Summary
在这里，我们描述了一个协议，用于同时检测组蛋白修饰免疫荧光法和DNA序列的DNA荧光原位杂交，然后通过的3D显微镜和分析（3D的免疫-DNA FISH）。
Abstract
荧光原位杂交DNA探针完好的三维保存的核三维激光共聚焦显微镜（3D DNA FISH）表示，最直接的方法来可视化基因位点的位置，染色体的次区域或整个地区的单个细胞。这种类型的分析提供洞察全球架构的细胞核，以及特定的基因组位点的行为和地区内的核空间。免疫荧光法，另一方面，允许核蛋白质（修饰组蛋白，组蛋白变体和改性剂，转录机械因素，核分舱室，等）的检测。免疫荧光和3D的DNA结合FISH的主要挑战是，一方面要保留的表位，以及由抗体检测的细胞核的3D架构上，另一方面，允许渗透的DNA探针来检测基因位点或染色体地区1-5。在这里，我们提供了一个协议，它结合了可视化的三维保存的核染色质修饰与基因位点在。
Introduction
表观遗传机制的发育和细胞类型特异的转录图谱的的触发建立和继承。在一个层面上，这涉及到调制的定义激活或沉默的基因组区域的染色质包装。在一个规模较大的基因组和核架构，全球3D组织也发挥了作用，在控制转录模式。因此，解剖这些表观基因的功能是必不可少的一个全面的了解基因是如何调控6-11。
结合免疫荧光和三维DNA鱼类提供了一个独特的机会，以补充分子生物学和生物化学的分析评估特定的DNA序列和/或细胞核内的蛋白质的相互作用/协会。此外，在全基因组高通量技术，如染色质免疫沉淀（ChIP-seq的）或染色体捕捉构象的深度测序（4C-seq技术，5C，加上HI-C）提供全球性的DAT一的细胞群12，免疫荧光/ DNA荧光原位杂交技术在单细胞水平上能够进行分析。
在这里，我们描述了一个协议，用于同时检测组蛋白修饰免疫荧光法和DNA序列的DNA荧光原位杂交，然后通过的3D显微镜和分析（3D免疫FISH）。此协议的优点是DNA和保存的蛋白质结构的组合的可视化。我们在这一领域的经验，使我们能够改进和简化现有的协议。虽然我们已经使用该协议来检测在淋巴细胞发生重组的DNA双链断裂，该方法可以应用到其他的蛋白质和其他细胞类型。
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Protocol
1。 DNA探针标记荧光基团：：尼克翻译（约6小时）
- 清洁的BAC DNA（其制备由马克西制备）或质粒或PCR产物，所有的再悬浮在H 2 O中，可用于标记， 请注意 ，一个强大的FISH信号，探针应跨越至少10 kb的。
- 孵育DNA的RNA酶A中的30分钟，在37℃（ 表1中列出的所有试剂）。
- 在16°C孵育2小时缺口翻译反应（见表2和表3）。直接标记的替代方法，可以使用（实施例：FISH标签，Invitrogen公司）。
- 失活反应1小时，在-80℃或-20℃下过夜
- 确定探头的尺寸，在2％琼脂糖凝胶上。涂片应介于100和1000bp的，与多数在约300-500 bp的（ 请注意 ，在涂抹的Cy5探针是不可见的）。如果是不能消化足够的DNA，DNA聚合酶I和DNA酶I可以加入到该反应，并在16℃下温育两小时
- 在两升的烧杯中，充满了H 2 0 2小时在黑暗中的0.025毫米过滤器净化探针。
- 添加阻断因素的探针如下：婴儿床-1的DNA的10微克，10微克Hybloc DNA，鲑鱼精子DNA探针的10微克和100微克。 DNA探针存储于-20℃下
2。探头沉淀/变性/预退火（3-4小时）
- 之间的0.3微克，1微克的DNA探针是用于每盖玻片。用0.1倍体积的3M乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的100％乙醇的混合探针，温育1小时，在-80℃或在-20℃下过夜，降速以13,000 rpm在4℃下30分钟。 请注意 ，根据质量的DNA和杂交的核区域，DNA探针的量可被调整。直接标记的替代方法，可以允许使用的减少量的探头。有关一个幻灯片的多个DNA FISH信号的检测，不同的探针可以一起沉淀（除了这不应该是预退火后，类似重复序列）的探针。也可以在同一时间进行的几个实验的探针一起沉淀。浅色的颗粒应根据荧光（如果少量的探针沉淀，沉淀可能是不可见的）。
- 干燥颗粒，并重新悬浮于15μl杂交缓冲液（ 见表4）每盖玻片振荡（使用的Eppendorf恒温）在黑暗中于37-45℃（约20分钟）。
- 为5分钟，在75-95℃下的变性探针
- 预退火的探针在37℃下30-60分钟。可调节长度的预退火，根据探针的复杂性和质量。
- 将探针杂交过夜的盖玻片（见第3节）。
3。 3二维DNA FISH - 第一天（约3小时）
- 非粘附细胞在小体积的1x PBS（〜2×10 5个细胞在5-10微升1×PBS中，每盖玻片）浓缩和丢弃的中心上的聚-L-赖氨酸涂布的盖玻片。应培养贴壁细胞的盖玻片上，在至少24小时（〜70％汇合）（盖玻片可涂覆有0.1％明胶）。广场18x18的24-24毫米的盖玻片放置在6孔培养板中，并在整个协议，两个毫升的各溶液中，每孔使用（可以放置在12/24-well板交替圆1.5毫米盖玻片）。
- 修复细胞在2％多聚甲醛/ 1×PBS，pH值为7-7.4，在RT（4％PFA股票可以等分，储存在-20℃下）10分钟。在溶液中可以购买多聚甲醛（16％），或4％的股份解决方案，可制取粉末/小球。多聚甲醛的粉末溶解在1x PBS，在> 60°C（可提高pH值至8-9，以促进溶解），在冰上的液冷式，调整pH至7-7.4，过滤，分装在隼周贮存于-20℃下
- 三个在1x PBS漂洗后，透性细胞在冰冷的0.4％的Triton-X-100/1×PBS中，在冰上5分钟。调整长度的通透性，根据细胞类型。 注意 ：，DNA FISH与免疫相结合，应进行免疫组化，在这个阶段（见第4章 ）。
- 三个在1x PBS漂洗，孵育细胞后，与0.1微克/微升的核糖核酸酶A在1x PBS，1小时，在37℃下盖玻片置于细胞的一面朝下下降了100μl的解决方案封口膜在潮湿的室内或幻灯片上。盖玻片，然后小心地用钳子取出。如果任何遇到阻力，盖玻片应被淹没用1×PBS，以避免损坏细胞。
- 三个在1x PBS漂洗后，在冰冷的0.7％的Triton-X-100 / 0.1 M盐酸透性细胞在冰上10分钟。
- 经过三次冲洗我Ň1X PBS，在1.9 M HCl 30分钟，在室温下变性细胞。或者，细胞可以在50％甲酰胺/ 2×SSC中变性，在75-80℃下至少30分钟。 请注意 ，杂交的长度（和温度）取决于细胞类型可被优化。
- 三个在冰冷的1×PBS中漂洗后，在一个黑暗，潮湿的腔室中，在37℃下过夜，与探针杂交的细胞。盖玻片放置单元侧下降到滴15μl的探针在幻灯片上，并密封与橡胶水泥。
4。 3维免疫FISH - 第一天（约6-7小时）
- 结合免疫荧光/ DNA的FISH，免疫染色后应进行0.4％的Triton-X-100（ 步骤3.3）中的通透性。
- 孵育细胞30分钟，在RT（2.5％牛血清白蛋白（BSA），10％正常山羊血清，0.1％Tween-20的）的封闭溶液。阻挡的溶液过滤，等分在1.5ml Eppendorfs和存储为months于-20℃下
- 孵育细胞与第一抗体反对封闭溶液稀释的感兴趣的蛋白或组蛋白修饰，在潮湿的腔室在RT 1小时。在这里，我们将展示的例子中的抗体对磷酸化丝氨酸139 H2AX（γ-H2AX，Millipore公司的详细信息，请参阅表5）。盖玻片置于细胞的一面朝下下降了100μl的解决方案封口膜在潮湿的室内或幻灯片上。盖玻片然后小心地用钳子（充斥如有必要，用1×PBS）除去注意的抗体和细胞类型的质量取决于稀释和孵化长度可以调整。
- 洗涤细胞，在0.2％BSA / 0.1％的Tween-20/1×3倍的PBS中，在RT下振摇5分钟。
- 孵育细胞与稀释在封闭溶液在RT 1小时在一个黑暗，潮湿的腔室中的相应的荧光团共轭的次级抗体。这里，我们表明检测的一个例子与次要的羊抗鼠抗体（的Alexa Fluor 488或555，Invitrogen公司的详细信息，请参阅表5）。半抗原缀合的第二抗体（生物素，地高辛等），也可以使用。在这种情况下，一个额外的步骤，用于适当的检测（链霉抗生物素蛋白，抗挖，等）可以被执行之前或之后，过晚DNA-FISH杂交。
- 漂洗细胞在0.1％的Tween-20/1×PBS中，3次5分钟的在RT振荡在黑暗中。
- 修复后的细胞在2％多聚甲醛/ PBS洗涤10分钟，在室温下，在黑暗中。
- 继续DNA FISH以上核糖核酸酶A（3.4）从孵化。
5。 3维DNA FISH /免疫FISH - 第二日（约2小时）
- 小心地取出橡皮泥，洪水盖玻片用2×SSC，用钳子小心地取出，并将其放置在洗涤液孔中。
- 洗涤细胞2倍SSC，30分钟，37°C振荡在黑暗中。
- 洗涤细胞2倍SSC在室温为30分钟，在黑暗中晃动。
- 在1x SSC洗涤细胞，在黑暗下振荡30分钟，在RT。 请注意，在用甲酰胺变性的情况下，清洗应该由下列替代：洗涤3次，在50％甲酰胺/ 2×SSC洗涤3次，在2×SSC，5最小，在37°C。
- 挂载的ProLong黄金安装介质，含有1.5微克/毫升的DAPI（4,6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚）对染的总DNA的细胞。下降10-15μl的安装介质上的幻灯片上，盖玻片放在细胞和密封的指甲油。幻灯片数月保持在-20°C
6。的3D显微镜和分析
- 不同的显微镜系统，三维图像可以被收购。在我们的实验中，0.3微米的光学部分分离，收集上的Leica SP5 AOBS的共聚焦系统（声光分束器） 之间的分离光学升飞机可以调整取决于分析的类型。
- 3D图像栈可以使用不同的软件和工具进行分析。我们使用Image J软件进行评估利益的位点之间的距离测量和分析不同类型的利益与核车厢或蛋白质的基因位点的关联。
- 进行所有的统计分析来比较两个（或更多）不同的生物与成对评估（s）的意义：不同的细胞类型或阶段之间的比较，比较的利益的不同基因座之间的条件。在所有的统计检验，P值≤5.00E-2（α= 0.05），是显着的（1.00E-2≤P≤5.00E-2 *显著; 1.00E-3≤P≤1.00E-2 * *非常显著，P <1.00E-3 ***非常显着）。
两个等位基因之间的距离在整个分布的统计分析，我们第一个c累积分布频率曲线onstruct的整个范围内的测量之间的距离的两个alleles.To评估我们使用非参数两样本Kolmogorov-Smirnov测试（KS）13,14的实证等位基因间的距离的分布中的差异的意义。
统计分析的两个等位基因的最佳距离截止密切的联系（即配对）。要确定范围内的最强大的两个等位基因位点之间的距离差异，我们采用了一系列的双尾Fisher精确检验15秒 。也就是说，在每个测量距离我们测试一个条件是否显着超额代表在较短的两个样本之间的距离。的最小的 P值的分布中表示的范围内的距离，应被看作是密切关联的两个等位基因（ 即配对）的截止。随后，双尾Fisher精确检验采用tØ评估在识别cut-off值15的配对两个等位基因的意义。多次测试修正被应用到占总数的费舍尔测试的执行16。
利益与核车厢或蛋白质的轨迹协会的统计分析。，双尾费舍尔精确的测试是用来分析的意义协会感兴趣的轨迹与不同的车厢或蛋白质15。
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Representative Results
DNA和免疫-FISH用于的Skok实验室，研究的过程中，V（D）J重组抗原受体位点在B和T淋巴细胞的发展与核组织的变化。上面详述的技术使我们ⅱ）到i）之间的测量距离的两个端部的轨迹（收缩）之间的测量距离的等位基因或基因座（配对），iii）分析内发生的位点的DNA损伤，ⅳ）评估的等位基因的位置位点相对于核分室（在我们的研究的镇压着丝粒异染色质），及v）评估协会的细胞核蛋白的基因和位点（磷酸化的组蛋白γ-H2AX在我们的研究中）。特别是，我们分析的作用位点的动态的调节V（D）J重组的免疫球蛋白基因在发育中的B细胞17-30，血统承诺之间的调节CD4 +和CD8 + T细胞14。我们还评估了在一个T-细胞受体的轨迹，TCRA /天 ，在开发携带突变的重组酶蛋白质RAG2 31形式的T细胞的DNA损伤。
图1。分析两个等位基因或位点之间的距离（A）的共焦截面图代表的未配对的（右）或配对（左）的等位基因在单个核。产生的DNA FISH探针，从BAC（200 KB）跨越轨迹的兴趣。之间测得的在3D图像栈每个BAC信号质量的中心之间的距离的等位基因。虚线圆圈勾勒出核的形状。比例尺= 1微米。 （B）的累积频率分布曲线示出的整个范围内的两个等位基因之间的距离s测量在两个不同的生物条件（野生型与突变型）。非参数两样本KS检验来评估这两个发行版之间的差异的意义。评估采用了一系列的双尾Fisher精确检验（蓝点）的范围最强大的差异等位基因间的距离。被发现最稳健的P值（较高的点）为约1微米的距离。因此截止密切关联的两个等位基因（ 即配对）成立，在1微米。 （C）表示的两个等位基因中的两个不同的生物条件从0至1.5微米之间的距离的累积频数曲线。使用双尾Fisher精确检验评估，截止于1微米的意义配对的两个等位基因。 点击此处查看大图 。
图2。分析的位置的轨迹相对于子核车厢，在我们的研究中，我们分析我们感兴趣的位点和压制性亚核室所形成的着丝粒异染色质（PCH）32之间的关系。等位基因被认为是位于在PCH的BAC信号为感兴趣的轨迹是与γ-杂交的PCH（无像素中的边缘之间的BAC和γ-卫星DNA FISH信号）的卫星信号，相邻的或重叠的。共聚焦部分代表的TCRA等位基因相对于PCH（ 上 ）没有等位基因位于PCH（ 中 ）在PCH的一个等位基因，（ 下 ）两个等位基因在PCH的位置。位点的红色和γ-卫星为白色。黄色箭头显示的等位基因位于PCH。虚线圆圈勾勒出核的形状。比例尺= 1微米。
图3。核蛋白和组蛋白修饰的轨迹上的关联分析。（A）在我们的研究中，我们的利益和我们的基因位点的磷酸化的组蛋白H2AX（γ-H2AX）之间的关系进行了分析，作为读出DNA双链断裂33。共聚焦部分没有γ-H2AX协会的（ 顶部 ）或协会一的TCRA的等位基因（ 下 ）在单个核的例子。等位基因被定义为与γ-H2AX的如果BAC信号和免疫荧光灶时至少一部分重叠（在至少一个像素的共定位）。轨迹示出在红色和γ-H2AX的白色。虚线圆轮廓Ňucleus的形状。比例尺= 1微米， 它是注意，共定位分析的BAC信号与PCH或γ-H2AX的灶进行手动使用Image J软件没有自动阈值（B）的γ-H2AX的信号的一部分的亏损变性后是免疫DNA FISH协议的主要技术问题之一提出的。这里，我们表明以前的免疫荧光（ 顶部 ）和（ 底部 ）的HCl-基变性处理（甲酰胺处理，得到了类似的结果（图中未示出））后的一个例子。尽管信号较弱，染色的主要特征，特别是病灶的数目，保持处理后的。使用的SP5徕卡激光共聚焦，设置为561激光前后变性，执行以下操作：在730V的电源/智能增益35％，和45％的电源/智能增益为750V，分别。此外，我们在这里展示的一个例子免疫荧光染色，另一组蛋白米odification H3K27me3（ 右面板 ）示出，这个协议可以施加到其他组蛋白标记，如先前已公布1,3。 γ-H2AX的所示在黄色和H3K27me3红色。虚线圆圈勾勒出核的形状。比例尺= 2微米。 点击这里查看大图 。
| 的试剂/材料名称 | 公司 | Catalogm号码 | 评论 |
| H 2 O | 费舍尔 | ＃BP2470 | |
| 核糖核酸酶A | 西格玛 | ＃R4642 | |
| DNTP | 西格玛 | ＃DNTP100 | |
| Alexa的原位 | Invitrogen公司 | ＃C11397 C-11401 | |
| Cy3或Cy5的dUTP | 费舍尔 | ＃45-001-XXX | |
| DNA酶I | 罗氏公司 | ＃04536282001 | |
| DNA聚合酶I | 生物实验室 | ＃M0209 | |
| 0.025微米的过滤器 | 密理博 | ＃VSWP02500 | |
| COT-1 DNA 1毫克/毫升 | Invitrogen公司 | ＃18440 | |
| hybloc DNA的1毫克/毫升 | 应用遗传 | ＃MHB | |
| 鲑鱼精 | 西格玛 | ＃D1626 | 粉末的再悬浮在H 2 O在10毫克/毫升 |
| 乙酸钠（醋酸钠，pH值5.2，缓冲溶液） | 西格玛 | ＃S7899 | |
| FICOLL 400（分子生物学级） | 费舍尔 | 排名第525 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮（分子生物学级） | 费舍尔 | ＃BP431 | |
| 硫酸葡聚糖粉末 | 西格玛 | ＃D8906 | |
| 亚急性硬化性全脑炎（盐磷酸钠EDTA）20倍的解决方案 | 费舍尔 | ＃BP1328 | |
| 甲酰胺 | 费舍尔 | ＃BP227 | |
| 盖玻片 | 费舍尔 | ＃12-548-B | |
| 幻灯片 | 费舍尔 | ＃12-550 | |
| 6 - 孔板 | 费舍尔 | ＃0720080 | |
| PBS，10 | 费舍尔 | ＃MT-46-013-CM | |
| 西格玛 | ＃P8920 | ||
| 多聚甲醛，小球状，95％; | 西格玛 | ＃441244 | |
| 的Triton-X-100，分子生物学级 | 西格玛 | ＃T8787 | |
| BSA（牛血清白蛋白）馏分V | 费舍尔 | ＃BP 1600 | |
| 正常山羊血清 | 矢量实验室 | ＃S-1000 | |
| 吐温20，分子生物学级 | 西格玛 | ＃P9416 | |
| 的SSC（盐柠檬酸钠）20倍的解决方案 | 费舍尔 | ＃BP1325 | |
| 延长Gold抗淬灭试剂 | Invitrogen公司 | ＃P36930 | |
| DAPI（4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚） | 西格玛 | ＃D9542 | |
| 最好的测试涂层橡胶水泥 | 艺术或办公用品店 |
表1。特定的试剂和小型设备。
| NT与原位耦合与Alexa荧光基团 | 量 | 终浓度 |
| 10微克DNA | 所述微升 | |
| 核糖核酸酶A - 0.17微克/微升 | 10微升 | |
| H 2 O | 填写到260微升 | |
| 总在37°C - 30分钟 | 260微升 | |
| 10倍NT缓冲 | 50微升 | 1个 |
| 100 MM＆TA-巯基乙醇 | 50微升 | 10μM |
| dNTP混合液 | 40微升 | 40μMdNTP各 |
| 0.1毫米dTTP的 | 50微升 | 10μM |
| 1毫米Alexa的原位 | 12微升 | 30μM |
| DNA酶I（有效的解决方案，请参阅下表） | 30微升 | |
| DNA聚合酶I | 7.5μL | 15 U / ml的 |
| 在16°C - 2小时 | 500μL | |
| NT与原位再加上Cy3或Cy5 | 量 | 终浓度 |
| 10微克DNA | 所述微升 | |
| 核糖核酸酶A - 0.17微克/微升 | 10微升 | |
| H 2 O | 填写300微升 | |
| 总在37°C - 30分钟 | 300微升 | |
| 10倍NT缓冲 | 50微升 | 1个 |
| 的100mMβ-巯基乙醇 | 50微升 | 10μM |
| dNTP混合液 | 50微升 | 50μM的每种dNTP |
| 1mM的的Cy3或Cy5-dUTP标记 | 12微升 | 30μM |
| DNA酶I | 〜30微升 | 〜1.2 U /μL |
| DNA聚合酶I | 7.5μL | 15 U / ml的 |
| 在16°C - 2小时 | 500μL |
表2。RNaseA处理和尼克翻译为10微克DNA。
| 解决方案 | 股票 | |
| 核糖核酸酶A | 工作液 ：0.17微克/微升 | 由新鲜 |
| 10倍NT缓冲： | 0.5M的Tris-盐酸，pH为8;的50mM的MgCl 2，0.5毫克/毫升BSA | 1.5 ml微量离心管在-20°C。 |
| dNTP混合液： | 的dATP，dCTP和dGTP：0.5MM在H 2 O | 1.5毫升管在-20°C |
| DNA酶I： | 联合解决方案 ：在20毫米的Tris pH值7.5/50％glycerol/50 mM氯化钠为20,000 U / ml的重组 | 0.5 ml反应管在-20°C |
| 工作液 ：每一批新的DNA酶I原液进行测试，在不同的稀释液（10 U / ml时，20 U / ml和40 U / ml的H 2 O）。给人一种DNA涂抹稀释，在100和1000之间基点（见第5步），应使用的工作溶液。 | 由新鲜 |
表3。RNaseA处理和尼克翻译的解决方案。
| 杂交缓冲液 | 解决方案 | 股票 | |
| 10％ | 50倍登哈特的解决方案： | 1克聚蔗糖400，1克聚乙烯基吡咯烷酮和100ml H 2 O -滤波 | 50毫升猎鹰-20°C |
| 40％ | 25％硫酸葡聚糖： | 硫酸葡聚糖粉末，在37-65℃下溶解在12.5倍SSPE | 50毫升猎鹰-20°C |
| 50％ | 甲酰胺 | 在4°C瓶 | |
| 等分试样在-20＆在1.5ml Eppendorfs的存储度; C | |||
表4中。杂交缓冲。
| 抗体 | 提供者 | 目录号 | 稀释 |
| γ-H2AX - 磷酸H2A.X，JBW301克隆，小鼠单克隆 | 密理博 | ＃05636 | 1/200 |
| H3K27me3，克隆兔多克隆 | 密理博 | ＃07449 | 1/200 |
| 的Alexa Fluor 555驴抗小鼠 | Invitrogen公司 | ＃A-31570 | 1/500 |
| 的Alexa Fluor 488羊抗鼠 | Invitrogen公司 | ＃A-11001 | 1/500 |
| 的Alexa Fluor 488羊抗兔 | Invitrogen公司 | ＃A-11008 | 1/500 | </ TR>
表5。小学和中学的抗体。
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Discussion
上面详细介绍了在我们的实验室中使用的技术分析的调节V（D）J重组的免疫球蛋白的TCRA / D位点在发展中淋巴细胞30,31。我们相信，这种技术可以适用于不同的核蛋白质，核车厢及基因位点的检测，在不同的细胞类型。协议的修改可能是必要的，而且在这种情况下的主要步骤，集中有以下几种。首先，可以调整长度通透性取决于细胞类型。二初级抗体孵育的长度也可以被调整，根据抗体的质量和感兴趣的蛋白质的丰度（例如在某些情况下，可能进行孵育在4℃下过夜）。重要的是，变性步骤可以适于，和HCl处理可被用于DNA FISH 20在甲酰胺3,4,34和NaOH变性。也可以用来重复编的液态氮的冻结-解冻周期，可施加到细胞固定后的DNA FISH单独4,34 /通透性。最后，虽然已被成功地检测到几个组蛋白修饰，RNA聚合酶Ⅱ和共同因素使用此方法30,35，其他核蛋白质的免疫染色可以之后进行的DNA FISH杂交4。
3D图像的分析可以涉及使用不同类型的显微镜，包括宽视场的落射荧光（加上去卷积）和激光共聚焦显微镜36。的成像方法的选择将取决于所要求的分辨率，荧光基团的数目，深度的DNA和蛋白质的信号的样品和质量。新的高分辨率显微镜的发展打开了一个全新的途径，准确的核和细胞过程的可视化37-39。此外，新技术的一代内n的量身定制的不包含重复序列的探针使干净的基因组区域的检测，从15-kb的特定位点中，复杂的外显子40的池。这增加核过程的动态跟踪的准确性和灵敏度，高分辨率显微镜。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们要感谢Skok实验室，特别是苏珊娜·休伊特，成员的讨论和意见。这项工作是由美国国家卫生补助R01GM086852，RC1CA145746（JAS）的支持。 JAS是一个白血病和淋巴瘤协会的学者。 JC是欧文顿研究所的癌症研究所的研究员。 MM是由美国国家科学基金会资助中西医结合研究生教育和研究培训实习（IGERT 0333389 NSF）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
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