Summary
Быстрый способ для выявления меланомы модификаторы помощью рыбок данио автохтонных модели опухоли представлены. Он использует miniCoopR вектор, который позволяет для выражения кандидата меланомы генов в меланоциты. Способ получения меланомы выживаемость без кривые, вторжение анализа, протокол для окрашивания антител масштаба меланоцитов и анализа меланомы трансплантации описаны.
Abstract
Геномных исследований рака у человека дали огромное количество информации о генах, которые изменяются в опухолях 1,2,3. Задача, вытекающие из этих исследований является то, что многие гены меняются, и это может быть трудно отличить генетические изменения, которые привели опухолей из тех, что возникли случайно во время преобразования. Чтобы нарисовать это различие это полезно иметь тест, который можно количественно измерить влияние измененного гена в раковых клеток и другие процессы, которые позволяют опухоли сохраняются и распространение. Здесь мы представляем быстрое средство для скрининга большого количества модификаторов кандидата меланомы у рыбок данио использованием автохтонных 4 модели опухоль, которая включает в себя шаги, необходимые для начала меланомы и технического обслуживания. Ключевым реагентом в этом анализе есть вектор miniCoopR, что пары дикого типа копия mitfa меланоцитов фактор спецификации кассету рекомбинации шлюз, в котором кандидат Меланомалий генов могут быть объединены 5. Вектор miniCoopR имеет минигена mitfa спасения, который содержит промотор, открытые рамки считывания и 3'-нетранслируемой области гена дикого типа mitfa. Это позволяет нам производить конструкций с использованием полной длины открытые рамки считывания модификаторов кандидата меланомы. Эти отдельные клоны могут быть введены в одной ячейке Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); mitfa (LF) эмбрионы рыбок данио. Вектор miniCoopR получает интегрированы Tol2-опосредованной трансгенез 6 и спасает меланоцитов. Потому что они физически соединены с mitfa спасения минигена, кандидат гены экспрессируются в спасена меланоцитов, некоторые из которых будут преобразовывать и развивать в опухоли. Влияние генов-кандидатов о возбуждении меланомы и свойства клеток меланомы может быть измерена с помощью меланомы выживаемость без кривые, вторжение анализы, окрашивание антител и трансплантации анализов.
Protocol
1. Скрининг на модификаторы Меланома Onset
- Создание шлюза клонов среднего запись с помощью ПЦР усиления полнометражный открытые рамки считывания генов интересов (ГОИ) и рекомбинации в pDONR 221 использовании BP clonase II (Invitrogen). Используйте многоузлового шлюз технологий (Invitrogen) для рекомбинации p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit № 302 p3E_SV40polyA 6 и miniCoopR 5 до размещать интерес генов под промоутер mitfa в miniCoopR вектора (рис. 1А).
- Inject 25 пикограмм каждого клона вместе с 25 пикограмм Tol2 транспозазы мРНК в одной ячейке Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); mitfa (LF) трижды гомозиготные эмбрионы рыбок данио, как описано выше 7. Инкубируйте вводят эмбрионы на 28,5 ° C. Удалите все мертвые эмбрионы на 24 HPF.
- Выберите трансгенных животных с спасли меланоцитов на 72 HPF, поставив чашку Петри, содержащую впрыском эмбрионов на рассекающих микротрещине при падающем свете на белом фоне (рис. 1А).
- Передача животных до 3 танков L в питомнике рыбок данио-центр на 4 денье, как описано выше 8.
- В 2-х месяцев, выделите животных, по крайней мере в одной области меланоцитов спасательных более 4 мм 2 (рис. 1А). Существует сильная корреляция между степенью меланоцитов спасательные при 72 HPF и степень меланоцитов спасания на 2 месяца. Когда эмбрионы с меланоцитов спасательных собирают на 72 HPF, большинство из них (~ 80%) будет иметь по крайней мере одну область меланоцитов спасательных более 4 мм 2 на 2 месяца.
- Экран выбранных животных еженедельно на наличие опухоли (рис. 1б). Существует сильная корреляция между гистопатологических и морфологические изменения. Переход от доброкачественных в злокачественные признан морфологические изменения при поражении стать подняты на поверхность животных. Изолировать опухоли анима подшипниковLs для изучения.
- Ничья меланомы без кривые выживаемости с возрастом недели на оси абсцисс и процентов меланомы выживаемость без по оси ординат. Животные с меланоциты, которые выражают интерес гена сравниваются с контрольными животными, которые выражают EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) в меланоциты (рис. 1С). Средний начало опухоли на животных, которым вводили miniCoopR-EGFP составляет примерно 18 недель. Определить, является ли две кривые статистически значимых различий с помощью теста журнала ранга.
2. Опухоль анализа Вторжение
- Выберите изолированные рыбок данио, которые развиваются опухоли в верхней части, в области между задней границей заднего мозга и передним краем спинного плавника (рис. 2A).
- Через две недели после начала меланомы усыпить рыбу в соответствии с руководящими принципами, указанными американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации Панель об эвтаназии и одобрены Университета штата Массачусетс медицинской школы Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC). В частности, рыбу помещают в посуду с 0,6 мг / мл Tricaine до жаберных движение останавливается.
- Сделайте надрез в брюшной полости рыбы с помощью скальпеля, а затем поместить рыбу в 4% параформальдегид (PFA) в течение ночи при 4 ° С для фиксации.
- Отнеситесь с 0,5 М ЭДТА в течение ночи при 4 ° С до известковые отложения.
- Исправить с формалином в кассете ночь, обезвоживают в течение 1 часа, прозрачный с ксилолом 3 раза в течение 1 часа и затем обрабатывают парафином 2 раза по 2 часа каждый при 60 ° C.
- Вставить ткани в парафин в форму и дать ему укрепить в течение 30 мин до 1 часа.
- Сделайте 5 мкм разделов, один раз в 50 мкм. Сечение должно быть поперечных и по всей поражения, так что точка глубокое вторжение может быть идентифицирован. Следите гематоксилином и эозином.
- Оценка опухолевой инвазии, измеряя ли опухолевые клетки остаются вне коллагеновых слой компакта, вторгаются в спинномМускулатура или вторгнуться вглубь позвоночного столба (рис. 2В, С). Определить статистические различия между двумя наборами образцов.
3. Антитела Окрашивание шкале Меланоциты
- Макияж PO4 буфера с 80 мл 0,1 М Na 2 HPO 4 и 20 мл 0,1 М NaH 2 PO 4. Убедитесь в том, рН 7,3. Макияж 2x буфер исправление содержащих 8,0 г сахарозы, 0,15 мл 0,2 М CaCl 2 и 90 мл 0,2 М PO 4 буфера, рН 7,3. При необходимости отрегулировать рН до 7,3 с NaOH или HCl затем сделать до 100 мл с PO 4 буфера.
- Взвешивание до 300 мг твердого PFA и добавить в микроцентрифуге трубку. Добавить 5 мМ NaOH в объеме, равном 4,5 х масса в мг, PFA (например, 450 улица 5 мМ NaOH до 100 мг PFA). Тепло при температуре 60-70 ° C при периодическом встряхивании до PFA не растворится. Спином вниз оставшиеся частицы и восстановить 20% PFA супернатант. Сделайте свежие каждый раз.
- Подготовка фиксации раствор, содержащий 1x Fiх буфера и 4% PFA.
- Anesthetize рыбы в 0,17 мг / мл Tricaine.
- Использование падающего света под рассекает микроскопом срывать спинного масштабах с помощью резкого острым пинцетом, стараясь не повредить меланоцитов, содержащих половине шкалы (рис. 3А). Место масштабах непосредственно из щипцов в 1 мл раствора фиксации и инкубировать при комнатной температуре, а при повороте, в течение ≥ 2 часа. Передача рыбы в воде рыбы и следить за рыбой для подтверждения успешного восстановления.
- Для отбеливания пигментированных меланоцитов мыть фиксированных весов в PBST (1x PBS рН 7,4, 0,1% Тритон Х-100) 2 раза в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавить 1 мл недавно сделал раствором хлорной извести, содержащей 0,4 мл 10% KOH и 0,15 мл 30% H 2 O 2 в 5 мл с дН 2 O. Положите на парафильмом или кепка замками для предотвращения газа от разрыва трубы открыты. Продолжить отбеливания, пока пигмент ушел (10 мин типично) (рис. 3В, C). Стирать в PBST четыре раза в течение 5 мин при комнатной температуреerature.
- Блок, по крайней мере, 30 минут в блоке решения состоит из 1x PBS рН 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 мг / мл BSA, 1% ДМСО, 0,02% NaN 3 и 2% баранины сыворотки. Оставьте из NaN 3, если развивается реакция HRP.
- Инкубируйте с первичными антителами в блоке решения на ночь при комнатной температуре. Вы должны иметь по крайней мере 400 мкл раствора над образцами, чтобы держать их под водой.
- Вымойте весы 3 раза по 30 мин в PBST при комнатной температуре.
- Инкубируйте с вторичными антителами, от 2 часов до ночи в блоке раствора при комнатной температуре.
- Пятно в течение 10 мин с PBST + 0,1 мкм DAPI.
- Промыть 3 раза по 5 мин с PBST.
- Установите весы на предметное стекло в каплю vectashield так, чтобы вогнутая сторона весов была обращена вниз к слайд и поместите скольжения стеклянную крышку над ними. Печать края слайда с прозрачного лака для ногтей и наблюдать слайдов под флуоресцентным микроскопом (рис. 3D, E, F, G
4. Трансплантация анализа
- Подготовка получателей 2-3 месяца Каспер 9 рыбу облучением 25 Гр гамма-облучения за один день до пересадки 10. Дайте рыбе восстановиться в рыбе вода.
- Усыпить опухоль рыбы, как описано ранее (см. раздел 2.2).
- Отрежьте опухоли и положите его в чашку Петри с приблизительно 5 мл фильтр стерилизованное 0,9 x PBS с 5% FBS. Нарезать опухоли с бритвой в то время как в растворе.
- Рабочие при комнатной температуре, растирают с P1000 пипетку, чтобы получить отдельные клетки. Сделать объем до 25 мл с фильтром стерилизованное 0,9 x PBS с 5% FBS.
- Фильтр по 40 сетчатый фильтр мкМ.
- Спин в настольном центрифуге Eppendorf 5810R при 1500 оборотов в минуту (453 RCF) в течение 10 мин.
- Удалить супернатант и сделать клеточной суспензии примерно до нужной концентрации (предположим, 10 7 клеток на 100 мм 3 опухоли).
- Рассчитать тОн точное количество клеток с использованием гемоцитометр и разбавить суспензию клеток так, чтобы конечный объем впрыска составляет примерно 5 мкл. Например, если 50000 клеток должны быть введены, суспензию клеток должно быть разведено до конечной концентрации 10000 клеток / мкл. Флик пробирку, содержащую суспензию клеток каждые несколько минут, чтобы предотвратить слипание клеток.
- Вымойте 26s колеи (конические чаевые) 701 N 10 мкл шприца Hamilton 2-3 раза со 100% этанола и 0.9x PBS. Загрузите шприц с 5 мкл клеточной суспензии.
- Anesthetize облученной рыбы получателя в 0,17 мг / мл Tricaine. Место рыбу на своей стороне на влажную Kimwipe (рис. 4а).
- Стабилизация рыбы с одной стороны, и вставить иглу со скосом вверх под углом 45 градусов в бок рыбы выше брюшной полости примерно на полпути между задней границей заднего мозга и передней границе спинной плавник. Слегка нажмите на поршень (рис. 4В). </ Li>
- Дайте рыбе восстановиться в пресной воде рыбы и наблюдать рыбы ежедневно в течение опухоли приживления (рис. 4в). Если приживления не произошло, дальнейшего роста и развития болезни можно наблюдать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Один клеток Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); mitfa (LF) эмбрионы рыбок данио вводили miniCoopR вектора, содержащего онкоген меланомы SETDB1 5 или EGFP, каждый под контролем промотора mitfa. Эмбрионы с меланоцитов спасательных были отобраны и позволил, чтобы созреть. На 2-месячного возраста животных с меланоцитов спасательных более 4 мм 2 были выбраны. Животные были обследованы в неделю в течение меланомы. Опухоль кривые заболеваемости для взрослых показало, что SETDB1 онкоген значительно ускорить меланомы onsetas по сравнению с контрольной EGFP (рис. 1). Животные, которые развились опухоли между задней границей заднего мозга и передней границе спинной плавник (рис. 2A) были изолированы. Через две недели после начала меланомы они были зафиксированы в 4% параформальдегид, секционного и окрашивали гематоксилином и эозином для оценки меланомы вторжения в ООНderlying тканей. Меланомы выражения SETDB1 были более локально инвазивной, чем EGFP управления меланомы (рис. 2С). Для того, чтобы посмотреть на выражение генов-кандидатов, спинной шкал сорвал с диким типом рыбок данио и окрашивали с использованием разведении 1:100 первичной антитело, которое распознает Mitfa фактор транскрипции следует 1:1000 разведение FITC анти козы IgG-антитела кролика (рис. 3). Для оценки transplantability опухоли, клетки меланомы были изолированы от Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); mitfa (LF) рыбу вводят miniCoopR-EGFP. 50000 клеток подкожно вводили в получателем Каспер мутанта, который был облученных накануне с 25 Гр. По 2-недельного возраста, пигментные донора клеток, полученных были легко узнаваемы (рис. 4).
о: SRC = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg" />
Рисунок 1. Скрининга меланомы начала использования модификаторов miniCoopR анализа. А) Схема анализа miniCoopR. Эмбрион с спасли меланоцитов (стрелки), содержащие вектор miniCoopR и интерес гена. Шкала бар = 250 мкм. Взрослые с более чем 4 мм 2 меланоцитов спасения (стрелки). Шкала бар = 500 мкМ B) MiniCoopR-EGFP спас рыбок данио с беспигментные и пигментированные опухоли (стрелки). C) представитель меланомы выживаемость без кривая сравнения опухолей, экспрессирующих онкоген SETDB1 и контроля EGFP гена (р = 9,4 × 10 -7, logrank χ 2). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
2.jpg "/>
Рисунок 2. Опухоль анализа вторжения. A) MiniCoopR-спасенных рыбок данио с спинной опухоли (стрелки) между задней границей заднего мозга и передней границе спинной плавник. Б) поперечный разрез, показывающий слой компакта (SC), весы, масштабы связанного меланоцитов (SAM) (вставка, шкалы = 50 мкм), мышцы (М) и позвоночника (SPC). Шкала бар = 200 мкм. C) На поперечном разрезе показывает неинвазивной miniCoopR-EGFP опухоли (Т) (слева) и miniCoopR-SETDB1 опухолей (справа), который вторгся через слой мышц compactuminto (M) и позвоночника. Шкала бар = 200 мкм.
Рисунок 3. Антитела окрашивания масштабе меланоцитов. A) Весы время сорвал с наркозом miniCoopR-EGFP рыбок данио. B) Неотбеленная шкале с пигментными меланоцитов и C) с беленойКейл из miniCoopR-EGFP рыбок данио. Шкала бар = 100 мкм. Неотбеленные масштабе окрашивали D) Mitfa антител и E) DAPI. Отбеленная масштабе окрашивали F) Mitfa антител и G) DAPI. Шкала бар = 40 мкм.
Рисунок 4. Трансплантация клеток меланомы. A) Uninjected Каспер рыбок данио. Шкала бар = 500 мкм. B) Подкожный трансплантации сайта (стрелка) на облученных получателя Каспер сразу после инъекции с 50.000 клеток меланомы. Шкала бар = 200 мкм. C) облученного получателя Каспер показывает опухоли приживления (стрелки) через две недели после инъекции 50000 клеток меланомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод позволяет miniCoopR экспрессии генов интерес у рыбок данио меланоцитов. Этот подход имеет преимущество в том, что геном данио mitfa действует клеточной автономно. По этой причине, меланоциты спас вектор miniCoopR наверняка содержат минигена и любого интересующего гена, к которому он физически связаны между собой. Спасено меланоцитов хорошо видны и могут быть получены на животных, которые были введены в качестве одноклеточного эмбриона. Указанные степень химеризма выбран, и животные превосходящие этого среза может быть засчитан для начала опухоли или другие характеристики. Основным преимуществом метода является то, что miniCoopR животных с достаточной химеризма могут быть легко идентифицированы и забил без необходимости получения стабильного трансгенных линий, соответствующих каждому интересующего гена испытания. Время, усилия и затраты сохраняются в количестве, пропорциональном количеству генов интерес для обследования.
Как сообщалось ранее 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Леонард I. Зон, в лаборатории которого эти методы были первоначально разработаны, Кристен Кван и конце Чи-Бин Чен подарки плазмид, использованных в работе, Джеймс и Дэвид Листер Raible за помощью антител окрашивания и Джеймс Neiswender для микроинъекции видео. Эта работа финансировалась NIH грант R00AR056899-03 в ЗАО
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
