicklung mit HRP-Reaktion.
8. Inkubieren mit primärem Antikörper in Block Lösung über Nacht bei Raumtemperatur. Sie müssen mindestens 400 ul Lösung über die Proben, um sie untergetaucht.
9. Waschen Sie die Waage 3 mal für 30 min in PBST bei Raumtemperatur.
10. Inkubieren mit sekundärem Antikörper von 2 h bis über Nacht in Block-Lösung bei Raumtemperatur.
11. Stain für 10 min mit PBST + 0,1 uM DAPI.
12. Waschen 3 mal für 5 min mit PBST.
13. Montieren an der Waage auf einem Glasträger in einem Tropfen Vectashield so dass die konkave Seite der Waage nach unten zugewandt Schiebers und legen ein Deckglas darüber. Seal die Ränder der Folie mit klarem Nagellack und beachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 3D, E, F, G

4. Transplantation Assay

1. Bereiten Empfänger 2-3 Monate alten casper ⁹ Fische durch Bestrahlung mit 25 Gy Gamma-Bestrahlung einen Tag vor der Transplantation ^10. Lassen Sie die Fische in Fisch Wasser erholen.
2. Euthanize eine tumortragenden Fische wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.2).
3. Schneiden Sie den Tumor und steckte es in eine Petrischale mit ca. 5 ml filtersterilisiert 0.9x PBS mit 5% FBS. Würfeln, den Tumor mit einer Rasierklinge, während in Lösung.
4. Arbeiten bei Raumtemperatur mit einem P1000 Pipette, um einzelne Zellen zu verreiben. Stellen Sie die Lautstärke auf 25 ml mit Filter sterilisiert 0.9x PBS mit 5% FBS.
5. Anschließend wird durch 40 uM Sieb-Filter.
6. Spin in einer Eppendorf 5810R Tischzentrifuge bei 1.500 Umdrehungen pro Minute (453 rcf) für 10 min.
7. Entfernen des Überstandes und machen Zellsuspension auf etwa gewünschten Konzentration (10 ⁷ Zellen annehmen, für einen 100 mm ³ Tumor).
8. Berechnen ter exakte Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt das Zellsuspension so dass die endgültige Einspritzmenge ungefähr 5 ul ist. Wenn zum Beispiel 50.000 Zellen injiziert werden können, sollte die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen / ul verdünnt werden. Blättern Sie durch die Röhrchen mit der Zellsuspension alle paar Minuten bis Verklumpen der Zellen zu verhindern.
9. Waschen Sie ein 26s Gauge (Abschrägung tip) 701 N 10 ul Hamilton-Spritze 2-3 mal mit 100% Ethanol und 0,9 x PBS. Legen Sie die Spritze mit 5 ul der Zellsuspension.
10. Anästhesieren des bestrahlten Empfängers Fische in 0,17 mg / ml Tricain. Legen Sie den Fisch auf seiner Seite auf einem feuchten Kimwipe (Abbildung 4A).
11. Stabilisieren Sie den Fisch mit einer Hand und führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in einem Winkel von 45 ° in die Flanke der Fisch über die Bauchhöhle etwa auf halbem Weg zwischen der hinteren Begrenzung des Hinterhirn und vorderen Rand der Rückenflosse. Vorsichtig drücken Sie den Kolben (4B). </ Li>
12. Lassen Sie die Fische in frischen Fisch Wasser erholen und beobachten die Fische täglich für Tumor-Transplantation (4C). Wenn Transplantation stattgefunden hat, können weitere Wachstum und die Entwicklung der Krankheit beobachtet werden.

Representative Results

Ein-Zell-Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (lf); mitfa (lf) Zebrafischembryonen wurden mit dem Vektor, der die miniCoopR Melanom Onkogen SETDB1 5 oder EGFP, jeder unter der Kontrolle des Promotors mitfa injiziert. Embryonen mit Melanozyten Rettung wurden ausgewählt und reifen lässt. Bei 2 Monate alten Tieren mit Melanocyt Rettungs größer als 4 mm ^2, wurden ausgewählt. Die Tiere wurden untersucht wöchentlich für Melanome. Tumorinzidenz Kurven für den Erwachsenen zeigte, dass das Onkogen SETDB1 signifikant Melanom onsetas Vergleich zur Kontrolle EGFP (Abbildung 1) beschleunigt. Tiere, die Tumoren zwischen der hinteren Begrenzung des Hinterhirn und dem vorderen Rand der Rückenflosse (2A) entwickelt wurden isoliert. Zwei Wochen nach Melanom Beginn wurden sie in 4% Paraformaldehyd fixiert, geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin Melanom Invasion in un beurteilenzugrunde liegenden Gewebe. Melanome Ausdruck SETDB1 waren mehr lokal invasiv als EGFP Kontrolle Melanomen (Abbildung 2C). Um für die Expression eines Kandidatengens aussehen wurden Rückenschuppen aus einem Wildtyp-Zebrafisch und gefärbt unter Verwendung einer 1:100-Verdünnung eines primären Antikörpers, dass die Mitfa Transkriptionsfaktor durch eine 1:1000 Verdünnung von Ziegen-anti FITC gefolgt erkennt gezupft -Kaninchen-IgG-Antikörper (Abbildung 3). P53 (lf);; mitfa (lf) Fisch mit miniCoopR-EGFP injiziert: Um transplantability des Tumors zu bestimmen, wurden Zellen aus einer Melanom-Tg (BRAF ^V600E mitfa) isoliert. 50.000 Zellen wurden subkutan in einen Empfänger casper Mutanten, die den Tag zuvor mit 25 Gy bestrahlt injiziert. Um 2 Wochen alt, wurden pigmentierte Spender stammende Zellen leicht zu erkennen (Abbildung 4).

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Abbildung 1. Screening für Melanome Beginn Modifikatoren mit dem miniCoopR Assay. A) Schematische Darstellung des miniCoopR Assay. Embryo mit geretteten Melanozyten (Pfeilspitze), enthaltend die miniCoopR Vektor und das Gen von Interesse. Maßstab = 250 uM. Erwachsene mit mehr als 4 mm ² Melanozyten Rettung (Pfeilspitze). Maßstabsbalken = 500 pM B) MiniCoopR-EGFP gerettet Zebrafisch mit einem amelanotische und einer pigmentierten Tumor (Pfeilspitzen). C) Vertreter Melanom-freies Überleben Kurve verglichen Tumoren, Onkogen SETDB1 und eine Steuereinheit EGFP-Gen (p = 9,4 × 10 ^-7, logrank χ ^2). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 2. Tumorinvasion Assay. A) MiniCoopR-geretteten Zebrafisch mit einer dorsalen Tumor (Pfeilspitze) zwischen der hinteren Begrenzung des Hinterhirn und dem vorderen Rand der Rückenflosse. B) Transversalschnitt zeigt Stratum compactum (SC), Waage, Waage-assoziierten Melanozyten (SAM) (Einschub, Maßstab = 50 uM), Muskel (M) und der Wirbelsäule (SPC). Maßstab = 200 uM. C) Querschnitte, die ein nicht-invasives miniCoopR-EGFP Tumor (T) (links) und einen miniCoopR-SETDB1 Tumors (rechts), die durch das Stratum compactuminto Muskel (M) und der Wirbelsäule eingedrungen ist. Maßstab = 200 uM.

Abbildung 3. Antikörper-Färbung von Größenvorteilen Melanozyten. A) Waagen aus einer narkotisierten miniCoopR-EGFP Zebrafisch gezupft. B) rohe Skala mit pigmentierten Melanozyten und C) gebleichte scale von miniCoopR-EGFP Zebrafisch. Maßstab = 100 uM. Unbleached Skala mit einem D) Mitfa Antikörper und E gefärbt) DAPI. Bleached Skala mit einem F gefärbt) Mitfa Antikörper und G) DAPI. Maßstab = 40 uM.

Abbildung 4. Transplantation von Melanomzellen. A) uninjizierten casper Zebrafisch. Maßstab = 500 uM. B) Subkutane Transplantation Website (Pfeilspitze) auf einer bestrahlten casper Empfänger sofort nach der Injektion mit 50.000 Melanomzellen. Maßstab = 200 uM. C) bestrahlt casper Empfänger zeigt Tumor Transplantation (Pfeilspitze) zwei Wochen nach der Injektion mit 50.000 Melanomzellen.

Discussion

Die miniCoopR Methode ermöglicht die Expression von Genen von Interesse im Zebrafisch Melanozyten. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, dass der Zebrafisch mitfa Gen-Zelle autonom wirkt. Aus diesem Grund sind Melanozyten durch die geretteten miniCoopR Vektor um das bestimmte Minigen und jedes Gen von Interesse, auf die sie physisch gekoppelt ist, enthalten. Gerettet Melanozyten sind deutlich sichtbar und können bei Tieren, die als Einzel-Zell-Embryonen injiziert wurden erzielt werden. Eine angegebene Grad der Chimärismus ausgewählt ist, und diese Tiere übertreffen können Cutoff für Tumor Einsetzen oder anderen Eigenschaften erzielt werden. Ein großer Vorteil des miniCoopR Methode ist, dass die Tiere mit ausreichend Chimärismus leicht identifiziert werden und erzielte ohne stabilen transgenen Linien entsprechend jedem Gen von Interesse geprüft zu erhalten. Zeit, Aufwand und Kosten sind im Verhältnis zu der Anzahl der Gene von Interesse befragt werden gespeichert.

Wie bereits berichtet ⁵

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gateway recombination reagents	Invitrogen
miniCoopR			Reference5
Mitfa antibody			Reference5
FITC goat anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
casper Zebrafish			Reference9
701N 10 μl Syringe	Hamilton/Fisher	14-824
40 μM filter	BD Falcon/Fisher	352340
FBS	Invitrogen	26140079