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Medicine

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Published: November 13, 2012 doi: 10.3791/50086

Summary

Uma forma rápida de tela para modificadores de melanoma, utilizando um modelo de tumor zebrafish autóctone é apresentado. Leva vantagem de o vector miniCoopR que permite a expressão de genes candidatos de melanoma nos melanócitos. Um método para obtenção das curvas de sobrevida livre de melanoma, um ensaio de invasão, um protocolo para a coloração de anticorpos de melanócitos de escala e um ensaio de transplante de melanoma são descritos.

Abstract

Estudos genômicos de cânceres humanos produziram uma riqueza de informações sobre os genes que são alterados em tumores 1,2,3. Um desafio proveniente destes estudos é que muitos genes é alterada, e isso pode ser difícil distinguir as alterações genéticas que levaram tumorigénese de que aqueles surgiu incidentalmente durante a transformação. Para fazer esta distinção é benéfico ter um ensaio que pode medir quantitativamente o efeito de um gene alterado em iniciação do tumor e de outros processos que permitem que os tumores de persistir e disseminar. Apresentamos aqui um meio rápido para pesquisar um grande número de modificadores candidatos de melanoma no peixe-zebra utilizando um modelo de 4 autóctone tumor que inclui os passos necessários para a iniciação e manutenção de melanoma. Um reagente chave no presente ensaio é o vector miniCoopR, que acopla a cópia de tipo selvagem do factor especificação mitfa melanócito para uma cassete na qual a recombinação gateway candidato melAnoma genes podem ser recombinados 5. O vector tem um minigene miniCoopR resgate mitfa que contém o promotor, quadros de leitura aberta e região 3 'não traduzida do gene de tipo selvagem mitfa. Ele permite fazer construções de comprimento total, utilizando quadros de leitura abertos de modificadores de melanoma candidatos. Estes clones individuais podem então ser injetado em uma única célula de Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); embriões mitfa (LF) zebrafish. O vector miniCoopR fica integrado por Tol2 mediada por transgénese 6 e resgates melanócitos. Porque eles são fisicamente acoplados ao resgate mitfa minigene, genes candidatos são expressos em melanócitos resgatados, alguns dos quais irão transformar e desenvolver-se em tumores. O efeito de um gene candidato para a iniciação melanoma e as propriedades das células de melanoma pode ser medida utilizando as curvas de sobrevida livre de melanoma, ensaios de invasão, coloração de anticorpos e ensaios de transplante.

Protocol

1. Triagem para Modificadores Onset Melanoma

  1. Criar clones porta de entrada do meio de amplificação do PCR de comprimento completo de leitura aberta de genes de interesse (GOI) e recombinação em pDONR 221 utilizando BP clonase II (Invitrogen). Use Multisite gateway tecnologia (Invitrogen) para se recombinam p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 e miniCoopR 5 para colocar os genes de interesse sob o promotor no vector mitfa miniCoopR (Figura 1A).
  2. Injectar 25 picogramas de cada clone, juntamente com 25 picogramas de mRNA Tol2 transposase numa única célula-Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); mitfa (lf) de embriões zebrafish triplamente homozigóticos como descrito anteriormente 7. Incubar os embriões injetados em 28,5 ° C. Remova todos os embriões mortos em 24 hpf.
  3. Selecione animais transgênicos com melanócitos resgatados a 72 hpf colocando a placa de Petri contendo embriões injetados em um microscop dissecare sob a luz incidente sobre um fundo branco (Figura 1A).
  4. Transferir os animais para três tanques L no berçário da unidade zebrafish a 4 dpf como descrito anteriormente 8.
  5. Aos 2 meses, seleccionar os animais com, pelo menos, uma área de recuperação de melanócitos maior do que 4 mm 2 (Figura 1A). Existe uma forte correlação entre o grau de recuperação dos melanócitos a 72 hpf e o grau de recuperação dos melanócitos menos 2 meses. Quando embriões com resgate de melanócitos são colhidas a 72 hpf, a maioria (~ 80%) que tem pelo menos uma área de recuperação de melanócitos maior do que 4 mm 2 em 2 meses.
  6. Tela de os animais seleccionados semanais para a presença de tumores (Figura 1B). Há uma forte correlação entre as alterações histopatológicas e morfológica. Transição do benigno para maligno é reconhecida como uma alteração morfológica, quando lesões tornam-se levantada para fora da superfície do animal. Isolar anima rolamento tumorls para estudo.
  7. Desenhar as curvas de sobrevida livre de melanoma com a idade em semanas na abcissa e por cento melanoma sobrevida livre na ordenada. Os animais com os melanócitos que expressam um gene de interesse são comparadas com os animais de controlo que expressam EGFP (enhanced green fluorescent protein) nos melanócitos (Figura 1C). O início médio do tumor para os animais injectados com miniCoopR-EGFP é de aproximadamente 18 semanas. Determinar se as duas curvas são estatisticamente diferentes através de um teste de log rank.

2. Ensaio de Invasão Tumoral

  1. Seleccione zebrafish isolado que desenvolvem tumores dorsalmente, numa região situada entre o limite posterior do cérebro posterior e borda anterior da barbatana dorsal (Figura 2A).
  2. Duas semanas após o início melanoma sacrificar os peixes de acordo com as orientações especificadas pelo Painel Associação Médica Veterinária Americana sobre a eutanásia e aprovado pela Universidade de Medicina de Massachusetts InsAnimal Care e do Comitê titutional Uso (IACUC). Especificamente, um peixe é colocada num prato com 0,6 mg / ml até tricaina brânquia movimento pára.
  3. Fazer uma incisão na cavidade peritoneal de o peixe com um escalpelo e, em seguida, colocar o peixe em paraformaldeído a 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C para a fixação.
  4. Trata-se com 0,5 M de EDTA durante a noite a 4 ° C a descalcificação.
  5. Fixar com formalina na cassete durante a noite, desidratar durante 1 h, claro, com xileno 3 vezes durante 1 hora e em seguida trata-se com parafina duas vezes durante 2 horas cada, a 60 ° C.
  6. Incorporar o tecido em parafina num molde e deixar solidificar durante 30 minutos a 1 hora.
  7. Fazer 5 mm de cada um, 50 um. As secções transversais e devem ser através de toda a lesão a fim de que o ponto mais profundo da invasão pode ser identificado. Siga pela hematoxilina e eosina.
  8. Avaliar a invasão tumoral medindo se células tumorais permanecem fora do colágeno estrato compactum, invadir na dorsalmusculatura ou invadir ainda mais para a coluna vertebral (Figura 2B, C). Determinar diferença estatística entre os dois conjuntos de amostras.

3. A coloração de anticorpo de melanócitos Escala

  1. Perfazer com tampão PO4 80 ml ​​0,1 M de Na 2 HPO 4 e 20 ml de 0,1 M de NaH 2 PO 4. Verifique se o pH é 7,3. Tornar-se tampão de solução 2x contendo 8,0 g de sacarose, 0,15 ml de CaCl 2 0,2 M e 90 ml de 0,2 M de tampão PO4, pH 7,3. Se necessário ajustar o pH para 7,3 com NaOH ou HCl, em seguida, completar a 100 ml com tampão de PO 4.
  2. Pesar até 300 mg de sólido PFA e adicionar a um tubo de microcentrífuga. Adicionar NaOH 5 mM para um volume igual a 4,5 x a massa, em mg, de PFA (por exemplo, 450 ul de 5 mM de NaOH e 100 mg de PFA). Aquece-se a 60-70 ° C com agitação ocasional até que o PFA é dissolvido. Girar partículas remanescentes e recuperar 20% PFA sobrenadante. Fazer o tempo todo fresco.
  3. Prepare a solução de fixação contendo 1x fix tampão e 4% PFA.
  4. Anestesiar os peixes em 0,17 mg / ml tricaina.
  5. Usando a luz incidente sob um microscópio de dissecação arrancar escamas dorsais usando nítidas de ponta fina pinça, tomando cuidado para não danificar o meia melanócito contendo da escala (Figura 3A). Escalas local diretamente a pinça em uma solução de fixação ml e incubar à temperatura ambiente, ao girar, para ≥ 2 horas. Transfira o peixe em água de peixe e monitorar o peixe para confirmar a recuperação bem sucedida.
  6. A lixívia melanócitos pigmentados lavar tabelas fixas em PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% de Triton X-100) 2 vezes durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 1 ml de solução alcalina feita recentemente contendo 0,4 ml de KOH a 10% e 0,15 ml de 30% de H 2 O 2 em 5 ml de dH 2 O. Coloque em bloqueios parafilme ou boné para evitar que o gás de estourar os tubos abertos. Continuar até branqueamento pigmento é ido (10 min é típico) (Figura 3B, C). Lavar quatro vezes em PBST, durante 5 min à temperatura ambienteratura.
  7. Bloco de, pelo menos, 30 min em solução de bloqueio feita de 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN 3, e 2% de soro de cordeiro. Deixar de fora NaN 3 se desenvolver com a reação HRP.
  8. Incubar com anticorpo primário em solução bloqueadora durante a noite à temperatura ambiente. Você precisa de ter, pelo menos, 400 ul de solução sobre as amostras para mantê-los submergidos.
  9. Lave as escalas 3 vezes durante 30 min em PBST, à temperatura ambiente.
  10. Incubar com o anticorpo secundário de 2 horas a durante a noite em solução de bloqueio à temperatura ambiente.
  11. Mancha por 10 min com PBST DAPI uM + 0.1.
  12. Lavar 3 vezes durante 5 min com PBST.
  13. Montar as escalas em uma lâmina de vidro em uma gota de Vectashield de modo que o lado côncavo da balança está voltado para baixo no sentido da lâmina e colocar uma lamela de vidro sobre eles. Vedar as extremidades da lâmina com unha polonês clara e observar as lâminas num microscópio de fluorescência (Figura 3D, E, F, G

4. Transplante de Ensaio

  1. Prepare destinatário 2-3 meses de idade casper 9 peixes através da irradiação com 25 Gy de radiação gama, um dia antes do transplante 10. Permitir que os peixes se recuperar em peixes de água.
  2. Euthanize um peixe portadores de tumor tal como previamente descrito (secção 2.2).
  3. Cortar o tumor e colocá-lo em uma placa de Petri com aproximadamente 5 ml de filtro esterilizado 0.9x PBS com 5% de FBS. Dado o tumor com uma lâmina de barbear, enquanto em solução.
  4. Trabalhar à temperatura ambiente, tritura-se com uma pipeta P1000 para obter células únicas. Perfazer o volume para 25 ml com filtro esterilizado 0,9 x PBS com 5% de FBS.
  5. Filtrar através de filtro de 40 mesh uM.
  6. Girar em uma centrífuga de bancada Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 rcf) durante 10 min.
  7. Remover o sobrenadante e fazer a suspensão das células a uma concentração aproximadamente desejado (assume-se 10 7 células de tumor de 100 mm 3).
  8. Calcular tele número exato de células utilizando um hemocitómetro e dilui-se a suspensão de células de modo a que o volume final de injecção é de cerca de 5 ul. Por exemplo, se a 50.000 células são para ser injectada, a suspensão de células deve ser diluído para uma concentração final de 10000 células / uL. Flick o tubo que contém a suspensão de células a cada poucos minutos para evitar aglomeração das células.
  9. Lavar um calibre 26 (ponta cónica) 701 N 10 seringa Hamilton ul 2-3 vezes com etanol a 100% e 0,9 x PBS. Carregar a seringa com 5 uL da suspensão de células.
  10. Anestesiar os peixes destinatário irradiado em 0,17 mg / ml tricaina. Coloque o peixe de lado sobre um Kimwipe húmido (Figura 4A).
  11. Estabilizar os peixes com uma mão e inserir a agulha com o bisel voltado para cima em um ângulo de 45 ° no flanco do peixe acima da cavidade peritoneal a meio caminho entre o limite posterior do cérebro posterior e borda anterior da barbatana dorsal. Suavemente o êmbolo (Figura 4B). </ Li>
  12. Permitir que o peixe se recuperar a água de peixe fresco e observar o peixe por dia, durante o enxerto do tumor (Figura 4C). Se o enxerto tenha ocorrido, o crescimento continuado e o desenvolvimento da doença pode também ser observado.

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Representative Results

Uma célula-Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); mitfa embriões (lf) zebrafish foram injectados com o vector contendo o oncogene miniCoopR melanoma SETDB1 5 ou EGFP, cada um sob o controlo do promotor de mitfa. Embriões com resgate de melanócitos foram selecionados e permitiu a amadurecer. Aos 2 meses de idade, com os animais de resgate melanócito maior do que 4 mm 2 foram selecionados. Os animais foram examinados semanalmente para melanomas. Curvas de incidência do tumor para os adultos, mostrou que o oncogene SETDB1 acelerou significativamente onsetas melanoma em comparação com o controlo de EGFP (Figura 1). Os animais que desenvolveram tumores entre o limite posterior do cérebro posterior ea margem anterior da barbatana dorsal (Figura 2) foram isolados. Duas semanas após o início do melanoma foram fixados em paraformaldeído a 4%, seccionados e corados com hematoxilina e eosina para avaliar a invasão melanoma em underlying tecidos. Melanomas expressando SETDB1 eram mais localmente invasivo do que EGFP controle melanomas (Figura 2C). A fim de examinar a expressão de um gene candidato, as escamas dorsais foram retiradas a partir de um peixe-zebra de tipo selvagem e corados usando uma diluição de 1:100 de um anticorpo primário que reconhece o factor de transcrição Mitfa seguido de uma diluição 1:1000 de anti-cabra FITC -coelho IgG (Figura 3). Para avaliar transplantability do tumor, as células de melanoma foram isolados a partir de uma Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf), peixe mitfa (lf), injectada com miniCoopR-EGFP. 50.000 células foram injectados subcutaneamente numa casper receptor mutante que tinha sido irradiado no dia anterior, com 25 Gy. Por 2 semanas de idade, pigmentadas células derivadas de dador foram facilmente reconhecidas (Figura 4).

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Figura 1. Rastreio de modificadores de melanoma de início utilizando o ensaio miniCoopR. A) Esquema do ensaio miniCoopR. Embrião com melanócitos resgatados (ponta de seta) que contêm o vector miniCoopR e o gene de interesse. Barra de escala = 250 uM. Adulto com mais de 4 mm 2 resgate do melanócito (ponta de seta). Barra de escala = 500 uM B) MiniCoopR-EGFP resgatado zebrafish com um amelanótico e um tumor pigmentado (pontas de seta). C) Representante da curva de sobrevida livre de melanoma comparando tumores que expressam SETDB1 oncogene e um controle EGFP gene (p = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 2. Ensaio de invasão tumoral. A) zebrafish MiniCoopR-resgatado com um tumor dorsal (seta) entre o limite posterior do cérebro posterior ea margem anterior da barbatana dorsal. B) seção transversal mostrando estrato compactum (SC), escalas, escala associada melanócito (SAM) (bar, encarte escala = 50 mM), músculo (M) e coluna (SPC). Barra de escala = 200 uM. C) Secções transversais que mostram uma forma não invasiva de tumores miniCoopR EGFP-(T) (à esquerda) e uma miniCoopR-SETDB1 tumor (direita) que tem invadido através do músculo compactuminto estrato (M) e da coluna vertebral. Barra de escala = 200 uM.

Figura 3
Figura coloração do anticorpo 3. De melanócitos escala. A) Escalas sendo arrancado de um anestesiado miniCoopR EGFP-zebrafish. B) escala Crus com melanócitos pigmentadas e C) s branqueadacale de miniCoopR-EGFP zebrafish. Barra de escala = 100 mm. Escala crus coradas com um anticorpo D Mitfa) e E) DAPI. Escala branqueada coradas com um F) Mitfa anticorpo e G) DAPI. Barra de escala = 40 um.

Figura 4
Figura 4. Transplante de células de melanoma. A) não injectada zebrafish casper. Barra de escala = 500 uM. B) subcutânea local de transplante (ponta de seta) em um recipiente casper irradiadas imediatamente após a injecção, com 50.000 células do melanoma. Barra de escala = 200 uM. C) destinatário casper irradiado mostrando enxerto tumor (seta) duas semanas após a injeção de 50.000 células de melanoma.

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Discussion

O método miniCoopR permite a expressão de genes de interesse em melanócitos zebrafish. Esta abordagem toma vantagem do facto de que o gene do peixe-zebra mitfa age células autonomamente. Por este motivo, os melanócitos resgatados pelo vector miniCoopR são determinados para conter o minigene e qualquer gene de interesse ao qual ele está fisicamente acoplados. Melanócitos resgatados são claramente visíveis e podem ser obtidos de animais que foram injectados como embriões de uma única célula. Um grau especificado de quimerismo é selecionado, e os animais que ultrapassam esse corte pode ser marcado para o aparecimento do tumor ou outras características. Uma grande vantagem do método é que os animais miniCoopR com quimerismo suficiente pode ser facilmente identificado e marcado sem a necessidade de obtenção de linhas transgénicas estáveis ​​correspondentes a cada gene de interesse testado. Tempo, esforço e despesa são guardados em proporção com o número de genes de interesse a ser pesquisados.

Como relatado anteriormente 5

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Leonard I. Zon em cujo laboratório estas técnicas foram desenvolvidas inicialmente; Kristen Kwan eo falecido Chi-Bin Chien para presentes de plasmídeos utilizados neste trabalho, Tiago e David Lister Raible para assistência com coloração de anticorpos e James Neiswender para o vídeo microinjecção. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão R00AR056899-03 para CJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gateway recombination reagents Invitrogen
miniCoopR Reference5
Mitfa antibody Reference5
FITC goat anti-rabbit IgG antibody Invitrogen
Vectashield Vector Labs H-1000
casper Zebrafish Reference9
701N 10 μl Syringe Hamilton/Fisher 14-824
40 μM filter BD Falcon/Fisher 352340
FBS Invitrogen 26140079

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References

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Biologia do Câncer Edição 69 Medicina Genética Biologia Molecular Melanoma peixe-zebra, Melanócitos modelo de tumor miniCoopR
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Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C.More

Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model. J. Vis. Exp. (69), e50086, doi:10.3791/50086 (2012).

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