Summary
Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-ДНК FISH).
Abstract
Флуоресцентные на месте гибридизации с использованием ДНК-зондов на 3-размерной сохранились ядер следуют 3D конфокальной микроскопии (3D ДНК FISH) представляет собой наиболее прямой путь к себе расположение генов локусов, хромосомные суб-регионов или целых территорий в отдельных клетках. Этот тип анализа дает представление о глобальной архитектуре ядра, а также поведение конкретных локусов генома и регионов в ядерном пространстве. Иммунофлюоресценции, с другой стороны, позволяет обнаружения ядерных белков (гистонов изменения, гистонов варианты и модификаторы, транскрипция машин и факторов, ядерных суб-купе и т.д.). Основной проблемой в сочетании иммунофлюоресценции и 3D ДНК рыб, с одной стороны, сохранить эпитопа обнаружены антитела, а также 3D-архитектурой ядра, а с другой стороны, чтобы позволить проникновение ДНК-зонда для обнаружения генных локусов или хромосомных территорий 1-5. Здесь мы предлагаем протокол, который сочетает в себе визуализации хроматина модификации с геномных локусов в 3D сохранил ядер.
Introduction
Эпигенетических спусковые механизмы создания и наследования развития и типа клеток конкретной транскрипционных профилей. На одном уровне это связано с модуляцией упаковки хроматина, который определяет активный или тихий регионов генома. В более широком масштабе, глобальной 3D организации генома и ядерных архитектуры также играть роль в контроле транскрипции моделей. Таким образом, рассечение этих эпигеномном функций имеет важное значение для полного понимания того, как гены регулируются 6-11.
Комбинированные иммунофлюоресценции и 3D ДНК FISH предоставляет уникальную возможность дополнить молекулярные и биохимические анализы по оценке специфических взаимодействий / ассоциации последовательностей ДНК и / или белков в ядре. Кроме того, в то время как по всему геному высокой пропускной методы, такие как иммунопреципитации хроматина (ChIP-далее) или хромосомы захвата конформации в сочетании с глубоким секвенирования (4C-след, 5C, Привет-C) обеспечивают глобальную DATна клеточных популяций 12, иммунофлюоресценции / ДНК FISH методы анализа позволяют на одном уровне клетки.
Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-FISH). Преимущество этого протокола является комбинированным визуализации ДНК и сохранению белковых структур. Наш опыт в этой области позволил нам усовершенствовать и упростить существующие протоколы. Хотя мы использовали этот протокол для обнаружения ДНК двухцепочечной перерывы в лимфоциты проходят рекомбинации, этот метод может быть применен к другим белков и других клеточных типов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ДНК-зонда маркировки с флуорофоры: Nick перевода (~ 6 часов)
- Чистая BAC ДНК (подготовлен макси-подготовки) или плазмиды или ПЦР-продукты, все ресуспендировали в H 2 O, может быть использована для маркировки. Отметим, что для надежного сигнала FISH, зонды должны занимать не менее 10 кб.
- Инкубируйте ДНК в РНК в течение 30 мин при 37 ° C (все реагенты приведены в таблице 1).
- Инкубируйте реакции ник-трансляцией в течение 2 часов при 16 ° C (см. таблицы 2 и 3). Альтернативные методы прямой маркировки могут быть использованы (Пример: FISH Tag, Invitrogen).
- Деактивировать реакции в течение одного часа при температуре -80 ° C или в течение ночи при температуре -20 ° C.
- Определить размер зонда на 2% агарозном геле. Мазка должна быть от 100 до 1000 б.п., при этом большинство примерно в 300-500 б.п. (Обратите внимание, что мазок Cy5-зондов не видно). Если ДНК не переваривается достаточно, более ДНК-Pol I иДНКазы I могут быть добавлены к реакции и инкубировали в течение еще двух часов при 16 ° C.
- Очищают зондов на 0,025 мм фильтры в двух стаканах литр заполнены H 2 0 в течение двух часов в темноте.
- Добавить блокирующих факторов на зонды следующим образом: 10 мкг Cot-1 ДНК, 10 мкг ДНК Hybloc и 100 мкг спермы лосося в течение 10 мкг ДНК-зондов. Магазин ДНК-зондов при температуре -20 ° C.
2. Датчик осадков / Денатурация / Pre-отжига (3-4 часа)
- Между 0,3 мкг и 1 мкг ДНК-зонда используется на покровное. Mix зондов с 0,1 объема 3M NaAc (рН 5,2) и 2,5 объема 100% этанола, инкубировать в течение одного часа при температуре -80 ° C или в течение ночи при температуре -20 ° C и спином вниз при 13000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Обратите внимание, что количество ДНК-зонда может быть скорректирована в зависимости от качества ДНК и ядерной области гибридизации. Альтернативные методы прямой маркировки может допускать использование сокращения количествазондом. Для обнаружения нескольких ДНК FISH сигналы на одном слайде, различные зонды могут быть спровоцированы вместе (кроме зондов, которые не должны быть предварительно отожженная, как повторяющиеся последовательности). Зонды для нескольких экспериментов, выполненных в то же время также может быть спровоцирован вместе. Гранулы должны быть слегка окрашены в соответствии с флуорофоров используется (если небольшое количество зондов осаждают, гранулы могут быть не видны).
- Гранулы сухого и ресуспендируют них в 15 мкл буфера для гибридизации (см. таблицу 4) на покровное при встряхивании (с использованием Eppendorf Thermomixer) в темноте при 37-45 ° C (в течение примерно 20 мин).
- Денатурировать зонды в течение 5 мин при 75-95 ° C.
- Предварительно отжига зондов при 37 ° С в течение 30-60 мин. Продолжительность предварительного отжига может быть скорректирована в зависимости от сложности и качества зондов.
- Применение зондов для покровные для ночлега гибридизации (см. раздел 3).
3. 3-Мерной ДНК FISH - First Day (~ 3 часа)
- Non-прилипшие клетки сконцентрированы в небольшом объеме 1x PBS (~ 2x10 5 клеток в 5-10 мкл 1x PBS в покровным) и упал в центре поли-L-лизин покрытием покровное. Приверженец клетки должны быть выращены на покровных по крайней мере, 24 часа в сутки (~ 70% слияния) (покровные могут быть покрыты 0,1% желатина). Площадь 18x18 до 24-24 мм покровные находятся в 6-луночных планшетах, и на протяжении всего протокола, два мл каждого раствора используется на лунку (в качестве альтернативы круглый 1,5 мм покровные могут быть помещены в пластинах 12/24-well).
- Исправить клеток в 2% параформальдегида / 1x PBS, рН 7-7.4, в течение 10 минут при комнатной температуре (4% PFA акции могут быть аликвоты, хранят при температуре -20 ° C). Параформальдегид можно приобрести в растворе (16%), или 4% растворы могут быть получены из порошка / гранул. Параформальдегид порошок растворяют в 1x PBS при> 60 ° C (рН может быть увеличена до 8-9 для облегчения растворения), охлажденные вниз на льду, установитеред до рН 7-7.4, фильтруют аликвоты в соколов и хранятся в течение недели при температуре -20 ° C.
- После трех полосканий в 1x PBS, permeabilize клеток в ледяной холодной 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS в течение 5 мин на льду. Длина проницаемости может быть скорректирована в зависимости от типа клеток NB:. Если ДНК рыбы в сочетании с иммунофлюоресценции, иммуноокрашивания должны быть выполнены на этом этапе (см. раздел 4).
- После трех полосканий в 1x PBS, инкубировать клетки с 0,1 мкг / мкл РНКазы в 1x PBS в течение одного часа при 37 ° C. Покровные размещены ячейки стороной вниз на капле 100 мкл раствора на парафильмом или слайд во влажной камере. Покровные затем осторожно удалить пинцетом. Если сопротивление встречается, покровные должна быть залита 1x PBS для того, чтобы избежать повреждения клеток.
- После трех полосканий в 1x PBS, permeabilize клеток в ледяной холодной 0,7% Triton-X-100 / 0,1 М HCl в течение 10 минут на льду.
- После трех полосканий яп 1x PBS, денатурация клеток в 1,9 M HCl в течение 30 мин при комнатной температуре. С другой стороны, клетки могут быть денатурировали в 50% формамида / 2x SSC при 75-80 ° С в течение 30 мин. Обратите внимание, что гибридизация длины (и температуры) могут быть оптимизированы в зависимости от типа клеток.
- После трех полосканий в ледяной 1x PBS, скрещивать клетки с датчиками в течение ночи при 37 ° C в темной и влажной камере. Покровные размещены ячейки стороной вниз на каплю 15 мкл зонда на слайде, и запечатаны с резиновым клеем.
4. 3-мерные иммуно-FISH - First Day (~ 6-7 часов)
- Для комбинированной иммунофлюоресценции / ДНК FISH, иммуно-окрашивания следует проводить после пермеабилизации в 0,4% Triton-X-100 (шаг 3,3).
- Инкубировать клетки в блокирующем растворе в течение 30 минут при комнатной температуре (2,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 10% нормальной козьей сывороткой, 0,1% Твин-20). Блокирующий раствор фильтруют, аликвоты в 1,5 Eppendorfs мл и хранят при тonths при температуре -20 ° C.
- Инкубируйте клетки с первичными антителами, выдвигаемые против белка или модификация гистонов интерес разводили в блокирующем растворе, в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере. Здесь мы покажем на примере антитело против фосфорилированного серина-139 из H2AX (γ-H2AX, Millipore, см. таблицу 5 для подробной информации). Покровные размещены ячейки стороной вниз на капле 100 мкл раствора на парафильмом или слайд во влажной камере. Покровные затем осторожно удалить пинцетом (залита 1x PBS при необходимости). Отметим, что разведение и инкубации длина может быть скорректирована в зависимости от качества антител и клеточных типов.
- Вымойте клеток в 0,2% BSA / 0,1% Твин-20 / 1x PBS, три раза по 5 минут при комнатной температуре при встряхивании.
- Инкубируйте клетки с соответствующим флуорофор-сопряженных вторичные антитела, разведенного в блокировании решения в течение одного часа при комнатной температуре в темном и влажном камеры. Здесь мы покажем пример обнаружения свторичных козьего анти-мышиных антител (Alexa Fluor 488 или 555, Invitrogen; см. Таблицу 5 для подробностей). Гаптен-сопряженных вторичными антителами (биотин, дигоксигенин, и т.д.) также могут быть использованы. В этом случае дополнительный шаг для соответствующего обнаружения (стрептавидин, анти-копать, и т.д.) могут быть выполнены либо до, либо после того, как в течение ночи ДНК-FISH-гибридизации.
- Промыть клеток в 0,1% Твин-20 / 1x PBS, три раза по 5 минут при комнатной температуре при встряхивании в темноте.
- После исправления клеток в 2% параформальдегида / 1x PBS в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
- Продолжить ДНК FISH, как указано выше от инкубации в РНКазы (шаг 3,4).
5. 3-мерной ДНК FISH / иммуно-FISH - второй день (~ 2 часа)
- Осторожно снимите резиновый клей, наводнения покровные с 2x SSC, осторожно удалить пинцетом и поместить их в лунки, содержащие моющего раствора.
- Вымойте клетки в 2х SSC в течение 30 мин при 37 ° С в темноте при встряхивании.
- Вымойте клетки в 2х SSC в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте при встряхивании.
- Вымойте клетки в 1x SSC в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте при встряхивании Обратите внимание, что в случае денатурации формамидом, моет должна быть заменена следующим:. 3 стирок в 50% формамида / 2x SSC и 3 стирок в 2х SSC, 5 мин каждый, при 37 ° C.
- Установите клеток в продлит Золотой монтажа среде, содержащей 1,5 мкг / мл DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндола) для counterstaining от общего числа ДНК. Покровные размещены ячейки стороной вниз на капли 10-15 мкл монтаж среды на слайде и опечатаны с лаком для ногтей. Слайды хранятся в течение месяца при температуре -20 ° C.
6. 3D-микроскопии и анализа
- 3D-изображения могут быть получены с различными системами микроскопом. В наших экспериментах, оптических секций, разделенных 0,3 мкм собираются на Leica SP5 AOBS конфокальной системы (акустооптического светоделитель). Обратите внимание, что расстояние между Opticaл самолеты могут быть скорректированы в зависимости от типа анализа.
- 3D-стека изображение может быть проанализированы с помощью различного программного обеспечения и инструментов. Мы используем программное обеспечение изображение J для оценки измерения расстояния между локусами интерес и для анализа различных типов ассоциаций локусов интерес с суб-ядерный отделения или белки.
- Все статистические анализы проводятся для сравнения двух (или более) различных биологических условий с попарно оценки (ы) значение: сравнение между различными типами клеток или этапов, сравнение между различными локусами интерес. Во всех статистических тестов, P-значение ≤ 5.00E-2 (= 0,05), они считаются значимыми (1,00-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * значительным; 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * очень значительным, р <1,00-3 *** весьма значительным).
Статистический анализ всей распределения расстояний между двумя аллелями. Сначала мы сonstruct кумулятивные кривые распределения частот во всем диапазоне измеряемых расстояний между двумя alleles.To оценки значимости различий в распределении эмпирических между аллельных расстояния мы используем непараметрический двух выборок Колмогорова-Смирнова (KS) Тест 13,14.
Статистический анализ тесную связь (то есть спаривания) двух аллелей использованием оптимальное расстояние отключения. Чтобы определить круг наиболее надежные различия в расстояниях между двумя аллелями или локусов, мы используем серию из двух хвост точный критерий Фишера 15 с. А именно, в каждом измеренное расстояние мы проверить, является ли одно условие существенно широко представлены на более коротких расстояниях между двумя образцами. Минимум в распределении P-значения указывает диапазон расстояний, которые должны рассматриваться в качестве отсечения для тесную связь (то есть спаривания) из двух аллелей. Впоследствии два хвоста точный критерий Фишера используется тØ оценить значение спаривания двух аллелей определены пороговые значения 15. Многочисленные исправления тестирование применяется для учета общего количества тестов Фишера выполняется 16.
Статистический анализ ассоциации локуса интерес с суб-ядерный отделения или белки. Двух хвост Fisher-точный тест используется для анализа значимости ассоциации локуса интерес с различными отсеками или белков 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ДНК и иммуно-FISH используются в лаборатории Скок для изучения изменений в ядерной организации, связанные с процессом V (D) J рекомбинации локуса рецептора антигена в В-и Т-лимфоцитов развития. Описанные выше методы позволяют я) мера расстояния между двумя концами локус (сжатие) II) для измерения расстояний между аллелями или локусов (спаривания), в) анализ повреждений ДНК, происходящие в локусах, IV) оценить расположение аллелей и локусов относительно ядерной суб-купе (репрессивной прицентромерного гетерохроматина в нашем исследовании), и V) оценить связь ядерных белков на аллелей и локусов (Ассоциация фосфорилированного гистона γ-H2AX в нашем исследовании). В частности, мы проанализировали роль локуса динамика в регуляции V (D) J рекомбинации локуса иммуноглобулина в развивающихся В-клеток 17-30, а в регулировании коммитирование между CD4 + и CD8 + Тклетки 14. Мы также оценили повреждение ДНК в одном из Т-клеточного рецептора локус, TCRA / д, в развивающихся T клетки, несущие мутантный форме рекомбиназой белка RAG2 31.
Рисунок 1. Анализ расстояний между двумя аллелями или локусов. (A) конфокальной вкладки с представителем непарных (справа) и парные (слева) аллелей в отдельных ядер. Зонд ДНК FISH был создан один из BAC (~ 200 кб) охватывает локус интерес. Расстояния между аллелями были измерены между центром массы каждого сигнала BAC в 3D стеки изображений. Пунктирные круги очертить ядро формы. Шкала баров = 1 мкм. (B) Кумулятивные кривые распределения частот, показывающая весь диапазон расстояний между двумя аллельс, измеренное в двух различных биологических условий (дикого типа против мутантов). Непараметрические два образца KS тест используется для оценки значимости различий между двумя распределениями. Диапазон самые надежные различия в том, аллельные расстояния оценивалась с помощью серии из двух хвост Фишера тесты (синие точки). Самый надежный P-значения (выше точки) были найдены расстояния около 1 мкм. Таким образом отсечения для тесную связь (то есть спаривания) из двух аллелей была создана в 1 мкм. (C) Кумулятивные кривые частоты показывающие расстояние между двумя аллелями от 0 до 1,5 мкм в двух различных биологических условий. Значение спаривания двух аллелей оценивали с помощью двух хвост точный критерий Фишера для отсечения на 1 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Анализ расположения локуса по отношению к суб-ядерные отсеки. В наших исследованиях мы анализируем отношения между нашими локусов интерес и репрессивные суб-ядерный отсек образован прицентромерного гетерохроматина (PCH) 32. Аллелей считаются расположенный на PCH, когда сигнал алкоголя в крови для локуса интерес соседних или перекрывающихся с γ-спутниковый сигнал, который гибридизуется с PCH (не пиксель в между краями БАК и γ-спутниковых сигналов ДНК FISH). Конфокальная разделов представитель расположение аллелей TCRA по отношению к PCH: (Top) не аллели расположены на PCH, (Middle) один аллель на PCH, (внизу) два аллеля на PCH. Locus в красном, и γ-спутника в белом. Желтые стрелки показывают аллелей находится на PCH. Пунктирные круги очертить ядро формы. Шкала бар = 1 мкм.
Рисунок 3. Анализ ассоциации ядерных белков и модификации гистонов на локус. (A) В наших исследованиях мы анализируем отношения между нашими локусов интерес и фосфорилированной форме гистона H2AX (γ-H2AX), а считывание ДНК двойная -мель перерывами 33. Конфокальная разделах приведены примеры не γ-H2AX ассоциации (Top) или объединение на одной TCRA аллеля (внизу) в отдельных ядер. Аллели были определены как связанные с γ-H2AX, если BAC сигналов и иммунофлюоресценции очаги были по крайней мере частично перекрываются (по крайней мере один пиксель колокализации). Locus показано в красном и γ-H2AX в белый цвет. Пунктирные круги план пucleus формы. Шкала бар = 1 мкм. Именно отметить, что колокализации анализа сигнала BAC с PCH или γ-H2AX очагов осуществляется вручную с помощью программы изображения J без автоматизированной порог. (B) Потеря части γ-H2AX сигнал после денатурации одной из главных технических вопросов, поднятых этим иммуно-FISH ДНК протокол. Здесь мы покажем пример иммунофлюоресценции до (вверху) и после (внизу) HCl на основе денатурации лечения (Формамид обращения дали сходные результаты (не показано)). Хотя сигнал был слабым, основные особенности окраски, в частности, число очагов, оставшиеся после лечения. Использование Leica SP5 конфокальной, установки для лазерной 561 до и после денатурации были следующими: 35% мощности / Smart усиления на 730V, а 45% мощности / Smart усиления на 750, соответственно. Кроме того, мы показываем здесь пример иммунофлуоресцентного окрашивания для другого гистонов мodification, H3K27me3 (правая панель) показывает, что этот протокол может быть применен к другим гистонов марок, как ранее была опубликована 1,3. γ-H2AX показано в желтый и H3K27me3 в красный цвет. Пунктирные круги очертить ядро формы. Шкала бар = 2 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
| Название Реагенты / Материал | Компания | Количество Catalogm | Комментарии |
| H 2 O | Рыбак | # BP2470 | |
| РНКазы | Сигма | # R4642 | |
| дНТФ | Сигма | # DNTP100 | |
| Alexa дУТФ | Invitrogen | #C11397-С-11401 | |
| Cy3 или Cy5 дУТФ | Рыбак | № 45-001-ххх | |
| ДНКазы I | Roche | # 04536282001 | |
| ДНК-Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 мкм фильтры | Millipore | # VSWP02500 | |
| Детская кроватка-1 ДНК 1 мг / мл | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc ДНК 1 мг / мл | Прикладной генетики | # MHB | |
| Лосось спермы | Сигма | # D1626 | порошок для ресуспендировали в дозе 10 мг / мл в H 2 O |
| NaAc (ацетат натрия, рН 5,2, буферный раствор) | Сигма | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Молекулярная биология класс) | Рыбак | # 525 | |
| Поливинилпирролидон (Mol Biol класс) | Рыбак | # BP431 | |
| Декстран сульфат порошок | Сигма | # D8906 | |
| ГНПП (Saline-фосфат натрия, EDTA) 20x решения | Рыбак | # BP1328 | |
| Формамид | Рыбак | # BP227 | |
| Покровные | Рыбак | № 12-548-B | |
| Слайды | Рыбак | # 12-550 | |
| 6-луночные планшеты | Рыбак | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Рыбак | # MT-46-013-CM | |
| Сигма | # P8920 | ||
| Параформальдегид, гранулы, 95% | Сигма | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol класса | Сигма | # T8787 | |
| BSA (бычий сывороточный альбумин) доля V | Рыбак | # BP 1600 | |
| Нормальной козьей сывороткой | Vector Labs | # S-1000 | |
| Твин-20, Mol Biol класса | Сигма | # P9416 | |
| SSC (солевой раствор цитрата натрия) 20x решения | Рыбак | # BP1325 | |
| Продлить Золотой реагента antifade | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-диамидино-2-фенилиндол) | Сигма | # D9542 | |
| Лучший тест один слой резинового клея | Магазины Искусство или канцелярских товаров |
Таблица 1. Специфических реагентов и малого оборудования.
| NT с дУТФ в сочетании с Alexa-флуорофоров | Количество | Конечная концентрация |
| 10 мкг ДНК | X мкл | |
| РНКазы - 0,17 мкг / мкл | 10 мкл | |
| H 2 O | Заполнить до 260 мкл | |
| ВСЕГО - 30 мин при 37 ° C | 260 мкл | |
| 10-кратный буфер NT | 50 мкл | 1x |
| 100 мМ и бытьта;-меркаптоэтанола | 50 мкл | 10 мкМ |
| дНТФ смеси | 40 мкл | 40 мкМ каждого дНТФ |
| 0,1 ммоль дТТФ | 50 мкл | 10 мкМ |
| 1 мМ Alexa дУТФ | 12 мкл | 30 мкМ |
| ДНКазой I (рабочий раствор, см. таблицу ниже) | 30 мкл | |
| ДНК-Pol I | 7,5 мкл | 15 Ед / мл |
| Итого - 2 часа при 16 ° C | 500 мкл | |
| NT с дУТФ в сочетании с Cy3 или Cy5 | Количество | Конечная концентрация |
| 10 мкг ДНК | X мкл | |
| РНКазы - 0,17 мкг / мкл | 10 мкл | |
| H 2 O | Заполнить до 300 мкл | |
| ВСЕГО - 30 мин при 37 ° C | 300 мкл | |
| 10-кратный буфер NT | 50 мкл | 1x |
| 100 мМ β-меркаптоэтанол | 50 мкл | 10 мкМ |
| дНТФ смеси | 50 мкл | 50 мкМ каждого дНТФ |
| 1 мМ Cy3 или Cy5-дУТФ | 12 мкл | 30 мкМ |
| ДНКазы I | ~ 30 мкл | ~ 1,2 ед / мкл |
| ДНК-Pol I | 7,5 мкл | 15 Ед / мл |
| Итого - 2 часа при 16 ° C | 500 мкл |
Таблица 2. РНКазы лечение и Ник перевод для 10 мкг ДНК.
| Решения | Акции | |
| РНКазы | Рабочий раствор: 0,17 мкг / мкл | Сделано свежие |
| 10-кратный буфер NT: | 0,5 М Трис-HCl, рН 8, 50 мМ MgCl 2, 0,5 мг / мл BSA | 1,5 мл труб при температуре -20 ° C. |
| дНТФ смеси: | дАТФ, дЦТФ, и дГТФ: 0,5 мм каждая в H 2 O | 1,5 мл пробирках при -20 ° C |
| ДНКазы I: | Со решение: восстановленные на 20000 ЕД / мл в 20 мМ Трис, рН 7.5/50% glycerol/50 мМ NaCl | 0,5 мл пробирках при -20 ° C |
| Рабочий раствор: каждая новая партия аз раствора я должна быть проверена на различных разведениях (10 Ед / мл, 20 ЕД / мл и 40 ЕД / мл в H 2 O). Разбавления давая ДНК мазка от 100 до 1000 б.п. (см.шаг 5) следует использовать в качестве рабочего раствора. | Сделано свежие |
Таблица 3. Решения для РНКазы лечение и Ник перевода.
| Гибридизации буфер | Решения | Акции | |
| 10% | 50x Денхардта решение: | 1 г Ficoll 400, 1 г поливинилпирролидона и 100 мл H 2 0 - фильтрация | 50 мл сокола при -20 ° C |
| 40% | 25% сульфат декстрана: | Декстран сульфат порошок растворяют в 12,5 х ГНПП на 37-65 ° C | 50 мл сокола при -20 ° C |
| 50% | Формамид | Бутылки при +4 ° C | |
| Порции в 1,5 мл Eppendorfs хранятся при температуре -20 &град; C | |||
Таблица 4. Гибридизация буфера.
| Антитела | Поставщик | Номер в каталоге | Разбавление |
| γ-H2AX - фосфо H2A.X, клон JBW301, мышиные моноклональные | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, клон, кроличьих поликлональных | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-мышь | Invitrogen | № А-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 антимышиного | Invitrogen | #-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 козы против кролика | Invitrogen | № А-11008 | 1/500 | </ TR>
Таблица 5. Первичные и вторичные антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные выше методы были использованы в нашей лаборатории для анализа регулирования V (D) J рекомбинации иммуноглобулинов и TCRA / д локусов в развивающихся лимфоциты 30,31. Мы уверены, что эта техника может быть адаптирована для обнаружения различных ядерных белков, ядерных отсеков и локусов, в разных клеточных типов. Изменения протокола может быть необходимо, и в этом случае основные шаги, чтобы сосредоточиться на следующие. Во-первых, длина проницаемости могут быть скорректированы в зависимости от типа клеток. Второй длины первичных инкубации антител также может быть скорректирована в зависимости от качества антител и обилием белок (например, в некоторых случаях, инкубационный может быть выполнено в течение ночи при 4 ° C). Важно отметить, что стадия денатурации может быть адаптирована и HCl лечение может быть заменено денатурации в Формамид 3,4,34 и NaOH для ДНК FISH 20. Также повторитеред циклов замораживания-оттаивания жидкого азота может быть применена к клеткам после фиксации / проницаемости для ДНК FISH только 4,34. Наконец, в то время как некоторые модификации гистонов, РНК-полимераза II и сопутствующими факторами были успешно обнаружены с помощью этого метода 30,35, иммуно-окрашивания на другие ядерные белки могут быть выполнены после гибридизации ДНК FISH 4.
3D анализа изображений может включать использование различных типов микроскопов, в том числе широкого поля эпифлуоресцентной (в сочетании с деконволюция) и конфокальной лазерной микроскопии 36. Выбор изображений метода будет зависеть от требуемого разрешения, количество флуорофоры, глубина образцов и качество ДНК и белка сигналов. Разработка новых высоком разрешении микроскопы открывает совершенно новые возможности в точной визуализации ядерной и клеточные процессы, 37-39. Кроме того, новые методы generatioп заказных зондов, которые не содержат повторяющиеся последовательности позволяют чистой выявления геномных областей, с 15-кб конкретного локуса, в комплексе бассейнов экзонов 40. Это повышает точность и чувствительность микроскопии высокого разрешения в отслеживании динамики ядерных процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов Скок лаборатории, особенно Сюзанна Хьюитт, для обсуждения и комментариев. Эта работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS является лейкемия и лимфома ученого общества. JC является членом Irvington Института исследований института рака. MM поддерживается Национального научного фонда грант интегративной последипломного образования и науки Стажировка (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
