Summary
Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.
Abstract
3D konfokal mikroskopi ardından 3 boyutlu korunmuş çekirdekleri üzerinde DNA problar kullanılarak floresan in situ hibridizasyon (3D DNA FISH) bireysel hücrelerin alt bölgeler kromozomal gen lokuslarının yeri veya tüm ülkelerle görselleştirmek için en doğru yolu gösterir. Bu tip analiz çekirdeğin küresel mimari gibi nükleer boşluk içinde belirli lokus ve genomik bölgenin davranışının fikir verir. Immunofluorescence, diğer taraftan, nükleer proteinlerin tespiti (modifiye edilmiş histon, histon türevleri ve değiştiriciler, transkripsiyon faktörleri ve makine, nükleer alt-bölme, vb) izin verir. Immünofloresan ve 3B DNA FISH birleştirme içinde önemli bir sorun çekirdeğin 3D mimarisi yanı sıra antikor tarafından tespit edilen epitopu korumak için bir taraftan, ve diğer taraftan, DNA prob nüfuz tespit etmesi için gen lokus veya kromozom bölgeleri 1-5. Burada 3D korunmuş çekirdeklerinde genomik lokus ile kromatin modifikasyonları görselleştirme birleştiren bir protokol sağlar.
Introduction
Epigenetik mekanizmalar tetik kuruluş ve gelişim ve hücre tipi özel transkripsiyonel profilleri kalıtım. Bir düzeyde bu aktif veya sessiz genomik bölgelerde tanımlar kromatin paketlenmesi modülasyonu içerir. Daha büyük ölçekte, genom ve nükleer mimarisinin küresel 3D organizasyonu da transkripsiyonel desen kontrolünde bir rol oynamaktadır. Böylece, bu epigenomic özelliklerin diseksiyonu genler 6-11 düzenlenir nasıl tam bir anlayış için önemlidir.
Kombine immünofloresan ve 3D DNA FISH spesifik etkileşimler / çekirdeğin içinde DNA dizileri ve / veya protein dernekler değerlendirerek, biyokimyasal ve moleküler analizler tamamlamak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bunun yanında, bu tür kromatin immünopresipitasyon (ChIP-seq) veya derin dizileme ile birleştiğinde kromozom yakalama konformasyon olarak genom yüksek verimlilik teknikleri (4C-seq, 5C, Hi-C) küresel dat sağlamakhücre popülasyonlarının 12 üzerinde, immünofloresan / DNA FISH teknikleri tek hücre düzeyinde analiz sağlar.
Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar. Bu protokolün avantaj DNA ve protein yapılarının korunması kombine görselleştirme olduğunu. Bu alanda tecrübemiz mevcut protokoller geliştirmek ve kolaylaştırmak için bize sağladı. Bu rekombinasyon geçiren lenfosit çift-sarmallı DNA mola tespit etmek için bu protokol kullanılmıştır, ancak bu yöntem, diğer proteinlere ve diğer hücre türleri uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fluorophores DNA Prob Etiketleme: Nick Çeviri (~ 6 saat)
- Temizlik BAC DNA (Maxi-prep göre hazırlanmış) ve plazmit veya PCR ürünleri, H2O içinde tekrar süspanse edilir, tüm etiketleme için de kullanılabilir. Not sağlam bir FISH sinyal için, sondalar, en az 10 kb kapsar gerektiğini.
- RNaz DNA inkübe bir 37 30 dakika ° C (Bütün çözeltiler Tablo 1'de listelenmiştir).
- 16. az 2 saat süreyle nick translation reaksiyon inkübe ° C (Tablo 2 ve 3). Doğrudan etiketleme Alternatif yöntemler (: BALIK Etiket, Invitrogen Örnek) kullanılabilir.
- -80 Az bir saat süreyle reaksiyon inaktive -20 ° C'de ° C ya da gece boyunca
- % 2'lik agaroz jel üzerinde prob boyutu belirleyin. Smear yaklaşık 300-500 bp (Cy5-probların smear görünmez olduğunu unutmayın) de çoğunluğu ile, 100 ve 1000 bp arasında olmalıdır. DNA yeteri kadar sindirilmeyen, daha fazla DNA Pol I veDNaz I reaksiyona eklenmiş, ve 16 ° C de iki saat daha inkübe edilebilir
- Karanlıkta iki saat için H 2 0 dolu iki litrelik bardak 0.025 mm filtrelerde probları arındırın.
- Aşağıdaki gibi probları ile bloke etme faktörleri ekleyin: Manşon-1 DNA'sının 10 ug, Hybloc DNA ve 10 ug DNA probları 10 ug için somon sperm 100 ug. -20 ° C'de saklayın DNA probları
2. Prob Yağış / Denatürasyon / Ön tavlama (3-4 saat)
- 0.3 ug ve DNA probu 1 mg arasında lamel başına kullanılır. 3M NAAC (pH 5.2) ve% 100 etanol, 2.5 hacim, 0.1 hacim ile karıştırın sondalar, -80 az bir saat süreyle inkübe ° C ya da gece boyunca -20 ° C'de ve 4 13,000 rpm'de aşağı dönüş ° C'de 30 dakika süre ile. DNA probu miktarı DNA kalitesi ve hibridizasyon nükleer bölgesine bağlı olarak ayarlanabilir dikkat ediniz. Doğrudan etiketleme Alternatif yöntemler azaltılmış miktarda kullanımına izin verebilirprob. Bir slayt üzerinde birden fazla DNA FISH sinyal tespiti için, farklı prob (tekrar dizileri gibi, ön-tavlanmış olmamalıdır problar hariç) birlikte çökeltilebilir. Aynı zamanda yapılmış olan deneyler için sondalar da bir arada çökeltilebilir. Granüller hafifçe (problar küçük miktarlarda çöktürülür ise, topak görünür olmayan) ikinci floroforlar göre renkli olmalıdır.
- Kuru granül ve 37-45 karanlıkta (Eppendorf bir termomikser kullanılarak) sallama ile lamel başı (bkz. Tablo 4) 15 ul hibridizasyon tamponu içinde tekrar süspansiyon onları ° C (yaklaşık 20 dakika için).
- 75-95 az 5 dakika boyunca denatüre probları ° C.
- 30-60 dakika boyunca 37 ° C de problar Ön tavlama. Ön tavlama uzunluğu probların karmaşıklığı ve kalitesine bağlı olarak ayarlanabilir.
- Gecede hibridizasyon için lamelleri (bakınız Bölüm 3) için sondalar uygulayın.
3. 3Boyutlu DNA FISH - İlk Gün (~ 3 saat)
- Sigara yapışık hücrelere 1x PBS (lamel başına 5-10 ul 1x PBS ~ 2x10 5 hücre) küçük bir hacimde yoğunlaşmış ve bir poli-L-lisin kaplı lamel ortasına düştü. Bağlanan hücreler, en az 24 saat (~% 70 kesişme noktası) (lamelleri% 0.1 jelatin ile kaplanmış olabilir) lamelleri üzerinde kültive edilmesi gerekmektedir. 18x18 kare için 24-24 mm lamelleri 6 oyuklu plakalar yerleştirilir, ve protokol boyunca, her bir çözelti, iki ml (alternatif olarak yuvarlak 1.5 mm lamelleri 12/24-well plakalar içinde konulabilir) çukur başına kullanılır.
- RT (% 4 PFA stok -20 ° C'de saklanır bölünüp edilebilir) 10 dakika boyunca,% 2 paraformaldehid / 1 x PBS, pH değeri 7-7.4 de hücre düzeltildi. Paraformaldehit (% 16) çözelti halinde satın alınabilir, veya% 4 stok çözeltileri, toz / zerreciklerinin dan hazırlanabilir. Paraformaldehyde toz> 60 ° buz üzerinde C (pH çözülme kolaylaştırmak için 8-9 yükseltilebilir), soğutmalı aşağı ayarlamak az 1x PBS içinde çözülüred pH 7-7.4 için, süzüldü, şahin içinde bölünüp ve -20 ° C de hafta için saklanır
- 1 x PBS içinde üç kez durulama sonra, buz üzerinde 5 dakika boyunca buzlu-soğuk% 0.4 Triton-X-100/1 x PBS içinde hücreler geçirgenliği. Geçirgenliği uzunluğu hücre tipine bağlı olarak ayarlanabilir Not:. DNA FISH immunofloresan ile birlikte ise, immun (bakınız Bölüm 4) bu aşamada yapılmalıdır.
- 37, bir saat boyunca 0.1 mg / 1 x PBS içinde ul RNaz A ° C'de 1x PBS içinde inkübe hücreler üç durulama sonrasında Lameller parafilm ilgili çözüm veya nemli bir odasında bir slayt 100 ul bir damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir. Lameller sonra dikkatlice forseps ile çıkarılır. Herhangi bir direnç karşılaşılırsa, lamelleri hücrelere hasar görmesini önlemek için, 1 x PBS ile su altında olmalıdır.
- 1 x PBS içinde üç kez durulama sonra, buz üzerinde 10 dakika boyunca buzlu-soğuk% 0.7 Triton-X-100 / 0.1 M HCl içinde hücreler geçirgenliği.
- Üç durular sonra in 1 x PBS, oda sıcaklığında 30 dakika için 1.9 M HCl içinde denatüre hücreler. Seçenek olarak ise, hücreler en az 30 dakika süre ile 75-80 ° C sıcaklıkta% 50 formamid / 2 x SSC içinde denatüre edilebilir olabilir. Hibridizasyon uzunluğu (ve sıcaklık) hücre tipine bağlı olarak optimize edilebileceğini not edin.
- Buz 1x PBS içinde üç durular sonra, ° C karanlık ve nemli odasında 37 gecede probları ile hücrelerin melezleşme. Lameller bir slayt üzerinde prob 15 ul damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir ve lastik çimento ile mühürlenir.
4. 3 boyutlu Immuno-BALIK - İlk Gün (~ 6-7 saat)
- Kombine immünofloresan / DNA balık, immüno-leke% 0.4 Triton-X-100 (Basamak 3.3) içinde geçirgenliği sonra yapılmalıdır.
- Oda sıcaklığında 30 dakika (% 2.5 bovin serum albümini (BSA),% 10 normal keçi serumu,% 0.1 Tween-20) için solüsyon engelleme hücreler inkübe edin. Bloke etme çözeltisi, filtre edilmiş 1.5 ml Eppendorfs içinde bölünüp m depolanır-20 ° C'de onths
- Bir nemli oda içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca, protein ya da bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ilgi histon modifikasyonu karşı yükseltilmiş birincil antikor ile hücreler inkübe edin. Burada H2AX (; ayrıntılar için bakınız Tablo 5 γ-H2AX, Millipore) ve fosforlu serin-139 karşı bir antikor örneğini gösterir. Lameller parafilm ilgili çözüm veya nemli bir odasında bir slayt 100 ul bir damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir. Lameller sonra dikkatlice forseps (1 x PBS, gerekirse su basması) ile çıkarılır. Not seyreltme ve kuluçka süresini antikor ve hücre-tipi kalitesine bağlı olarak ayarlanabilir olabilir.
- % 0.2 BSA /% 0.1 Tween-20/1 x PBS, sallama ile oda sıcaklığında üç kez 5 dak. Yıkayın hücrelerini
- Karanlık ve nemli odasına RT az bir saat için bir çözüm engelleme seyreltilmiş uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor hücreleri inkübe edin. Burada bir algılama ile bir örneğini gösterirİkinci keçi anti-fare antikoru (Alexa Fluor 488 veya 555, Invitrogen; ayrıntılar için Tablo 5'e bakınız). Hapten-konjuge sekonder antikor (biotin, digoxigenin, vb) de kullanılabilir. Bu durumda, uygun algılama (streptavidin, anti-Dig, vs) için ilave bir adım aşırı gece DNA-FISH hibridizasyon önce ya da sonra gerçekleştirilebilir.
- % 0.1 hücreleri yıkayın Tween-20 / 1x PBS, karanlıkta sallayarak RT az üç kere 5 dk.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehid / 1 x PBS içinde post-fix hücreler.
- Yukarıda RNaz A (Adım 3.4) inkübasyon DNA BALIK devam edin.
5. 3 boyutlu DNA FISH / Immuno-BALIK - İkinci Gün (~ 2 saat)
- Dikkatlice dikkatle forseps ile çıkarın ve yıkama çözeltisi içeren kuyularda koyun, 2x SSC, sel lamelleri kauçuk çimento çıkarın.
- 37 30 dak ° sallayarak karanlıkta C 2x SSC hücreleri yıkayın.
- Sallama ile karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için 2x SSC içinde hücreleri yıkayın.
- Sallama ile karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika süre ile 1 x SSC içinde yıkayın hücrelerini formamid denatürasyon durumunda, yıkama aşağıdaki ile değiştirilmesi gerektiğini not:. 3 yıkamaya 2x SSC, 5,% 50 formamid / 2 x SSC ve 3 yıkar 37, her bir dak ° C.
- Toplam DNA counterstaining için 1.5 ug / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) ihtiva eden Altın montaj orta uzatmak hücreleri monte edin. Lameller bir slayt üzerinde orta montaj 10-15 ul damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir ve oje ile mühürlenir. Slaytlar -20 ° C'de ay tutulur
6. 3D Mikroskopi ve Analiz
- 3D görüntüler farklı mikroskop sistemleri ile elde edilebilir. Deneylerde, 0,3 mikron ile ayrılmış optik bölümleri bir Leica SP5 AOBS konfokal sistemi (Acousto-Optik Beam Splitter) üzerinde toplanır. Unutmayın optika arasındaki mesafeyil düzlemleri analiz tipine bağlı olarak ayarlanabilir.
- 3D görüntü yığınlarından farklı yazılım ve araçları kullanılarak analiz edilebilir. Biz faiz lokusların arasındaki mesafe ölçümlerini değerlendirmek ve alt nükleer bölmeleri veya proteinler ile ilgi lokusların dernek farklı analiz Image J yazılımı kullanın.
- Farklı hücre tipleri veya aşamaları arasında karşılaştırma, farklı ilgi lokusları arasında karşılaştırılması: Tüm istatistiksel analizler anlamlılık pairwise değerlendirmesi (ler) ile (veya daha fazla) farklı biyolojik koşulların ikisini karşılaştırmak için yapılmaktadır. Tüm istatistiksel testlerde, P değerleri ≤ 5.00E-2 (a = 0.05) (1.00E-2 olarak anlamlı alınır ≤ p ≤ 5.00E-2 * anlamlı; 1.00E-3 ≤ p ≤ 1.00E-2 * * çok önemli; P <1.00E-3 *** çok önemli).
Iki allel arasındaki mesafeleri tüm dağılımlarının istatistiksel analizi. Biz ilk cBiz nonparametrik iki örnekli Kolmogorov-Smirnov (KS) testi 13,14 kullanabilirsiniz ampirik inter-allelik mesafelerin dağılımları farklılıklar önemini değerlendirmek iki alleles.To arasında ölçülen uzaklıkları tüm aralığında kümülatif dağılım frekans eğrileri onstruct.
Optimal bir mesafe kesme kullanarak iki allel yakın ilişki (yani eşleştirme) istatistiksel analizi. İki allel veya lokus arasındaki mesafelerde en sağlam farklılıkların aralığını belirlemek için, biz iki kuyruklu Fisher testi 15 s bir dizi kullanın. Yani, her ölçülen mesafe bir şartla anlamlı iki örnek arasındaki kısa mesafelerde daha fazla temsil edilip biz testi. P-Değerler dağıtımında en az iki alleli yakın ilişki (yani eşleştirme) için bir cut-off olarak kabul edilmelidir mesafeleri aralığını gösterir. Ardından iki kuyruklu Fisher exact t testi kullanılırtanımlanan kesim değeri 15 iki allel eşleştirme önemini değerlendirmek o. Bu çoklu test düzeltmeler yapılmıştır 16 Fisher test toplam sayısı için hesap uygulanır.
Alt-nükleer bölmeleri veya proteinler ile ilgi odağı ilişkisi istatistiksel analizi. İki kuyruk Fisher-exact testi farklı bölmeleri veya proteinler 15 ile ilgi odağı dernek önemini analiz etmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA ve immüno-FISH B ve T lenfosit gelişimi sırasında antijen reseptörünün bir lokus, V (D) J rekombinasyon işlemi ile bağlantılı olarak nükleer organizasyon değişiklikleri çalışması için Skok laboratuvar kullanılmaktadır. Yukarıda ayrıntılı teknikleri) bize i odağının iki ucu (kasılma) arasında) mesafeleri ölçmek için ii) allel veya lokus (eşleştirme) arasındaki mesafeleri ölçmek, iii), lokus içindeki iv meydana DNA hasarı analiz etkinleştirmek allellerin yerini değerlendirmek ve alt bölümlerinde (bizim çalışmamızda baskıcı pericentromeric heterokromatin) nükleer göre, ve v loci) allelleri ve lokus (bizim çalışmamızda fosforile histon γ-H2AX derneği) nükleer proteinler arasındaki ilişkiyi değerlendirmek. Özellikle, B hücreleri 17-30 gelişmekte İmmünglobulin lokusların V (D) J rekombinasyon düzenlenmesinde lokus dinamiklerinin rolünü analiz ve CD4 arasındaki soy bağlılığı düzenlenmesinde + ve CD8 + Thücreler 14. Ayrıca, rekombinaz protein RAG2 31, bir mutant formu taşıyan T hücreleri geliştirilirken, T-hücre reseptör odağı, Tcra / d'lik bir DNA'ya hasar değerlendirildi.
Şekil 1. Iki allel veya lokus arasındaki mesafeleri Analizi. (A) bireysel çekirdeklerinde temsilcisi çiftlenmemiş (sağ) veya eşleştirilmiş (sol) allelleri gösteren Konfokal bölümleri. DNA FISH prob ilgi odağı kapsayan bir BAC (~ 200 kb) elde edildi. Allelleri arasındaki mesafeler 3D görüntü yığınlarını her BAC sinyalinin kütle merkezi arasında ölçüldü. Kesik çevreler nükleus şekilleri özetlemektedir. Ölçek bar = 1 mikron. (B) Kümülatif frekans dağılım eğrisinin iki allel arasındaki mesafeleri tüm aralığı gösterens iki farklı biyolojik şartlar (yabani tip vs mutant) ile ölçülür. Parametrik olmayan iki örnek KS deney iki dağılımı arasındaki farkın önemini değerlendirmek için kullanılmıştır. Inter-allelik mesafelerde en sağlam farklılıkların aralığı iki kuyruklu Fisher exact testleri (mavi nokta) bir dizi kullanılarak değerlendirildi. En sağlam P-değerlerinin (yüksek nokta) 1 mikron çapında mesafeler için bulunmuştur. Böylece iki alleli yakın ilişki (yani eşleştirme) için cut-off 1 mikron bünyesinde kuruldu. (C) kümülatif frekans eğrisi iki farklı biyolojik koşullarda 0-1,5 um dan iki alelin arasındaki mesafeler göstermektedir. Iki alleli eşleştirme önemi 1 mikron bir cut-off için iki kuyruklu Fisher exact testi kullanılarak değerlendirildi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Alt nükleer bölmelere göre bir lokus yerini analizi. Çalışmalarımızda bizim ilgi lokus ve pericentromeric heterokromatin (PCH) 32 tarafından oluşturulan baskıcı alt nükleer bölmesi arasındaki ilişkiyi analiz eder. İlgi odağı için BAC sinyal PCH (BAC ve γ-DNA FISH uydu sinyallerinin kenarları arasında herhangi bir piksel) ile hybridizes γ-uydu sinyal ile bitişik ya da üst üste geldiğinde Alleller olarak PCH bulunur olarak kabul edilir. Konfokal bölümleri PCH göreli Tcra allellerin yeri temsilcisi: PCH bulunan (Üst) hiçbir alleli (Orta) PCH az bir allel, (Alt) PCH iki allel. Beyaz ve γ-uydu; kırmızı Odağı. Sarı oklar PCH bulunan alleller göstermektedir. Kesik çevreler nükleus şekiller anahat. Ölçek bar = 1 mikron.
Şekil 3,. Nükleer proteinler ve lokus üzerindeki histon modifikasyonları dernek Analizi. (A) bizim çalışmalarımız sırasında DNA çift için, bizim ilgi lokus ve histon H2AX (γ-H2AX) ve fosforile formu arasındaki ilişkiyi salt üzerinden analiz telli sonları 33. Konfokal bölümlerde tek tek çekirdekleri bir Tcra alleli (Alt) üzerinde herhangi bir γ-H2AX derneği (Üst) veya dernek örneklerini göstermektedir. En azından kısmen (bir ko en az bir piksel) örtüşen sinyaller ve BAC immünofloresan odaklar olsaydı Alleller γ-H2AX ile bağlantılı olarak tanımlanmıştır. Locus beyaz ve kırmızı γ-H2AX 'de gösterilmiştir. Kesik çevreler anahat nucleus şekiller. Ölçek bar = 1 um. O PCH veya γ-H2AX odak içeren BAC sinyalin ko analiz olmadan otomatik bir eşik Image J yazılımını kullanarak gerçekleştirilir olduğunu not etmektedir. Denatürasyon sonra γ-H2AX sinyalinin bir parçası olan (B) Hasar ana teknik sorulardan biri bu immüno-DNA FISH protokolü tarafından büyütüldü. Burada önce (Üst) ve (Alt) HCl tabanlı denatürasyon tedavi (Formamid tedavi (gösterilmemiştir) benzer sonuçlar verdi) sonra immünofloresan bir örnek göstermektedir. Sinyal zayıf olmasına rağmen, boyanma ana özellikleri, özellikle odaklarının sayısında, tedaviden sonra kalır. Bir SP5 Leica konfokal kullanarak, öncesi ve denatürasyon sonrası 561 lazer için ayarları aşağıdaki vardı: 35% güç / akıllı kazanç 730V de, sırasıyla 750V az% 45 güç / akıllı kazanç. Ayrıca, başka bir histon m için immünofloresan boyama Burada bir örnek göstermekodification, daha önce yayınlanmış 1,3 edildiği gibi bu protokol, histon diğer işaretler de uygulanabilir olduğunu gösteren H3K27me3 (sağ panel). γ-H2AX kırmızı, sarı ve H3K27me3 'de gösterilmiştir. Kesik çevreler nükleus şekilleri özetlemektedir. Ölçek bar = 2 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
| Reaktif / Malzeme Adı | Şirket | Catalogm sayısı | Yorumlar |
| H2O | Balıkçı | # BP2470 | |
| RNaz A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 C-11401 | |
| Cy3 veya Cy5, dUTP | Balıkçı | # 45-001-xxx | |
| DNaz I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 mikron filtre | Millipore | # VSWP02500 | |
| Manşon-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Uygulamalı Genetik | # MHB | |
| Somon sperm | Sigma | # D1626 | toz H2O içinde 10 mg / ml 'de tekrar süspanse edilmesi |
| NAAC (Sodyum Asetat, pH 5.2, tampon çözeltisi) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Balıkçı | # 525 | |
| Polivinilpirolidon (Mol Biol grade) | Balıkçı | # BP431 | |
| Dekstran sülfat tozu | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Tuzlu-Sodyum Fosfat-EDTA) 20x çözümü | Balıkçı | # BP1328 | |
| Formamid | Balıkçı | # BP227 | |
| Lameller | Balıkçı | # 12-548-B | |
| Slaytlar | Balıkçı | # 12-550 | |
| 6-well plate | Balıkçı | # 0720080 | |
| 10x PBS, | Balıkçı | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehyde, zerreciklerinin,% 95 | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol dereceli | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraksiyon V | Balıkçı | # BP 1600 | |
| Normal keçi serumu | Vektör Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol dereceli | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Salin Sodyum Sitrat) 20x çözümü | Balıkçı | # BP1325 | |
| Altın antifade reaktifi uzatmak | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma | # D9542 | |
| En testi tek kat kauçuk çimento | Sanat veya ofis malzemeleri mağazaları |
Tablo 1. Özgül reaktifleri ve küçük ekipman.
| DUTP ile NT Alexa-floroforlar ile birleştiğinde | Miktar | Nihai Konsantrasyon |
| 10 ug DNA | X ul | |
| RNaz A - 0.17 mg / ul | 10 ul | |
| H2O | 260 ul doldurun | |
| TOPLAM - 37 ° C 'de 30 dakika | 260 ul | |
| 10x NT tampon | 50 ul | 1x |
| 100 mM & beta;-merkaptoetanol | 50 ul | 10 uM |
| dNTP karışımı | 40 ul | 40 uM her dNTP |
| 0.1 mM dTTP | 50 ul | 10 uM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 ul | 30 uM |
| DNaz I (çözüm çalışma, aşağıdaki Tabloya bakınız) | 30 ul | |
| DNA Pol I | 7.5 ul | 15 U / ml |
| TOPLAM - 16 ° C 'de 2 saat | 500 ul | |
| DUTP ile NT Cy3 veya Cy5 ile birleştiğinde | Miktar | Nihai Konsantrasyon |
| 10 ug DNA | X ul | |
| RNaz A - 0.17 mg / ul | 10 ul | |
| H2O | 300 ul doldurun | |
| TOPLAM - 37 ° C 'de 30 dakika | 300 ul | |
| 10x NT tampon | 50 ul | 1x |
| 100 mM β-merkaptoetanol | 50 ul | 10 uM |
| dNTP karışımı | 50 ul | 50 uM her dNTP |
| 1 mM Cy3-ya da Cy5-dUTP | 12 ul | 30 uM |
| DNaz I | ~ 30 ul | ~ 1.2 U / ul |
| DNA Pol I | 7.5 ul | 15 U / ml |
| TOPLAM - 16 ° C 'de 2 saat | 500 ul |
Tablo 2. RNaz 10 mikrogram DNA için bir tedavi ve Nick yaptı.
| Çözümler | Stoklar | |
| RNaz A | 0.17 mikrogram / ul: çözüm Çalışma | Taze yapılmış |
| 10x NT tamponu: | 0.5 M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgCl2, 0.5 mg / ml BSA | -20 ° C'de 1.5 ml tüpler |
| dNTP karışımı: | dATP, dCTP, dGTP ve: 0.5mM H2O içinde her bir | -20 ° C'de 1.5 ml tüpler |
| DNaz I: | Stok çözeltisi: 20 mM Tris pH% 7.5/50 glycerol/50 mM NaCl içinde 20.000 U / ml 'de sulandırılmış | -20 ° C'de 0.5 ml tüpler |
| Çözüm Çalışma: DNaz I stok solüsyonu Her yeni toplu (10 U / ml, H 2 O 20 U / ml ve 40 U / ml) farklı dilüsyonlarda test edilmelidir. 100 ve 1000 bp (bkz. arasında bir DNA smear veren seyreltmeAdım 5) çalışma çözeltisi olarak kullanılır. | Taze yapılmış |
Tablo 3. RNaz A tedavisi ve Nick Çeviri Çözümleri.
| Hibridizasyon tamponu | Çözümler | Stoklar | |
| % 10 | 50x Denhardt çözümü: | 1 400 g Ficoll, 1 g polivinilpirrolidon ve 100 mL H 2 0 - Filtrelenmiş | -20 ° C'de 50 ml Falcon |
| % 40 | 25% Dekstran Sülfat: | Dekstran sülfat toz 37-65 az 12,5 X SSPE içinde çözülmüş ° C | -20 ° C'de 50 ml Falcon |
| 50% | Formamid | +4 ° C'de şişeler | |
| 1.5 ml Eppendorfs içinde alikotlar -20 & saklanırdeg; C | |||
Tablo 4. Hibridizasyon tamponu.
| Antikorlar | Satıcı | Katalog numarası | Seyreltme |
| γ-H2AX - monoklonal fosfo H2A.X, klon JBW301, fare | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, klon, tavşan poliklonal | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-fare | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-fare | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tablo 5. Birincil ve ikincil antikorlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda ayrıntılı teknikler lenfositler 30,31 geliştirme İmmunoglobulin ve Tcra / d loci V (D) J rekombinasyon düzenleme analiz etmek için, laboratuar kullanılmıştır. Biz bu tekniği farklı hücre tiplerinde çeşitli nükleer proteinler, nükleer bölmeleri ve lokus tespiti için adapte edilebilir eminiz. Protokol değişiklikler gerekli olabilir, ve bu durumda, odaklanmak için önemli adımlar aşağıdaki gibidir. İlk olarak, geçirgenliği uzunluğu hücre tipine bağlı olarak ayarlanabilir. Primer antikor inkübasyon ikinci uzunluğu da antikor kalitesi ve ilgili proteini (örneğin bazı durumlarda, inkübasyon 4 ° C de gece boyunca gerçekleştirilebilir) bolluğu göre ayarlanabilir. Önemli olarak, denatürasyon adım adapte edilebilir, ve HCl tedavi DNA FISH 20 Formamid 3,4,34 ve NaOH içinde denatürasyon ile ikame edilebilir. Ayrıca tekrarlayınsıvı azot ed donma-çözülme döngüsü tespit / tek başına 4,34 DNA FISH geçirgenliği sonra hücreler için uygulanabilir. Histon çeşitli modifikasyonlar, RNA polimeraz II ve kofaktörlerin başarılı bir şekilde bu yöntem 30,35 kullanılarak tespit edilmiş iken, son olarak, diğer nükleer proteinler için immuno-boyama DNA hibridizasyonu 4 FISH sonra gerçekleştirilebilir.
3D görüntü analizi geniş alan Epifloresans (ters evrişim ile birleştiğinde) ve konfokal lazer mikroskopisi 36 de dahil olmak üzere mikroskoplar farklı kullanımını içerebilir. Görüntüleme yönteminin tercih gereken çözünürlüğüne bağlı olacaktır, floroforlar sayısı, örnekler ve DNA ve protein sinyal kalite derinlik. Yeni yüksek çözünürlüklü mikroskoplar geliştirme nükleer ve hücresel süreçleri 37-39 arasında görsel olarak hatasız olarak tümüyle yeni bir yol açar. Generatio için Dahası, yeni tekniklern hiçbir tekrarlayan dizisini içeren ısmarlama probları ekzon 40 karmaşık havuzlarına, 15 kb özgü locus, genomik bölgelerin temiz algılama sağlar. Bu nükleer süreçlerin dinamiklerini takip yüksek çözünürlüklü mikroskopi doğruluk ve hassasiyeti arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz tartışmalar ve yorumlar için Skok laboratuar, özellikle Susannah Hewitt, üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) tarafından desteklenmektedir. JAS Bir Lösemi ve Lenfoma Derneği bilgindir. JC Kanser Araştırma Enstitüsü Irvington Enstitüsü üyesidir. MM Ulusal Bilim Vakfı Hibe Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma Staj (NSF IGERT 0333389) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
