Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model

Summary

En rask måte å screene for melanom modifikatorer ved hjelp av en sebrafisk stedegen tumormodell presenteres. Det tar nytte av miniCoopR vektor som tillater uttrykk av kandidat melanom gener i melanocytter. En metode for å få melanoma overlevelse kurver, en invasjon analysen, en protokoll for antistoffarging av skalaen melanocyttene og en melanom transplantasjon analysen er beskrevet.

Abstract

Genomisk studier av kreft hos mennesker har gitt et vell av informasjon om gener som er endret i svulster ^1,2,3. En utfordring som oppstår fra disse studiene er at mange gener er endret, og det kan være vanskelig å skille genetiske forandringer som kjørte tumorigenesis fra at de oppsto øvrig under transformasjon. Å trekke dette skillet er det gunstig å ha en metode som kan kvantitativt måle effekten av en endret genet på startfasen og andre prosesser som gjør at svulster å vedvare og spre. Her presenterer vi en rask måte å skjerme stort antall kandidat melanom modifikatorer i sebrafisk ved hjelp av en stedegen tumormodell ⁴ som omfatter tiltak som kreves for melanom initiering og vedlikehold. Et sentralt reagens i denne analysen er miniCoopR vektor, som par et villtype kopi av mitfa melanocyte spesifikasjonen faktor til en Gateway rekombinasjon kassett inn hvilken kandidat melAnoma genene kan rekombineres ^5. Den miniCoopR vektor har en mitfa reddende minigene som inneholder promoteren, åpne leseramme og 3'-ikke-translaterte regionen av villtype mitfa genet. Det tillater oss å gjøre konstruerer med full-lengde åpne leserammer av kandidat melanom modifikatorer. Disse individuelle kloner kan deretter injiseres inn i én celle Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (LF), mitfa (LF) sebrafisk embryoer. Den miniCoopR vektor blir integrert av Tol2-mediert transgenesis ⁶ og redder melanocytter. Fordi de er fysisk koblet til mitfa reddende minigene er kandidat gener uttrykt i reddet melanocytter, noen som vil forvandle og utvikle seg til svulster. Effekten av en kandidat genet på melanom initiering og melanom celle egenskaper kan måles ved hjelp av melanom-free overlevelseskurver, invasjon analyser, antistoffarging og transplantasjon analyser.

Protocol

1. Screening for Melanom Onset Modifiers

1. Opprett Gateway midterste oppføring kloner ved PCR forsterke full-lengde åpen leseramme av gener av interesse (GOI) og rekombinering inn pDONR 221 hjelp BP clonase II (Invitrogen). Bruk flerstedskatalog Gateway teknologi (Invitrogen) til rekombinerer p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ⁶ og miniCoopR ⁵ for å legge gener av interesse under mitfa promoter i miniCoopR vektor (figur 1A).
2. Injisere 25 pikogram av hver klone sammen med 25 pikogram Tol2 transposase mRNA inn til én celle Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (LF), mitfa (LF) triply homozygote sebrafisk embryo som tidligere beskrevet ^7. Inkuber injiserte embryoer ved 28,5 ° C. Fjern eventuelle døde embryoer på 24 HPF.
3. Velg transgene dyr med reddet melanocyttene på 72 HPF ved å plassere petriskål inneholder injisert embryo på et dissekere microscope henhold innfallende lyset mot en hvit bakgrunn (Figur 1A).
4. Overlate dyr til 3 L stridsvogner i barnehagen av sebrafisk anlegget ved 4 DPF som tidligere beskrevet ^åtte.
5. Ved 2 måneders, velger dyrene med minst ett område av melanocyte redning større enn 4 mm ² (figur 1A). Det er en sterk sammenheng mellom graden av melanocyte redning på 72 HPF og graden av melanocyte redning på 2 måneder. Når embryoer med melanocyte redning plukkes ved 72 HPF, vil de fleste av dem (~ 80%) har minst ett område av melanocyte redning større enn 4 mm ² ved 2 måneder.
6. Screen de valgte dyr ukentlige for tilstedeværelse av svulster (figur 1B). Det er en sterk sammenheng mellom histopatologiske og morfologiske endringer. Overgang fra godartet til ondartet er anerkjent som en morfologisk endring når lesjonene blir hevet over overflaten av dyret. Isolere tumor peiling animals for studien.
7. Tegn melanom-free overlevelseskurver med alderen i uker på abscissen og prosent melanom overlevelse på ordinaten. Dyr med melanocytter som uttrykker et gen av interesse blir sammenliknet med kontrolldyr som uttrykker EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) i melanocytter (figur 1C). Median tumor utbruddet for dyr injisert med miniCoopR-EGFP er ca 18 uker. Avgjøre om de to kurvene er statistisk forskjellig ved hjelp av en log rank test.

2. Tumor Invasion Assay

1. Velg isolert sebrafisk som utvikler svulster dorsalt, i et område mellom den bakre grensen av hindbrain og fremre kant av ryggfinnen (figur 2A).
2. To uker etter melanom utbruddet avlive fisken i henhold til retningslinjer fastsatt av American Veterinary Medical Association Panel på Avliving og godkjent av Universitetet i Massachusetts Medical School Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC). Spesifikt, er en fisk plassert i en tallerken med 0,6 mg / ml Tricaine inntil gill bevegelse stopper.
3. Gjøre et snitt i bukhulen på fisken med en skalpell og deretter plassere fisken i 4% paraformaldehyd (PFA) over natten ved 4 ° C for fiksering.
4. Behandl med 0,5 M EDTA over natten ved 4 ° C til avkalke.
5. Fikse med formalin i kassett natten, tørke i 1 time, klar med xylen 3 ganger for 1 time og deretter behandle med parafin 2 ganger i 2 timer hver på 60 ° C.
6. Legge vevet i parafin i en form og la den stivne i 30 minutter til 1 time.
7. Gjør 5 mikrometer seksjoner, en hver 50 mikrometer. Seksjonene må være tverrgående og gjennom hele lesjonen slik at spissen av dypeste invasjon kan identifiseres. Følge ved hematoxylin og eosin farging.
8. Vurdere tumor invasjon ved å måle hvorvidt kreftceller står utenfor collagenous stratum compactum, invadere i dorsalmuskulatur eller invadere videre inn ryggsøylen (Figur 2B, C). Bestem statistisk forskjell mellom de to sett av prøver.

3. Antistoffarging av Skala Melanocytter

1. Gjøre opp PO4 buffer med 80 ml ​​0,1 M Na ₂ HPO ₄ og 20 ml 0,1 M NaH ₂ PO _4. Kontroller at pH er 7,3. Gjøre opp 2x fix buffer inneholdende 8,0 g sukrose, 0,15 ml 0,2 M CaCl ₂ og 90 ml 0,2 M PO ₄ buffer, pH 7,3. Om nødvendig justeres pH til 7,3 med NaOH eller HCl deretter gjøre opp til 100 ml med PO ₄ buffer.
2. Veie opp til 300 mg solid PFA og legge til en mikrosentrifugerør. Tilsett 5 mM NaOH til et volum lik 4,5 x masse, i mg, av PFA (f.eks 450 ul 5 mM NaOH til 100 mg PFA). Varme ved 60-70 ° C med sporadisk risting inntil PFA er oppløst. Nedtrapping gjenværende partikler og gjenopprette 20% PFA supernatant. Gjør frisk hver gang.
3. Forbered fiksering løsning som inneholder 1x fix buffer og 4% PFA.
4. Anesthetize fisken i 0,17 mg / ml Tricaine.
5. Bruke hendelsen lys under en disseksjonsmikroskop nappe dorsal skalaer ved hjelp skarpe tynn tang, tar seg ikke å skade melanocyte-holdige halvparten av skalaen (figur 3A). Stedsnavn skalerer direkte fra pinsettangens inn 1 ml fikseringsløsning og inkuber ved romtemperatur, mens dreiing, for ≥ 2 hr. Overføre fisken inn fisk vann og overvåke fisken å bekrefte vellykket utvinning.
6. Å bleke pigmenterte melanocytter vaske faste skalaer i PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 ganger i 5 min ved romtemperatur. Tilsett 1 ml ferske blekemiddel som inneholder 0,4 ml 10% KOH og 0,15 ml 30% H ₂ O ₂ i 5 ml med dH ₂ O. Sett på Parafilm eller cap låser for å hindre gass fra sprengning rørene åpne. Fortsett bleking før pigment er borte (10 min er typisk) (3B figur, C). Vask i PBST fire ganger i 5 min ved romtemperaturlitteraturen.
7. Blokk for minst 30 minutter i blokk løsning laget av 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN ₃ og 2% lam serum. Utelate NaN ₃ hvis utvikling med HRP reaksjon.
8. Inkuber med primære antistoff i blokk løsning over natten ved romtemperatur. Du må ha minst 400 pl av løsningen over prøvene å holde dem neddykket.
9. Vask skalaene 3 ganger i 30 minutter i PBST ved romtemperatur.
10. Inkuber med sekundært antistoff fra 2 hr til overnatting i blokk oppløsning ved romtemperatur.
11. Stain i 10 min med PBST + 0,1 pM DAPI.
12. Vask 3 ganger i 5 min med PBST.
13. Monter vekten på et glass lysbilde i en dråpe vectashield slik at den konkave siden av skalaene vender ned mot raset og plassere et glass dekkglass over dem. Forsegle kantene av lysbildet med klar neglelakk og observere lysbildene under et fluorescens mikroskop (Figur 3D, E, F, G

4. Transplantasjon Assay

1. Forbered mottaker 2-3 måneder gamle casper ⁹ fisk ved å bestråle med 25 Gy av gammastråling dagen før transplantasjon ^10. La fisken å komme i fisk vann.
2. Avlive en tumor-bærende fisk som tidligere beskrevet (avsnitt 2.2).
3. Skjær av svulsten og legg den i en petriskål med ca 5 ml filter sterilisert 0.9x PBS med 5% FBS. Terninger svulsten med en barberhøvel mens i løsningen.
4. Arbeide ved romtemperatur, med en triturate P1000 pipette å få enkeltceller. Gjør opp volumet til 25 ml med filter steriliseres 0.9x PBS med 5% FBS.
5. Filtrere gjennom 40 pM mesh filter.
6. Spinne i en Eppendorf 5810R tabletop sentrifuger ved 1500 rpm (453 RCF) i 10 min.
7. Supernatanten fjernes og gjøre cellesuspensjon til grovt ønsket konsentrasjon (anta 10 ⁷ celler for en 100 mm ³ tumor).
8. Beregn than eksakt celle nummer ved hjelp av en hemocytometer og fortynne cellesuspensjonen slik at det endelige injeksjonsvolum er ca 5 pl. For eksempel, hvis 50 000 celler er som skal injiseres, bør cellesuspensjonen bli fortynnet til en endelig konsentrasjon på 10 000 celler / ul. Flick røret inneholdende cellesuspensjonen hver noen minutter for å hindre klumping av cellene.
9. Vaske en 26s gauge (bevel tips) 701 N 10 ul Hamilton sprøyte 2-3 ganger med 100% etanol og 0.9x PBS. Laste sprøyten med 5 pl av cellesuspensjonen.
10. Anesthetize den bestrålte mottaker fisk i 0,17 mg / ml Tricaine. Legg fisken på sin side på en fuktig Kimwipe (figur 4A).
11. Stabilisere fisken med den ene hånden og stikk nålen med skråkant vendt opp i 45 ° vinkel inn flanken av fisk over bukhulen omtrent halvveis mellom den bakre grensen til hindbrain og fremre kant av ryggfinnen. Forsiktig stemplet trykkes (figur 4B). </ Li>
12. La fisken å komme i fersk fisk vann og observere fisk daglig for tumor engraftment (Figur 4C). Hvis engraftment har oppstått, kan fortsatt vekst og sykdom utvikling også observeres.

Representative Results

Ett-cellers Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (LF), mitfa (LF) sebrafisk embryoer ble injisert med miniCoopR vektor inneholdende melanom onkogen SETDB1 5 eller EGFP, hver under kontroll av mitfa promotoren. Embryoer med melanocyte redning ble valgt og lov til å modnes. Ved 2 måneders alder dyr med melanocyte redning større enn 4 mm ² ble valgt. Dyrene ble screenet ukentlig melanomer. Svulstforekomsten kurver for voksne viste at SETDB1 onkogen betydelig akselerert melanom onsetas sammenlignet med EGFP kontroll (figur 1). Dyr som utviklet svulster mellom bakre grensen av hindbrain og fremre kant av ryggfinnen (figur 2A) ble isolert. To uker etter melanom utbruddet de ble fiksert i 4% paraformaldehyd, seksjoneres og flekker med hematoxylin og eosin for å vurdere melanom invasjon i underlying vev. Melanomer uttrykker SETDB1 var mer lokalt invasiv enn EGFP kontroll melanomer (figur 2C). For å lete etter ekspresjon av en kandidat genet ble dorsal skalaer hentet ut fra en villtype sebrafisk og farget med en 1:100 fortynning av et primært antistoff som gjenkjenner Mitfa transkripsjonsfaktor etterfulgt av en 1:1.000 fortynning av FITC geit anti -kanin IgG-antistoff (figur 3). For å vurdere transplantability av svulsten ble melanom celler isolert fra en Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (LF), mitfa (LF) fisk injisert med miniCoopR-EGFP. 50.000 celler ble subkutant injisert i en mottaker casper mutant som hadde blitt bestrålt dagen før med 25 Gy. Av to ukers alder, var pigmenterte donor-avledet celler lett gjenkjent (figur 4).

o: src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" />
Figur 1. Screening for melanom innsettende modifikatorer bruker miniCoopR analysen. A) Skjematisk av miniCoopR analysen. Embryo med reddet melanocyttene (pilspiss) inneholder miniCoopR vektor og genet av interesse. Skala bar = 250 mikrometer. Voksen med mer enn 4 mm ² melanocyte redning (pilspiss). Målestokk = 500 mikrometer B) MiniCoopR-EGFP reddet sebrafisk med en amelanotic og en pigmentert svulst (pilspisser). C) Representative melanom overlevelse kurve sammenligne svulster uttrykker onkogen SETDB1 og en kontroll EGFP genet (p = 9,4 × 10 ^-7, logrank χ ^2). Klikk her for å se større figur .

2.jpg "/>
Figur 2. Tumor invasjonen analysen. A) MiniCoopR-reddet sebrafisk med en dorsal tumor (pilspiss) mellom den bakre grensen til hindbrain og fremre kant av ryggfinnen. B) tverrsnitt viser stratum compactum (SC), skalaer, skala-assosiert melanocyte (SAM) (innfelt, skala bar = 50 mikroM), muskel (M) og ryggsøylen (SPC). Skala bar = 200 mikrometer. C) Tverrgående områder som viser en ikke-invasiv miniCoopR-EGFP tumor (T) (til venstre) og en miniCoopR-SETDB1 tumor (til høyre) som har invadert gjennom stratum compactuminto muskelen (M) og ryggsøylen. Skala bar = 200 mikrometer.

Figur 3. Antistoffarging av skalaen melanocytter. A) Vekter blir plukket fra en bedøvet miniCoopR-EGFP sebrafisk. B) ubleikede skala med pigmentert melanocyttene og C) bleket sCale fra miniCoopR-EGFP sebrafisk. Skala bar = 100 mikrometer. Ubleket skala farget med en D) Mitfa antistoff og E) DAPI. Bleket skala farget med en F) Mitfa antistoff og G) DAPI. Skala bar = 40 mikrometer.

Figur 4. Transplantasjon av melanom celler. A) Uninjected casper sebrafisk. Skala bar = 500 mikrometer. B) Subkutan transplantasjon nettsted (pilspiss) på en bestrålt casper mottaker umiddelbart etter injeksjon med 50.000 melanom celler. Skala bar = 200 mikrometer. C) Bestrålt casper mottaker viser tumor engraftment (pilspiss) to uker etter injeksjonen med 50.000 melanom celler.

Discussion

Den miniCoopR metoden muliggjør uttrykket av gener av interesse i sebrafisk melanocytter. Denne tilnærmingen tar fordel av det faktum at sebrafisk mitfa genet virker celle-autonomt. Av denne grunn, melanocytter reddet av miniCoopR vektoren er sikker på å inneholde minigene og eventuelle gen av interesse som det er fysisk koplet. Reddet melanocyttene er godt synlig og kan fås hos dyr som ble injisert som encellede embryoer. En spesifisert grad av chimerism er valgt, og dyr som overgår denne cutoff kan scores for tumor utbruddet eller andre kjennetegn. En stor fordel av miniCoopR metoden er at dyr med tilstrekkelig chimerism kan lett identifiseres og scoret uten å oppnå stabile transgene linjer tilsvarende hvert gen av interesse testes. Tid, krefter og penger blir lagret i forhold til antall gener av interesse å bli kartlagt.

Som rapportert tidligere ⁵

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gateway recombination reagents	Invitrogen
miniCoopR			Reference5
Mitfa antibody			Reference5
FITC goat anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
casper Zebrafish			Reference9
701N 10 μl Syringe	Hamilton/Fisher	14-824
40 μM filter	BD Falcon/Fisher	352340
FBS	Invitrogen	26140079