Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.
Abstract
פלורסנט כלאה באתר באמצעות בדיקות DNA על 3-ממדי גרעינים נשמרו אחרי מיקרוסקופיה confocal 3D (דגי DNA 3D) מייצג את הדרך הישירה ביותר כדי לחזות את המיקום של לוקוסים גנטיים, כרומוזומלית תתי אזורים או שטחים שלמים בתאים בודדים. סוג זה של ניתוח מספק תובנה הארכיטקטורה העולמית של הגרעין, כמו גם את ההתנהגות של לוקוסים הגנומי ספציפיים ואזורים בתוך השטח הגרעיני. Immunofluorescence, לעומת זאת, מאפשר זיהוי של חלבונים גרעיניים (ההיסטונים שונים, משתנה ומכפילי היסטון, מכונות וגורמי שעתוק, תת תאים גרעיניים, וכו '). האתגר הגדול בשילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D הוא, מצד אחד לשמר epitope זוהה על ידי הנוגדן כמו גם ארכיטקטורת 3D של הגרעין, ומצד שני, על מנת לאפשר את החדירה של הבדיקה DNA כדי לזהות לוקוסים גנטיים או טריטוריות כרומוזום 1-5. כאן אנו מספקים פרוטוקול שמשלב הדמיה של שינויי הכרומטין עם לוקוסים הגנומי גרעינים נשמרו 3D.
Introduction
מנגנוני ממסד epigenetic הדק וירושה של פרופילי תעתיק ספציפיים התפתחותיים ותא מסוג. ברמה אחת זה כרוך אפנון של אריזת הכרומטין שמגדירה אזורים גנטיים פעילים או שקטים. בקנה מידה גדול יותר, ארגון 3D הגלובלי של הגנום גרעיני והאדריכלות גם לשחק תפקיד בשליטה על דפוסי תעתיק. לפיכך, נתיחה של תכונות epigenomic אלה חיוני להבנה מלאה של איך גנים מוסדרים 6-11.
שילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D מספקים הזדמנות ייחודית כדי להשלים ניתוחים מולקולריים והביוכימי ידי הערכת אינטראקציות / עמותות של רצפי DNA ו / או חלבונים בתוך הגרעין ספציפיות. יתר על כן, אילו טכניקות תפוקה גבוהה הגנום כגון הכרומטין immunoprecipitation (שבב ואילך) או קונפורמציה לכידת כרומוזום בשילוב עם רצף עמוק (4C-seq, 5C, Hi-C) מספקות dat הגלובליעל אוכלוסיות תאים 12, טכניקות דגי immunofluorescence / דנ"א לאפשר ניתוחים ברמת התא הבודדה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחי 3D (חיסוני דגי 3D). היתרון של פרוטוקול זה הוא ההדמיה המשולבת של דנ"א ושימור של מבנים חלבוניים. הניסיון שלנו בתחום זה אפשר לנו לשפר ולפשט את פרוטוקולים קיימים. למרות שיש לנו להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הפסקות גדילי הדנ"א כפולים בהלימפוציטים עוברים רקומבינציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים אחרים וסוגי תאים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תיוג DNA Probe עם fluorophores: ניק תרגום (~ 6 שעות)
- נקי BAC-DNA (שהוכן על ידי מקסי הכנה) או פלסמידים או מוצרי PCR, כל resuspended בH 2 O, יכול לשמש לתיוג. שים לב שעבור אות דג חזקה, בדיקות צריכות לכלול לפחות 10 ק"ג.
- דגירת DNA בRNase למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (כל ריאגנטים מופיעים בטבלת 1).
- דגירת תגובת תרגום הכינוי ל2 שעות ב 16 ° C (ראה לוחות 2 ו 3). שיטות חלופיות של תיוג ישיר ניתן להשתמש (לדוגמה: לדג, Invitrogen).
- לנטרל את התגובה לשעה אחת ב-80 ° C או הלילה ב -20 ° C.
- לקבוע את גודל חללית על 2% agarose ג'ל. המריחה צריכה להיות בין 100 ל 1000 נקודתי בסיס, עם הרוב בכ 300-500 נקודתי בסיס (שים לב שכתם Cy5-בדיקות אינו גלוי). אם ה-DNA אינה מתעכל מספיק, יותר DNA פול ואניDNase אני יכול להוסיף לתגובה וטופחתי לשעות ועוד שתיים על 16 ° C.
- לטהר את בדיקות על 0.025 מסנני מ"מ בשתי כוסות ליטר מלא עם H 2 0 לשתיים שעות בחושך.
- הוסף לגורמים החוסמים את הבדיקות כדלקמן: 10 מיקרוגרם של ה-DNA Cot-1, 10 מיקרוגרם של ה-DNA וHybloc 100 מיקרוגרם של זרע סלמון ל10 מיקרוגרם של בדיקות DNA. בדיקות DNA חנות ב -20 ° C.
2. בדיקת רטיבות / denaturation / חישול קדם (שעתי 3-4)
- בין 0.3 מיקרוגרם ומיקרוגרם 1 מתוך הבדיקה DNA משמש לcoverslip. בדיקות לערבב עם 0.1 נפח של 3M NaAc (pH 5.2) ו -2.5 כרכים של 100% אתנול, דגירה במשך שעה אחת ב-80 ° C או הלילה ב -20 ° C וספין למטה ב13000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שים לב שהסכום של הבדיקה DNA עשוי להיות מותאם בהתאם לאיכות של ה-DNA ובאזור הגרעיני של הכלאה. שיטות חלופיות של תיוג ישיר עשויות לאפשר שימוש בכמויות מופחתות שלחללית. לצורך זיהוי של אותות דגי DNA מרובים על שקופית אחת, הבדיקות השונות ניתן זרזה יחד (למעט בדיקות שלא צריך להיות מראש annealed, כמו רצפים חוזרים). בדיקות עבור מספר ניסויים שבוצעו באותו הזמן ניתן גם זרזה יחד. פלטות צריכות להיות צבעוניות בקלילות על פי fluorophores משמש (אם כמויות קטנות של בדיקות הם זרזו, הגלולה לא יכולה להיות גלויה).
- כדורים יבשים וresuspend אותם בחיץ הכלאה 15 μl (ראה טבלה 4) לcoverslip עם רועד (באמצעות אפנדורף thermomixer) בחושך ב37-45 מעלות צלזיוס (כ 20 דקות).
- בדיקות לפגל ל5 דקות ב75-95 ° C.
- טרום anneal בדיקות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. אורכו של חישול מראש עשוי להיות מותאם בהתאם למורכבות והאיכות של הבדיקות.
- החל בדיקות לcoverslips להכלאה בין הלילה (ראה סעיף 3).
3. 3דגים ממדיים DNA - היום הראשון (~ 3 שעות)
- תאים שאינם חסידים מרוכזים בנפח קטן של 1x PBS (~ 2x10 5 תאים ב1x PBS μl 5-10 לcoverslip) והפילו במרכז coverslip מצופה פולי-L-ליזין. תאי חסיד צריכים להיות מתורבתים בcoverslips לפחות 24 שעות (~ מפגש 70%) (coverslips יכול להיות מצופה עם 0.1% ג'לטין). 18x18 ל24-24 coverslips מ"מ המרובע מונחים בצלחות 6-כן, ובכל רחבי הפרוטוקול, 2 מ"ל של כל פתרון משמש גם ל( 1.5 המ"מ coverslips לחלופין עגול יכולה להיות ממוקם בצלחות 12/24-well).
- תקן תאים בparaformaldehyde 2% / 1x PBS, 7-7.4 pH, למשך 10 דקות בRT (מניות PFA 4% ניתן aliquoted, מאוחסן ב -20 ° C). Paraformaldehyde ניתן לרכוש בתמיסה (16%), או פתרוני מניות 4% יכולים להיות מוכן מאבקה / prills. אבקת Paraformaldehyde מומסת ב1x PBS ב> 60 ° C (pH ניתן להעלות 8-9 כדי להקל על פירוק), מקורר על קרח, להתאיםאד החומציות 7-7.4, מסונן aliquoted בבזים ואוחסנו במשך שבועות ב -20 ° C.
- אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, permeabilize תאים בקרח קר 0.4% Triton-X-100 / 1x PBS למשך 5 דקות על קרח. אורך permeabilization יכול להיות מותאם בהתאם לתא מסוג NB:. אם דגי DNA הוא בשילוב עם immunofluorescence, immunostaining יש לבצע בשלב זה (ראה סעיף 4).
- אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, תאי אינקובטורים עם 0.1 מיקרוגרם / μl RNase ב1x PBS לשעה 1 ב 37 ° C. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 100 μl של פתרון בparafilm או שקופית בתא לח. Coverslips מכן הוציא בזהירות עם מלקחיים. אם כל התנגדות הוא נתקל, coverslips צריך להיות מוצף ב1x PBS כדי למנוע ניזק לתאים.
- אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, permeabilize תאים בקרח קר 0.7% Triton-X-100 / 0.1 מ 'HCl למשך 10 דקות על קרח.
- אחרי שלוש שטיפותייn 1x PBS, תאים לפגל ב1.9 מ 'HCl למשך 30 דקות ב RT. לחלופין, תאים ניתן מפוגלים ב50% פוראמיד / 2x SSC ב75-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות. שימו לב שאורך הכלאה (וטמפרטורה) יכול להיות מותאם בהתאם לתא מהסוג.
- אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS קר כקרח, להכליא תאים עם בדיקות במהלך לילה על 37 מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 15 μl של חללית בשקופית, ונחתם במלט גומי.
4. 3-ממדי חיסוני-FISH - היום הראשון (~ 6-7 שעות)
- לדגים בשילוב immunofluorescence / DNA, אימונו-מכתים צריכות להתבצע לאחר permeabilization ב0.4% Triton-X-100 (שלב 3.3).
- דגירת תאים בחסימת פתרון למשך 30 דקות ב RT (2.5% שור אלבומין (BSA), 10% סרום עיזים רגיל, 0.1% Tween-20). פתרון החסימה מסונן, aliquoted ב1.5 Eppendorfs מ"ל ומאוחסן למ 'onths ב -20 ° C.
- דגירת תאים עם הנוגדן הראשוני שהועלה נגד החלבון או שינוי היסטון עניין דילול בפתרון חסימה, לשעה אחת בRT בתא לח. כאן אנו מראים דוגמה של נוגדנים נגד-139 סרין phosphorylated של H2AX (γ-H2AX, Millipore; ראה טבלה 5 לפרטים נוספים). Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 100 μl של פתרון בparafilm או שקופית בתא לח. Coverslips מכן הוציא בזהירות עם מלקחיים (מוצף 1x PBS במידת צורך). שים לב שהדילול ואורך דגירה יכולים להיות מותאם בהתאם לאיכות של הנוגדנים ותאים של סוגים.
- שטוף תאים ב0.2% BSA / 0.1% Tween-20 / 1x PBS, שלוש פעמים 5 דקות בRT עם רעד.
- דגירת תאים עם הנוגדן המשני fluorophore מצומדות המתאים דילול בחסימת פתרון לשעה אחת בRT בחדר חשוך ולח. כאן אנו מראים דוגמה לזיהוי עםנוגדן עז משני אנטי עכבר (אלקסה פלואוריד 488 או 555, Invitrogen; ראה טבלה 5 לפרטים נוספים). נוגדנים משניים Hapten-מצומדות (ביוטין, digoxigenin, וכו ') יכולים לשמש גם. במקרה זה, צעד נוסף לגילוי נאות (streptavidin, נגד חפירות, וכו ') יכול להתבצע לפני או אחרי על לילה הכלאת DNA-FISH.
- יש לשטוף את תאים ב0.1% Tween-20 / 1x PBS, שלוש פעמים 5 דקות בRT עם רועד בחושך.
- תאים שלאחר התיקון בparaformaldehyde 2% / 1x PBS עבור 10 דקות ב RT בחושך.
- המשך דגי DNA כאמור לעיל מהדגירה בRNase (שלב 3.4).
5. דנ"א 3-ממדי דגים / חיסוני-FISH - היום השני (~ 2 שעות)
- מוציא בזהירות בטון גומי, coverslips מבול עם 2x SSC, להסיר בזהירות עם מלקחיים ולמקם אותם בבארות המכילות תמיסת שטיפה.
- שטוף תאים ב2x SSC למשך 30 דקות ב 37 ° C בחושך עם רעד.
- שטוף תאים ב2x SSC למשך 30 דקות ב RT בחושך עם רעד.
- שטוף תאים ב1x SSC למשך 30 דקות ב RT בחושך עם רועד שימו לב כי במקרה של denaturation עם פוראמיד, מתרחצת צריך להיות מוחלף על ידי הבא:. כביסות 3 ב 50% פוראמיד / 2x SSC ו 3 כביסות ב2x SSC, 5 דקות כל אחת, ב 37 ° C.
- הר בתאים להאריך בינוני גוברים זהב מכיל 1.5 מיקרוגרם / המ"ל DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) לcounterstaining של DNA המוחלט. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 10-15 μl של הרכבה בינונית בשקופית וחתומה בציפורניים. שקופיות נשמרות לחודשים ב -20 ° C.
6. מיקרוסקופיה וניתוח 3D
- תמונות 3D ניתן לרכוש עם מיקרוסקופ מערכות שונות. בניסויים שלנו, חלקים אופטיים מופרדים 0.3 מיקרומטר נאספים על מערכת Leica SP5 confocal AOBS (Beam ספליטר Acousto-אופטי). שימו לב שההפרדה בין opticaמטוסי הליטר יכולים להיות מותאמים בהתאם לסוג הניתוח.
- ערימות של תמונות 3D ניתן לנתח באמצעות תוכנות וכלים שונים. אנו משתמשים בתוכנת J תמונה כדי להעריך מדידות מרחק בין לוקוסים של ריבית ולנתח סוגים שונים של עמותה של הלוקוסים של ריבית עם תאים תת גרעיניים או חלבונים.
- כל הניתוחים הסטטיסטיים מבוצעים כדי להשוות בין שניים (או יותר) תנאים ביולוגיים שונים עם pairwise הערכה (הים) משמעות: השוואה בין סוגי תאים שונים או בשלבים, השוואה בין מוקדי עניין שונים. בכל המבחנים הסטטיסטיים, P-ערכי ≤ 5.00E-2 (= 0.05) נלקחים להיות משמעותי (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * משמעותיים; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * משמעותי מאוד, P <1.00E-3 *** מאוד משמעותי).
ניתוח סטטיסטי של ההתפלגות השלמה של מרחקים בין שני אללים. אנחנו ג 1onstruct עקומות תדר הפצה מצטברות על פני כל טווח המרחקים שנמדדו בין 2 alleles.To להעריך את החשיבות של הבדלים בהפצות של מרחקים אמפיריים בין allelic אנו משתמשים פרמטרית שתי מדגם קולמוגורוב סמירנוב-המבחן (KS) 13,14.
ניתוח סטטיסטי של קשר הדוק (כלומר זיווג) של שני האללים באמצעות מרחק אופטימלי חתוך. כדי לזהות המגוון של רוב ההבדלים חזקים במרחקים בין שני אללים או לוקוסים, אנו משתמשים בסדרה של שני זנב מבחן פישר מדויק 15 שניות. כלומר, בכל מרחק שנמדדנו לבדוק אם תנאי אחד הוא ייצוג יתר משמעותי במרחקים קצרים יותר בין שתי דגימות. המינימום בהפצה של P-ערכים מציין את הטווח של מרחקים שאמורים להיחשב כחתוכים לעמותה קרובה (כלומר זיווג) של שני אללים. בהמשך הבדיקה המדוקדקת של שני זנבות הפישר משמשת to להעריך את המשמעות של זיווג של שני אללים בערך זיהה החתך 15. תיקוני בדיקות מרובים שיחולו בחשבון למספר הכולל של בדיקות שבוצעו פישר 16.
ניתוח סטטיסטי של עמותה של מוקד העניין עם תאים תת גרעיניים או חלבונים. מבחן דו זנב פישר המדויק משמש ללנתח את המשמעות של קשר בין מוקד העניין עם תאים או חלבונים 15 שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ה-DNA וחיסוני דגים רגילים במעבדת Skok ללמוד את השינויים בארגון גרעיני הקשורים בתהליך של רקומבינציה V (D) J של לוקוסי קולט אנטיגן במהלך פיתוח הלימפוציטים B ו-T. הטכניקות המפורטות לעיל תאפשרנה לנו i) למדוד מרחקים בין שני הקצוות של לוקוס (התכווצות) ii) למדוד מרחקים בין האללים (לוקוסים או זיווג), III) לנתח את הניזק לדנ"א מתרחש בתוך לוקוסים, ד) להעריך את מיקומו של אללים ולוקוסים ביחס לגרעיניים תת מדורים (heterochromatin pericentromeric המדכא במחקר שלנו), וV) להעריך את הקשר בין החלבונים גרעיניים באללים ולוקוסים (עמותה של היסטון γ-H2AX phosphorylated במחקר שלנו). בפרט, אנו נתחנו את התפקיד של דינמיקת לוקוס בוויסות של רקומבינציה V (D) J של לוקוסי אימונוגלובולין בפיתוח תאי B 17-30, וברגולציה של מחויבות בין שושלת מהסוג CD4 + וCD8 + Tתאים 14. אנחנו גם הערכנו ניזק לדנ"א באחד מלוקוס רצפטור תא T, TCRA / ד, בפיתוח תאי T הנושאים צורת מוטציה של חלבון RAG2 31 recombinase.
איור 1. ניתוח של מרחקים בין שני אללים או לוקוסים. () סעיפי confocal מראים אללים מזווגים (מימין) או לזווג מייצגים (משמאל) בגרעינים בודדים. בדיקת FISH DNA נוצרה מBAC (~ 200 KB) הפורש המוקד של עניין. מרחקים בין האללים נמדדו בין מרכז המסה של כל אות BAC בערימות של תמונות 3D. מעגלים מקווקווים מתארים צורות גרעין. ברי קנה מידה = 1 מיקרומטר. (ב) עקומת התפלגות תדירות מצטברת המראה את כל טווח המרחקים בין אלל 2 זה נמדד בשני תנאים ביולוגיים שונים (פרא מסוג לעומת מוטציה). שני מדגם בדיקת פרמטרית KS שמשה להערכת החשיבות של ההבדלים בין שתי הפצות. הטווח של רוב ההבדלים חזקים במרחקים בין allelic הוערך באמצעות סדרה של בדיקות מדויקות פישר 2 זנב (נקודות כחולות). הערכים-P החזקים ביותר (נקודות גבוהות יותר) נמצאו למרחקים ברחבי 1 מיקרומטר. כך החתך לעמותה קרובה (כלומר זיווג) של שני אללים הוקם ב1 מיקרומטר. (ג) עקומות תדירות מצטברות המראות את המרחקים בין שני אללים 0-1.5 מיקרומטר בשני התנאים הביולוגיים השונים. המשמעות של זיווג של שני אללים הוערכה באמצעות המבחן המדויק של שני זנב הפישר לחתך ב1 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
n עמודים = "תמיד"> 
איור 2. ניתוח של מיקום מוקד יחסי לתאים תת גרעיניים. במחקרים שלנו לנתח את הקשר בין מוקדי העניין שלנו ואת התא תת הגרעיני המדכא נוצר על ידי heterochromatin pericentromeric (PCH) 32. אללים נחשבים ממוקם בPCH כאשר אות BAC למוקד העניין היא סמוכה או חופף עם אות γ-הלווין שhybridizes לPCH (ללא פיקסל בבין הקצוות של BAC ואותות דגי DNA γ לווינים). סעיפי confocal נציג המיקום של אללים יחסית לPCH TCRA: (למעלה) לא אלל ממוקם בPCH, (מזרח) אלל אחד בPCH, (תחתון) שני אללים בPCH. לוקוס באדום; וγ-לווין בלבן. חצים צהובים מראים את האללים הממוקמים בPCH. מעגלים מקווקווים מתארים צורות גרעין. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר.
איור 3. ניתוח של העמותה של חלבונים גרעיניים ושינויי היסטון על מוקד. (א) במחקרים שלנו לנתח את הקשר בין מוקדי העניין שלנו וצורת phosphorylated של H2AX היסטון (γ-H2AX), לקריאה לצאת להדנ"א כפול הפסקות תקועות 33. סעיפי confocal להראות דוגמאות של לא γ-H2AX עמותה (למעלה) או התאגדות באלל אחד TCRA (תחתון) בגרעינים בודדים. אללים הוגדרו כקשור לγ-H2AX אם אותות BAC וimmunofluorescence המוקדים היו לפחות חפפו באופן חלקי (פיקסל לפחות אחד מcolocalization). לוקוס מוצג באדום וγ-H2AX בלבן. מעגלים מקווקווי המתווה nצורות ucleus. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. יש לשים לב כי ניתוחי colocalization של אות BAC עם PCH או γ-H2AX מוקדים מבוצעים באופן ידני באמצעות תוכנת J תמונה ללא סף אוטומטי. (ב) איבוד חלק מאות γ-H2AX לאחר denaturation הוא אחת השאלות הטכניות העיקריות שהועלה על ידי פרוטוקול זה חיסוני דנ"א דגים. כאן אנו מראים דוגמה של immunofluorescence לפני (למעלה) ואחרי (למטה) טיפול denaturation HCl מבוסס (פוראמיד הטיפול נתן תוצאות דומות (לא מוצג)). למרות שהאות הייתה חלשה יותר, את המאפיינים העיקריים של הכתמים, בפרט במספר המוקדים, נותרים גם לאחר הטיפול. שימוש SP5 confocal ליקה, ההגדרות עבור 561 ליזר לפני ואחרי denaturation היו הבאות: חשמל 35% / רווח חכם ב730V, ו 45% כוח / רווח חכם ב750v, בהתאמה. יתר על כן, אנו מציגים כאן דוגמה לצביעת immunofluorescence למ 'היסטון אחרodification, H3K27me3 (לוחות מימין) מראה כי פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סימני היסטון אחרים, כפי שכבר פורסם בעבר 1,3. γ-H2AX מוצג בצהוב וH3K27me3 באדום. מעגלים מקווקווים מתארים צורות גרעין. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
| שם מגיב / חומרים | חברה | מספר Catalogm | תגובות |
| H 2 O | דיג | # BP2470 | |
| RNase | סיגמא | # R4642 | |
| dNTP | סיגמא | # DNTP100 | |
| אלקסה dUTP | Invitrogen | #C11397 ל-C-11401 | |
| Cy3 או Cy5 dUTP | דיג | # 45-001-xxx | |
| אני DNase | רוש | # 04536282001 | |
| DNA פול אני | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 מסנני מיקרומטר | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1-DNA 1 מ"ג / מ"ל | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 מ"ג / מ"ל | אפלייד גנטיקה | # MHB | |
| זרע סלמון | סיגמא | # D1626 | האבקה לresuspended ב 10 מ"ג / מ"ל בH 2 O |
| NaAc (נתרן יצטט, pH 5.2, פתרון חיץ) | סיגמא | # S7899 | |
| Ficoll 400 (מול כיתת Biol) | דיג | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (מול כיתת Biol) | דיג | # BP431 | |
| אבקת סולפט dextran | סיגמא | # D8906 | |
| (מלוח סודיום פוספט-EDTA) 20x פתרון SSPE | דיג | # BP1328 | |
| פוראמיד | דיג | # BP227 | |
| Coverslips | דיג | # 12-548-B | |
| שקופיות | דיג | # 12-550 | |
| צלחות 6-כן | דיג | # 0720080 | |
| PBS, 10x | דיג | # MT-46-013-CM | |
| סיגמא | # P8920 | ||
| Paraformaldehyde, prills, 95% | סיגמא | # 441244 | |
| טריטון-X-100, מול Biol כיתה | סיגמא | # T8787 | |
| BSA (אלבומין סרום שור) Fraction V | דיג | # BP 1600 | |
| סרום עיזים רגיל | מעבדות וקטור | # S-1000 | |
| Tween-20, מול Biol כיתה | סיגמא | # P9416 | |
| SSC (ציטראט נתרן המלוח) 20x פתרון | דיג | # BP1325 | |
| להאריך מגיב antifade זהב | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) | סיגמא | # D9542 | |
| המלט הטוב ביותר מבחן אחד מעייל גומי | חנויות לציוד אומנות או במשרד |
טבלת 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד קטן.
| NT עם dUTP יחד עם Alexa-fluorophores | הסכום | ריכוז סופי |
| 10 מיקרוגרם דנ"א | X μl | |
| RNase - 0.17 מיקרוגרם / μl | 10 μl | |
| H 2 O | מלא עד 260 μl | |
| 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס - סך הכל | 260 μl | |
| חיץ NT 10x | 50 μl | 1x |
| 100 מ"מימ ולהיותת"א;-mercaptoethanol | 50 μl | 10 מיקרומטר |
| dNTP תמהיל | 40 μl | 40 מיקרומטר כל dNTP |
| 0.1 המ"מ dTTP | 50 μl | 10 מיקרומטר |
| 1 המ"מ אלקסה dUTP | 12 μl | 30 מיקרומטר |
| DNase (עובד פתרון, ראה טבלה בהמשך) | 30 μl | |
| DNA פול אני | 7.5 μl | 15 U / ml |
| סה"כ - 2 שעות בשעת 16 ° C | 500 μl | |
| NT עם dUTP יחד עם Cy3 או Cy5 | הסכום | ריכוז סופי |
| 10 מיקרוגרם דנ"א | X μl | |
| RNase - 0.17 מיקרוגרם / μl | 10 μl | |
| H 2 O | מלא עד 300 μl | |
| 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס - סך הכל | 300 μl | |
| חיץ NT 10x | 50 μl | 1x |
| 100 מ"מימ β-mercaptoethanol | 50 μl | 10 מיקרומטר |
| dNTP תמהיל | 50 μl | 50 מיקרומטר כל dNTP |
| 1 mM Cy3 או Cy5-dUTP | 12 μl | 30 מיקרומטר |
| אני DNase | ~ 30 μl | ~ 1.2 U / μl |
| DNA פול אני | 7.5 μl | 15 U / ml |
| סה"כ - 2 שעות בשעת 16 ° C | 500 μl |
טבלה 2. RNase טיפול ותרגום לניק DNA מיקרוגרם 10.
| פתרונות | מניות | |
| RNase | עבודת פתרון: 0.17 מיקרוגרם / μl | מורכב טרי |
| חיץ NT 10x: | 0.5m טריס-HCl, pH 8, 50 מ"מ MgCl 2; 0.5 מ"ג / המ"ל BSA | 1.5 צינורות מ"ל ב -20 ° C. |
| dNTP לערבב: | dATP, dCTP, וdGTP: 0.5mm כל אחד בH 2 O | 1.5 צינורות מ"ל ב -20 ° C |
| DNase: | פתרון מלאי: מחדש ב20000 U / ml ב20 מ"מ טריס pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | 0.5 צינורות מ"ל ב -20 ° C |
| עבודת פתרון: כל קבוצה החדשה של פתרון מניות DNase אני צריכה להיבדק בדילולים שונים (10 U / מ"ל, 20 U / מ"ל ו 40 U / ml בH 2 O). הדילול נותן למרוח DNA בין 100 ל 1000 נ"ב (ראהצעד 5) אמור לשמש כפתרון עובד. | מורכב טרי |
לוח 3. פתרונות לRNase טיפול ותרגום ניק.
| חיץ הכלאה | פתרונות | מניות | |
| 10% | הפתרון של 50x Denhardt: | 1 גרם Ficoll 400, 1 גרם polyvinylpyrrolidone ומ"ל 2 0 H 100 - מסונן | 50 מ"ל בז ב -20 ° C |
| 40% | 25% סולפט dextran: | אבקת סולפט dextran מומסת ב12.5x SSPE ב37-65 מעלות צלזיוס | 50 מ"ל בז ב -20 ° C |
| 50% | פוראמיד | בקבוקים על 4 מעלות צלזיוס | |
| Aliquots ב1.5 Eppendorfs מ"ל מאוחסנים ב -20 &מעלות; C | |||
לוח 4. חיץ הכלאה.
| נוגדנים | ספק | מספר קטלוגים | מהילה |
| γ-H2AX - H2A.X phospho, שיבוט JBW301, עכבר חד שבטי | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, שיבוט, הארנב polyclonal | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa פלואוריד 555 חמור נגד העכבר | Invitrogen | #-31570 | 1/500 |
| Alexa פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר | Invitrogen | #-11001 | 1/500 |
| Alexa פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב | Invitrogen | #-11008 | 1/500 | </ P>
טבלת 5. נוגדנים ראשוניים ומשניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקות המפורטות לעיל שמשו במעבדה שלנו לנתח את הרגולציה של רקומבינציה V (D) J של אימונוגלובולין ולוקוסי TCRA / ד בפיתוח לימפוציטים 30,31. אנו בטוחים כי טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לזיהוי של חלבונים שונים גרעיניים, תאים גרעיניים ולוקוסים, בסוגי תאים שונים. שינויים של הפרוטוקול עשויים להיות נחוצים, ובמקרה הזה את השלבים העיקריים שיש להתמקד בם הבאים. ראשית, אורך permeabilization יכול להיות מותאם בהתאם לתא מהסוג. שנית משך דגירת הנוגדן הראשונית יכול גם להיות מותאם על פי האיכות של הנוגדן והשפע של החלבון של עניין (לדוגמה במקרים מסוימים, ייתכן שתבוצע דגירת הלילה ב 4 ° C). חשוב לציין, צעד denaturation יכול להיות מותאם, וטיפול HCl עשוי להיות מוחלף על ידי denaturation בפוראמיד 3,4,34 וNaOH לדגי DNA 20. גם לחזורמחזורי הקפאת הפשרת ed של חנקן נוזלי יכולים להיות מיושמים על התאים לאחר קיבוע / permeabilization לדגי הדנ"א לבד 4,34. לבסוף, תוך מספר שינויי היסטון, RNA פולימראז II ועמיתים לגורמים שזוהו בהצלחה באמצעות שיטה זו 30,35, חיסוני מכתים עבור חלבונים גרעיניים אחרים ניתן לבצע לאחר הכלאת דגי DNA 4.
ניתוח התמונה 3D יכול להתבצע תוך השימוש בסוגים שונים של מיקרוסקופים, כולל epifluorescence שדה רחב (בשילוב עם deconvolution) ומיקרוסקופ ליזר confocal 36. הבחירה של שיטת ההדמיה תהיה תלוי ברזולוציה הנדרשת, מספר fluorophores, המעמיק של הדגימות והאיכות של אותות דנ"א וחלבון. הפיתוח של מיקרוסקופים חדשים ברזולוציה גבוהה נפתח שדרה חדשה לחלוטין בהדמיה המדויקת של תהליכים גרעיניים וסלולריים 37-39. יתר על כן, טכניקות חדשות לgeneration של בדיקות בהזמנה אישית שאינו מכילות רצף חוזר יאפשר זיהוי הנקי של אזורים גנטיים, מלוקוס 15-KB ספציפי, לברכות מורכבות של אקסונים 40. זה מגדיל את הדיוק והרגישות של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במעקב אחר הדינמיקה של תהליכים גרעיניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי Skok המעבדה, במיוחד סוזנה יואיט, לדיונים והערות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS הוא לוקמיה ולימפומה חוקר חברה. JC הוא עמית אירווינגטון מכון לחקר הסרטן. MM נתמך על ידי קרן לאומי למדע חינוך גרנט אינטגרטיבית בוגר והמחקר Traineeship (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
