Summary
Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).
Abstract
Fluorescente in situ hybridisatie met DNA probes on 3-dimensionaal bewaard kernen gevolgd door 3D confocale microscopie (3D DNA FISH) is de meest directe manier om de locatie van genloci, chromosomale deelgebieden of gehele grondgebied in individuele cellen te visualiseren. Dit type analyse geeft inzicht in de globale architectuur van de kern en het gedrag van specifieke genomische loci en gebieden binnen de nucleaire ruimte. Immunofluorescentie, anderzijds, voor het vaststellen van nucleaire eiwitten (gemodificeerde histonen, histon varianten en modifiers, transcriptiemachinerie en factoren, nucleaire subcompartimenten, etc). De grote uitdaging in combinatie immunofluorescentie en 3D DNA FISH is enerzijds aan de epitoop herkend door het antilichaam en de 3D structuur van de kern te behouden en anderzijds, zodat de penetratie van de DNA probe te detecteren genloci of chromosoom gebieden 1 tot 5. Hier bieden wij een protocol dat visualisatie van chromatine modificaties met genomische loci in 3D bewaarde kernen combineert.
Introduction
Epigenetische mechanismen trekker vestiging en overerving van ontwikkelings-en cel-type specifieke transcriptionele profielen. Op een bepaald niveau gaat het om de modulatie van chromatine verpakking dat de actieve of stille genomische regio's definieert. Op grotere schaal, algemene 3D organisatie van het genoom en nucleaire architectuur een rol spelen in de controle van transcriptionele patronen. Zo dissectie van deze epigenomisch functies is van essentieel belang voor een goed begrip van de manier waarop genen worden gereguleerd 6-11.
Gecombineerd immunofluorescentie en 3D DNA FISH bieden een unieke gelegenheid om moleculaire en biochemische analyses aan te vullen met het beoordelen van specifieke interacties / verenigingen van DNA-sequenties en / of eiwitten in de kern. Bovendien, terwijl genoom-brede high throughput technieken zoals chromatine immunoprecipitatie (ChIP-seq) of chromosoom capture conformatie in combinatie met diepe sequencing (4C-seq, 5C, Hi-C) bieden wereldwijde thateen op celpopulaties 12, immunofluorescentie / DNA FISH technieken maken van de analyses op de enkele cel niveau.
Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno FISH). Het voordeel van dit protocol is de gecombineerde visualisatie van DNA en behoud van eiwitstructuren. Onze ervaring op dit gebied heeft ons in staat te verbeteren en vereenvoudiging van de bestaande protocollen. Hoewel we hebben dit protocol DNA dubbelstrengs breuken gedetecteerd in lymfocyten ondergaan recómbinatie, kan deze werkwijze worden toegepast op andere eiwitten en andere celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Probe Labeling met fluoroforen: Nick Vertaling (~ 6 uur)
- Schoon BAC DNA (bereid door maxi-prep) of plasmiden of PCR producten alle geresuspendeerd in H 2 O, kunnen worden gebruikt voor labeling. Merk op dat een robuust FISH signaal probes ten minste 10 kb omvatten.
- Incubeer DNA in RNase A gedurende 30 min bij 37 ° C (alle reagentia zijn vermeld in tabel 1).
- Incubeer de nicktranslatie reactie gedurende 2 uur bij 16 ° C (zie tabellen 2 en 3). Alternatieve methoden van direct merken worden gebruikt (voorbeeld: FISH Tag, Invitrogen).
- Inactiveren het reactiemengsel gedurende een uur bij -80 ° C of overnacht bij -20 ° C.
- Bepaal probe grootte op een 2% agarose gel. Het uitstrijkje moet tussen 100 en 1.000 bp, met de meerderheid van ongeveer 300 tot 500 bp (Merk op dat het uitstrijkje van Cy5-probes niet zichtbaar is). Als het DNA niet voldoende verteerd, meer DNA Pol I enDNase I kunnen worden toegevoegd aan het reactiemengsel en gedurende twee uur bij 16 ° C.
- Zuiver probes op 0,025 mm filters in twee liter bekers gevuld met H 2 0 voor twee uur in het donker.
- Toevoegen remmende factoren de probes als volgt: 10 pg Cot-1 DNA, 10 ug Hybloc DNA en 100 pg zalmsperma voor 10 ug DNA probes. Store DNA probes bij -20 ° C.
2. Probe Precipitation / Denaturation / Pre-hybridisatie (3-4 uur)
- Tussen 0,3 ug en 1 pg DNA probe wordt gebruikt per dekglaasje. Mix probes met 0,1 volume 3 M NaAc (pH 5,2) en 2,5 volumes 100% ethanol, incuberen gedurende een uur bij -80 ° C of overnacht bij -20 ° C en beneden draaien bij 13.000 rpm bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Merk op dat de hoeveelheid DNA probe kan worden aangepast afhankelijk van de kwaliteit van het DNA en de nucleaire regio hybridisatie. Alternatieve methoden van direct merken kan het gebruik van verminderde hoeveelhedenprobe. Voor detectie van meerdere DNA FISH signalen op een dia kunnen de verschillende probes samen neergeslagen (behalve probes die niet mogen worden vooraf gegloeid, zoals repeat sequenties). Probes voor verschillende experimenten tegelijk ook samen worden geprecipiteerd. Pellets wordt licht gekleurd volgens de fluoroforen gebruikt (indien kleine hoeveelheden probes worden geprecipiteerd, de pellet niet zichtbaar).
- Droge pellets en deze in 15 pi hybridisatiebuffer opnieuw in suspensie (zie tabel 4) per dekglaasje onder schudden (met een Eppendorf Thermomixer) in het donker bij 37-45 ° C (ongeveer 20 min).
- Denatureren probes gedurende 5 min bij 75-95 ° C.
- Pre-probes hybridiseren bij 37 ° C gedurende 30-60 min. Duur van pre-gloeien kan worden aangepast afhankelijk van de complexiteit en de kwaliteit van de probes.
- Breng sondes naar de dekglaasjes voor overnachting hybridisatie (zie hoofdstuk 3).
3. 3-Dimensionale DNA FISH - Eerste Dag (~ 3 uur)
- Niet-hechtende cellen worden geconcentreerd in een klein volume 1x PBS (~ 2x10 5 cellen 5-10 pi PBS 1x per dekglaasje) en vallen op het centrum van een poly-L-lysine gecoate dekglaasje. Hechtende cellen worden gekweekt op dekglaasjes ten minste 24 uur (-70% confluentie) (dekglaasjes worden bekleed met 0,1% gelatine). Vierkant 18x18 tot 24-24 mm dekglaasjes geplaatst in 6-well platen en de gehele protocol twee ml van elke oplossing wordt per putje (respectievelijk rond 1,5 mm dekglaasjes worden geplaatst in 12/24-well platen).
- Fix cellen in 2% paraformaldehyde / 1x PBS, pH 7-7,4, gedurende 10 min bij kamertemperatuur (4% PFA voorraden kunnen worden porties verdeeld, bewaard bij -20 ° C). Paraformaldehyde kan worden gekocht in oplossing (16%), of 4% voorraad oplossingen kunnen worden bereid uit poeder / prils. Paraformaldehyde poeder wordt opgelost in 1x PBS bij> 60 ° C (pH kan worden verhoogd tot 8-9 tot oplossen ervan te vergemakkelijken), afgekoelde op ijs, pastED pH 7-7,4, gefiltreerd, in porties verdeeld en opgeslagen in valken weken bij -20 ° C.
- Na drie spoelingen in 1x PBS, cellen doorlaatbaar in ijs-koude 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS gedurende 5 minuten op ijs. Lengte van permeabilisatie kan worden aangepast, afhankelijk van het celtype. Let op: Als DNA FISH wordt gecombineerd met immunofluorescentie, de immunokleuring moet worden uitgevoerd in deze fase (zie hoofdstuk 4).
- Na drie spoelingen in 1x PBS, incubeer cellen met 0,1 ug / ul RNase A in 1x PBS gedurende een uur bij 37 ° C. Dekglaasjes geplaatst cel naar beneden op een daling van 100 ul oplossing op parafilm of een dia in een vochtige kamer. Dekglaasjes worden voorzichtig verwijderd met een pincet. Als een weerstand ondervindt, moet dekglaasjes worden overspoeld met 1x PBS om beschadiging van de cellen.
- Na drie spoelingen in 1x PBS, cellen doorlaatbaar in ijs-koude 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl gedurende 10 minuten op ijs.
- Na drie spoelingen in 1x PBS, cellen denatureren in 1,9 M HCl gedurende 30 min bij RT. Als alternatief kunnen cellen worden gedenatureerd in 50% formamide / 2x SSC bij 75-80 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Merk op dat hybridisatie lengte (en temperatuur) kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van het celtype.
- Na drie spoelingen in ijskoude 1x PBS, cellen met probes hybridiseren gedurende de nacht bij 37 ° C in een donkere en vochtige kamer. Dekglaasjes worden geplaatst cel naar beneden op een daling van 15 ul van de sonde op een dia, en verzegeld met rubber cement.
4. 3-dimensionale Immuno-FISH - Eerste Dag (~ 6 tot 7 uur)
- Voor gecombineerde immunofluorescentie / DNA vissen, immuno-kleuring uitgevoerd na permeabilisatie in 0,4% Triton-X-100 (Stap 3.3).
- Incubeer cellen in blokkerende oplossing gedurende 30 min bij kamertemperatuur (2,5% bovine serum albumine (BSA), 10% normaal geitenserum, 0,1% Tween-20). De blokkerende oplossing wordt gefiltreerd, in porties verdeeld in 1,5 ml Eppendorfs en opgeslagen maanden bij -20 ° C.
- Incubeer de cellen met het primaire antilichaam tegen het eiwit of de histonmodificatie plaats verdund in blokkerende oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Hier laten we het voorbeeld van een antilichaam tegen gefosforyleerde serine-139 van H2AX (γ-H2AX, Millipore, zie tabel 5 voor details). Dekglaasjes geplaatst cel naar beneden op een daling van 100 ul oplossing op parafilm of een dia in een vochtige kamer. Dekglaasjes worden voorzichtig verwijderd met een pincet (overspoeld met 1x PBS indien nodig). Verdunning en incubatie lengte kan worden aangepast afhankelijk van de kwaliteit van het antilichaam en cel-types.
- Was de cellen in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, drie keer 5 min bij kamertemperatuur onder schudden.
- Incubeer cellen met de geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkeringsoplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur in een donkere en vochtige kamer. Hier tonen een voorbeeld van detectie met eensecundaire geit anti-muis antilichaam (Alexa Fluor 488 of 555, Invitrogen, zie tabel 5 voor details). Hapteen-geconjugeerde secundaire antilichamen (biotine, digoxigenine, enz.) kunnen ook worden gebruikt. In dit geval kan een extra stap nodig detectie (streptavidine, anti-dig, etc) worden uitgevoerd hetzij vóór of na over-nacht DNA-hybridisatie FISH.
- Spoel cellen in 0,1% Tween-20 / 1x PBS, drie keer 5 min bij kamertemperatuur onder schudden in het donker.
- Post-fix cellen in 2% paraformaldehyde / 1x PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Verder DNA FISH zoals hierboven van incubatie in RNase A (Stap 3.4).
5. 3-dimensionale DNA FISH / Immuno-FISH - Tweede dag (~ 2 uur)
- Verwijder voorzichtig rubber cement, overstroming dekglaasjes met 2x SSC, verwijder voorzichtig met een pincet en hen in putjes die wasoplossing te plaatsen.
- Was de cellen in 2x SSC gedurende 30 min bij 37 ° C in het donker onder schudden.
- Was de cellen in 2x SSC gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker onder schudden.
- Was de cellen in 1x SSC gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker onder schudden Merk op dat in geval van denaturatie met formamide, wassingen worden vervangen door: 3. Wasbeurten in 50% formamide / 2x SSC en 3 wassingen in 2x SSC, 5 min elk bij 37 ° C.
- Monteren cellen in ProLong Gold fixeermiddel dat 1,5 ug / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindool) voor tegenkleuring van totaal DNA. Dekglaasjes worden geplaatst cel naar beneden op een daling van 10-15 ul montage medium op een dia en verzegeld met nagellak. Dia's worden bewaard voor maanden bij -20 ° C.
6. 3D Microscopie en Analyse
- 3D-beelden kunnen worden verkregen met verschillende microscoop systemen. In onze experimenten zijn optische gescheiden delen door 0,3 pm verzameld op een Leica SP5 AOB confocale systeem (acousto-optische Beam Splitter). Merk op dat de afstand tussen optical vlakken kunnen worden aangepast afhankelijk van het type analyse.
- 3D-beeld stapels kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende software en tools. We maken gebruik van de Image J software om afstandsmetingen tussen loci van belang te beoordelen en om verschillende soorten van de statuten van de loci van belang met sub-nucleaire compartimenten of eiwitten te analyseren.
- Alle statistische analyses uitgevoerd om met elkaar te vergelijken (of meer) verschillende biologische voorwaarden paarsgewijze assessment (s) van belang: vergelijking tussen verschillende celtypen of stadia vergelijking tussen verschillende loci plaats. In alle statistische tests, P-waarden ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) worden genomen, significant (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * significant; 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * zeer significant; P <1,00 E-3 *** zeer belangrijk).
Statistische analyse van de volledige verdeling van afstanden tussen twee allelen. Eerst construct cumulatieve verdeling frequentiecurves over het gehele bereik van de gemeten afstand tussen de twee alleles.To de significantie van verschillen in de verdeling van de empirische inter-allelische afstanden gebruiken we de niet-parametrische twee steekproeven Kolmogorov-Smirnov (KS) test 13,14.
Statistische analyse van nauwe samenwerking (dwz koppeling) van twee allelen met behulp van een optimale afstand cut-off. Om het bereik van de meeste robuuste verschillen in afstanden tussen twee allelen of loci te identificeren, gebruiken we een reeks van twee-staart Fisher exact test 15 s. Namelijk, bij elke gemeten afstand testen we of een voorwaarde is aanzienlijk oververtegenwoordigd bij kortere afstanden tussen de twee monsters. De minimum in de verdeling van P-waarden geeft het bereik van afstanden die moeten worden beschouwd als een cut-off nauwe associatie (bijv. koppeling) van de twee allelen. Vervolgens worden de twee grenzen Fisher exact test wordt gebruikt to beoordeling van de betekenis van het koppelen van twee allelen van de geïdentificeerde cut-off waarde 15. Veelvuldig testen correcties worden toegepast voor het aantal tests Fisher 16.
Statistische analyse van associatie van de locus van belang met sub-nucleaire compartimenten of eiwitten. De twee-staart Fisher-exact test wordt gebruikt om de betekenis van vereniging van de locus van belang met verschillende compartimenten of eiwitten 15 te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA en immuno-FISH worden gebruikt in de Skok lab de veranderingen in nucleaire organisatie bij het proces van V (D) J recombinatie van antigen receptor loci tijdens B en T lymfocyten ontwikkeling te bestuderen. De technieken hierboven beschreven kunnen we i) afstanden meten tussen de twee uiteinden van een locus (contractie) ii) afstanden meten tussen allelen of loci (pairing), iii) het analyseren van de DNA-schade die binnen loci, iv) een beoordeling van de locatie van allelen en loci ten opzichte van nucleaire sub-compartimenten (repressieve pericentromeric heterochromatine in onze studie), en v) beoordelen van de vereniging van nucleaire eiwitten op allelen en loci (vereniging van de gefosforyleerde histon γ-H2AX in onze studie). In het bijzonder hebben we de rol van locus dynamiek in de regulatie van V (D) J recombinatie van de immunoglobuline loci in ontwikkeling B-cellen 17-30, en in de regulering van lineage commitment tussen CD4 + en CD8 + Tcellen 14. Wij hebben eveneens DNA schade aan een van de T-cel receptor locus, Tcra / d, bij de ontwikkeling van T-cellen die een mutante vorm van het recombinase-eiwit RAG2 31.
Figuur 1. Analyse van de afstanden tussen twee allelen of loci. (A) Confocale secties tonen vertegenwoordiger ongepaard (rechts) of gekoppeld (links) allelen in individuele kernen. De DNA FISH probe werd gegenereerd uit een BAC (~ 200 kb) verspreid over de locus van belang. Afstanden tussen allelen werden gemeten tussen het zwaartepunt van elk BAC signaal in 3D stapels. Onderbroken cirkels te schetsen kern vormen. Schaal bar = 1 urn. (B) Cumulatieve frequentieverdeling krommen die het gehele bereik van afstanden tussen de twee allels gemeten in twee verschillende biologische omstandigheden (wild-type versus mutant). De parametrische twee sample KS test werd gebruikt om de significantie van de verschillen tussen de twee verdelingen beoordelen. Het bereik van de meest robuuste verschillen in inter-allelische afstand werd gemeten met behulp van een reeks van twee-staart Fisher exact test (blauwe stippen). De meest robuuste P-waarden (hogere dots) bleken voor de afstand ongeveer 1 pm. Zo is de cut-off voor nauwe samenwerking (dwz koppeling) van de twee allelen werd opgericht op 1 pm. (C) Cumulatieve frequentie krommen die de afstanden tussen de twee allelen 0 tot 1,5 um in de twee verschillende biologische condities. De betekenis van het koppelen van de twee allelen werd gemeten met de twee grenzen Fisher exact test voor een cut-off bij 1 pm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Analyse van de locatie van een locus opzichte van sub-nucleaire compartimenten. In onze studies hebben we de relatie tussen de loci van interesse en de repressieve sub-nucleaire compartiment gevormd door de pericentromeric heterochromatine (PCH) 32 analyseren. Allelen worden beschouwd als zich op PCH als de BAC signaal voor de locus plaats grenst of overlapt met de γ-satellietsignaal dat hybridiseert met PCH (geen pixel tussen de randen van de BAC en γ-satelliet DNA FISH signalen). Confocale secties representatief voor de locatie van Tcra allelen opzichte PCH: (Top) geen allel zich op PCH, (midden) een allel PCH, (Onder) twee allelen van PCH. Locus in het rood, en γ-satelliet in het wit. Gele pijlen geven de allelen zich aan PCH. Onderbroken cirkels te schetsen kern vormen. Schaal bar = 1 urn.
Figuur 3. Analyse van de vereniging van nucleaire eiwitten en histon modificaties op een locus. (A) In onze studies analyseren we de relatie tussen onze loci van de rente en de gefosforyleerde vorm van de histon H2AX (γ-H2AX), als read-out voor dubbele DNA- -stranded weg 33. Confocale secties tonen voorbeelden van geen γ-H2AX vereniging (Top) of vereniging op een Tcra allel (Onder) in individuele kernen. Allelen werden gedefinieerd als geassocieerd met γ-H2AX als de BAC signalen en immunofluorescentie foci ten minste gedeeltelijk overlappen (ten minste ene beeldelement van colokalisatie). Locus is weergegeven in rood en γ-H2AX in het wit. Onderbroken cirkels schets nucleus vormen. Schaal bar = 1 micrometer. Het is er rekening mee dat colokalisatie analyses van de BAC signaal met PCH of γ-H2AX foci handmatig worden uitgevoerd met behulp Afbeelding J software zonder automatische drempel. (B) Verlies van een deel van de γ-H2AX signaal na denaturatie is een van de belangrijkste technische vragen van deze immuno-DNA FISH protocol. Hier tonen een voorbeeld van immunofluorescentie voor (boven) en na (onder) HCl gebaseerde denaturatiebehandeling (Formamide behandeling leverde vergelijkbare resultaten (niet getoond)). Hoewel het signaal zwakker was, de belangrijkste kenmerken van de kleuring, met name het aantal foci blijven na de behandeling. Met behulp van een SP5 Leica confocale, de instellingen voor de 561 laser voor en na denaturatie waren de volgende: 35% van het vermogen / smart winst op 730V, en 45% vermogen / smart winst op 750V, respectievelijk. Verder tonen we hier een voorbeeld van een immunofluorescentiekleuring voor een ander histon mIJZIGING, H3K27me3 (rechter panelen) tonen dat dit protocol kunnen worden toegepast op andere histon merken, zoals reeds gepubliceerd 1,3. γ-H2AX wordt getoond in geel en H3K27me3 in het rood. Onderbroken cirkels te schetsen kern vormen. Scale bar = 2 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Naam van de Reagens / Materiaal | Vennootschap | Catalogm Nummer | Reacties |
| H 2 O | Visser | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 tot C-11401 | |
| Cy3 of Cy5 dUTP | Visser | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 micrometer filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Toegepaste Genetica | # MHB | |
| Zalmsperma | Sigma | # D1626 | poeder worden gesuspendeerd bij 10 mg / ml in H 2 O |
| NaAc (natriumacetaat, pH 5,2, buffer oplossing) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Visser | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Visser | # BP431 | |
| Dextraansulfaat poeder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x-oplossing | Visser | # BP1328 | |
| Formamide | Visser | # BP227 | |
| Dekglaasjes | Visser | Nr. 12-548-B | |
| Slides | Visser | # 12 tot 550 | |
| 6-well platen | Visser | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Visser | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehyde, prils, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol graad | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) Fraction V | Visser | # BP 1600 | |
| Normaal geitenserum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol graad | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline natriumcitraat) 20x oplossing | Visser | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagens | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindool) | Sigma | # D9542 | |
| Beste test een laag rubber cement | Art of kantoor aanbod winkels |
Tabel 1. Specifieke reagentia en klein materiaal.
| NT met dUTP gekoppeld aan Alexa-fluoroforen | Bedrag | Eindconcentratie |
| 10 ug DNA | X pi | |
| RNase A - 0,17 ug / ul | 10 pi | |
| H 2 O | Vul tot 260 ul | |
| TOTAL - 30 min bij 37 ° C | 260 ul | |
| 10x NT buffer | 50 pi | 1x |
| 100 mM & zijnta;-mercaptoethanol | 50 pi | 10 uM |
| dNTP mix | 40 pi | 40 uM van elk dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 pi | 10 uM |
| 1 mM dUTP Alexa | 12 ui | 30 uM |
| DNase I (werkoplossing, zie onderstaande tabel) | 30 pl | |
| DNA Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 uur bij 16 ° C | 500 pi | |
| NT met dUTP samen met Cy3 of Cy5 | Bedrag | Eindconcentratie |
| 10 ug DNA | X pi | |
| RNase A - 0,17 ug / ul | 10 pi | |
| H 2 O | Vul tot 300 pi | |
| TOTAL - 30 min bij 37 ° C | 300 pl | |
| 10x NT buffer | 50 pi | 1x |
| 100 mM β-mercaptoethanol | 50 pi | 10 uM |
| dNTP mix | 50 pi | 50 uM van elk dNTP |
| 1 mM Cy3-of Cy5-dUTP | 12 ui | 30 uM |
| DNase I | ~ 30 pi | ~ 1,2 U / pl |
| DNA Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 uur bij 16 ° C | 500 pi |
Tabel 2. RNase A behandeling en Nick Translation voor 10 ug DNA.
| Oplossingen | Effecten | |
| RNase A | Werkoplossing: 0,17 ug / ul | Samengesteld uit verse |
| 10x NT buffer: | 0,5 M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgCl2, 0,5 mg / ml BSA | 1,5 ml buizen bij -20 ° C. |
| dNTP mix: | dATP, dCTP, en dGTP: 0,5 mM elk in H 2 O | 1,5 ml buizen bij -20 ° C |
| DNase I: | Stockoplossing: opgelost bij 20.000 U / ml in 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | 0,5 ml buizen bij -20 ° C |
| Werkoplossing: Elke nieuwe partij DNase I stockoplossing moet worden getest bij verschillende verdunningen (10 U / ml, 20 U / ml en 40 U / ml in H 2 O). De verdunning die een DNA uitstrijk tussen 100 en 1000 bp (ziestap 5) worden gebruikt als de werkoplossing. | Samengesteld uit verse |
Tabel 3. Oplossingen voor RNase A behandeling en Nick Translation.
| Hybridisatiebuffer | Oplossingen | Effecten | |
| 10% | 50x Denhardt's oplossing: | 1 g Ficoll 400, 1 g polyvinylpyrrolidon en 100 ml H 2 0 - Gefilterde | 50 ml falcon bij -20 ° C |
| 40% | 25% dextransulfaat: | Dextransulfaat poeder wordt opgelost in 12,5 x SSPE bij 37-65 ° C | 50 ml falcon bij -20 ° C |
| 50% | Formamide | Flessen bij +4 ° C | |
| Aliquots in 1,5 ml Eppendorfs opgeslagen bij -20 ° C | |||
Tabel 4. Hybridisatiebuffer.
| Antilichamen | Leverancier | Catalogusnummer | Verdunning |
| γ-H2AX - fosfo H2A.X, kloon JBW301, muis monoklonale | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, kloon, konijn polyklonaal | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 ezel anti-muis | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 geit anti-muis | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 geit anti-konijn | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tabel 5. Primaire en secundaire antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven technieken werden in ons laboratorium van de regulering van V (D) J recombinatie van het immunoglobuline en Tcra / d loci in ontwikkeling lymfocyten 30,31 analyseren. We zijn ervan overtuigd dat deze techniek kan worden aangepast voor detectie van verschillende nucleaire eiwitten, nucleaire compartimenten en loci, in verschillende celtypen. Wijzigingen van het protocol noodzakelijk zijn, en in dit geval de belangrijke stappen te concentreren op de volgende. Ten eerste kan de lengte van permeabilisatie worden aangepast afhankelijk van het celtype. Tweede de lengte van het primaire antilichaam incubatie kan worden aangepast aan de kwaliteit van het antilichaam en de overvloed van het eiwit van interesse (bijvoorbeeld in sommige gevallen kan incubatie overnacht uitgevoerd bij 4 ° C). Bovendien kan het denaturatiestap worden aangepast en HCl behandeling worden vervangen door denaturatie in formamide 3,4,34 en NaOH voor DNA FISH 20. Ook herhalened vries-dooi cycli van vloeibare stikstof worden toegepast op de cellen na fixatie / permeabilisatie voor DNA FISH alleen 4,34. Tenslotte, terwijl verscheidene histonmodificaties, RNA polymerase II en co-factoren zijn succesvol gedetecteerd met deze methode 30,35, kunnen immuno-kleuring van andere nucleaire eiwitten worden uitgevoerd nadat de DNA hybridisatie FISH 4.
3D beeldanalyse kunnen omvatten het gebruik van verschillende microscopen, breedveld epifluorescentie (gekoppeld aan deconvolutie) en confocale laser microscopie 36. De keuze van de beeldvormende werkwijze hangt namelijk af van de resolutie, het aantal fluoroforen, de diepte van de monsters en de kwaliteit van het DNA en eiwit signalen. De ontwikkeling van nieuwe hoge-resolutie microscopen opent een geheel nieuwe weg in de nauwkeurige visualisatie van de nucleaire en cellulaire processen 37-39. Verder zijn er nieuwe technieken voor de generation mogelijk van op maat gemaakte sondes die geen herhalende sequentie bevatten de schone detectie van genomische regio's, van een 15-kb specifieke locus, tot complexe pools van exonen 40. Dit verhoogt de nauwkeurigheid en gevoeligheid van hoge resolutie microscopisch volgen van de dynamiek van nucleaire processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We willen de leden van de Skok lab, in het bijzonder Susannah Hewitt, bedanken voor discussies en commentaar. Dit werk wordt ondersteund door de National Institute of Health subsidies R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS is een Leukemia & Lymphoma Society geleerde. JC is een Irvington Instituut Fellow van het Cancer Research Institute. MM wordt ondersteund door een National Science Foundation Grant Integratieve Graduate Onderwijs en Onderzoek Traineeship (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
