Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por imunofluorescência e seqüências de DNA por FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D FISH imuno-DNA).
Abstract
Hibridização fluorescente in situ utilizando sondas de DNA em 3-dimensionalmente núcleos preservados seguido por microscopia confocal 3D (3D FISH DNA) representa a forma mais direta de visualizar a localização de locos gênicos, cromossômica sub-regiões ou territórios inteiros em células individuais. Este tipo de análise fornece insights sobre a arquitetura global do núcleo, bem como o comportamento de loci genômicos e regiões específicas dentro do espaço nuclear. Imunofluorescência, por outro lado, permite a detecção de proteínas nucleares (histonas modificados, variantes de histonas e modificadores, maquinaria de transcrição e factores nucleares, sub-compartimentos, etc.) O principal desafio na combinação FISH DNA imunofluorescência e 3D é, por um lado, para preservar o epitopo detectada pelo anticorpo, bem como a arquitectura 3D do núcleo, e, por outro lado, para permitir a penetração da sonda de ADN para detectar locos gênicos ou territórios cromossômicos 1-5. Aqui nós fornecemos um protocolo que combina visualização de modificações da cromatina com loci genômicos em núcleos preservados 3D.
Introduction
Estabelecimento de mecanismos epigenéticos gatilho e herança de desenvolvimento e de células do tipo perfis específicos de transcrição. Em um nível, este envolve a modulação da embalagem da cromatina, que define as regiões genômicas ativas ou em silêncio. Numa escala maior, a organização 3D global do genoma e arquitectura nuclear também desempenhar um papel no controlo da transcrição de padrões. Assim, o esvaziamento desses recursos epigenômico é essencial para um entendimento completo de como os genes são regulados 6-11.
FISH DNA combinado imunofluorescência e 3D fornecem uma oportunidade única para complementar análises moleculares e bioquímicos, avaliando interacções específicas / associações de sequências de ADN e / ou proteínas dentro do núcleo. Além disso, enquanto do genoma técnicas de alto rendimento, como cromatina imunoprecipitação (CHIP-seq) ou conformação cromossomo captura juntamente com o seqüenciamento de profundidade (4C-seq, 5C, Hi-C) fornecer dat mundialuma população de células em 12, técnicas de imunofluorescência / ADN FISH permitir análises ao nível da célula individual.
Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por seqüências de DNA por imunofluorescência e FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D imuno-FISH). A vantagem deste protocolo é a visualização conjunta de DNA e preservação de estruturas de proteínas. A nossa experiência neste campo nos permitiu melhorar e simplificar os protocolos existentes. Apesar de termos utilizados neste protocolo para a detecção de ADN de cadeia dupla em intervalos linfócitos submetidos a recombinação, este método pode ser aplicado a outras proteínas e de outros tipos de células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Labeling Sonda com fluoróforos: Nick Tradução (~ 6 horas)
- Limpeza BAC DNA (preparado por maxi-prep) ou plasmídeos ou produtos de PCR, todos ressuspenso em H 2 O, podem ser utilizados para a rotulagem. Note-se que para um sinal de FISH robusto, as sondas devem abranger pelo menos 10 kb.
- Incubar DNA em RNase A durante 30 min a 37 ° C (todos os reagentes estão listados na Tabela 1).
- Incubar a reacção de tradução de nick durante 2 horas a 16 ° C (ver Tabelas 2 e 3). Os métodos alternativos de marcação directa pode ser utilizado (exemplo: Tag FISH, Invitrogen).
- Inactivar a reacção durante uma hora à temperatura de -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C.
- Determinar o tamanho da sonda sobre um gel de agarose a 2%. O esfregaço deve estar entre 100 e 1000 pb, com a maioria a cerca de 300-500 pb (Note-se que a mancha de Cy5 sondas não é visível). Se o DNA não é digerida suficiente, mais DNA Pol I eDNase I pode ser adicionado à mistura reaccional e incubou-se durante mais duas horas a 16 ° C.
- Purifica-se as sondas de 0,025 milímetros filtros em duas provetas de litros cheio com H 2 0 por duas horas no escuro.
- Adicionar factores de bloqueio para as sondas como se segue: 10 ug de ADN Cot-1, 10 ug de DNA Hybloc e 100 ug de esperma de salmão de 10 ^ g de sondas de DNA. Loja de sondas de ADN a -20 ° C.
2. Probe Precipitation / desnaturação / pré-hibridação (3-4 horas)
- Entre 0,3 ug e 1 ug de DNA de sonda é usada por lamela. Sondas de mistura com 0,1 volumes de NaAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%, a incubação durante uma hora a -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C e centrifugação a 13.000 rpm para baixo a 4 ° C durante 30 min. Note-se que a quantidade de sonda de DNA pode ser ajustada em função da qualidade do DNA e da região nuclear de hibridação. Os métodos alternativos de marcação directa podem permitir a utilização de quantidades reduzidas desonda. Para a detecção de sinais de DNA várias peixe em um slide, as diferentes sondas pode ser precipitada juntos (exceto sondas que não deve ser pré-recozido, como seqüências de repetição). Sondas para várias experiências realizadas ao mesmo tempo, podem também ser precipitados juntos. Pellets deve ser levemente coloridos de acordo com os fluoróforos usados (se pequenas quantidades de sondas são precipitados, o sedimento pode não ser visível).
- Pelotas secas e ressuspender-los em 15 ul de tampão de hibridação (ver Tabela 4) por cada lamela com agitação (usando um Thermomixer de Eppendorf) no escuro a 37-45 ° C (durante cerca de 20 min).
- Sondas desnaturar durante 5 min a 75-95 ° C.
- Pré-recozer sondas, a 37 ° C durante 30-60 min. Comprimento de pré-hibridação pode ser ajustada em função da complexidade e da qualidade das sondas.
- Aplicar sondas para as lamelas para cruzamentos durante a noite (ver Seção 3).
3. 3PEIXES-dimensional DNA - Primeiro Dia (~ 3 horas)
- As células não aderentes são concentrados num pequeno volume de 1x PBS (~ 2x10 5 células em 5-10 ul de PBS 1x por lamela) e deixado cair no centro de uma lamela de poli-L-lisina revestido. As células aderentes deverá ser cultivadas em lamelas durante pelo menos 24 h (~ 70% de confluência) (lamelas podem ser revestidos com gelatina a 0,1%). Quadrados 18x18 para lamelas 24-24 mm são colocados em placas de 6 poços, e ao longo do protocolo, dois ml de cada solução é usada por poço (alternativamente redondo 1,5 mm, podem ser lamelas colocadas em placas de 12/24-well).
- Fixar as células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, durante 10 min à TA (stocks PFA a 4% pode ser dividido em alíquotas, armazenado a -20 ° C). Paraformaldeído podem ser comprados em solução (16%), ou as soluções de reserva de 4% pode ser preparada a partir de pó / grânulos. Paraformaldeído em pó é dissolvido em 1x PBS a> 60 ° C (pH pode ser aumentado para 8-9 para facilitar a dissolução), arrefecido para baixo sobre o gelo, ajustared a pH 7-7,4, filtrada, aliquotadas e armazenadas em falcões durante semanas à temperatura de -20 ° C.
- Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min em gelo. Comprimento de permeabilização pode ser ajustado dependendo do tipo de célula-NB:. PEIXES Se o DNA é combinado com imunofluorescência, a imunomarcação devem ser realizados nesta fase (ver secção 4).
- Após três lavagens em PBS 1x, as células a incubar com 0,1 ug / ul de ARNase A em 1x PBS, durante uma hora a 37 ° C. As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça. Se alguma resistência é encontrada, lamelas devem ser inundado com 1x PBS, a fim de evitar danificar as células.
- Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,7% de Triton-X-100 / HCl 0,1 M durante 10 minutos em gelo.
- Após três lavagens in 1x PBS, as células desnaturam em HCl 1,9 M durante 30 min à temperatura ambiente. Alternativamente, as células podem ser desnaturadas em formamida 50% / 2x SSC a 75-80 ° C durante pelo menos 30 min. Note-se que a hibridação comprimento (e da temperatura), pode ser optimizada, dependendo do tipo de célula.
- Após três lavagens em gelo frio 1x PBS, hibridar com sondas de células durante a noite a 37 ° C numa câmara escura e húmida. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 15 ul de sonda em um slide, e selado com cimento de borracha.
4. 3-dimensional Imuno-FISH - Primeiro dia (~ 6-7 horas)
- Por combinados FISH imunofluorescência / DNA, imuno-coloração deve ser realizada após a permeabilização em 0,4% de Triton-X-100 (Passo 3.3).
- Incubar as células em solução de bloqueio durante 30 minutos a RT (2,5% de albumina sérica bovina (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,1% de Tween-20). A solução de bloqueio é filtrado, aliquotadas em 1,5 ml eppendorfs e armazenado para meses a -20 ° C.
- Incubar as células com o anticorpo primário produzido contra a proteína ou a modificação das histonas de interesse diluído em solução de bloqueio, por uma hora, à temperatura ambiente numa câmara húmida. Aqui, mostramos o exemplo de um anticorpo contra a serina-139 fosforilada da H2AX (γ-H2AX, Millipore; Consulte a Tabela 5 para detalhes). As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça (inundado com 1x PBS, se necessário). Note-se que a diluição e tempo de incubação pode ser ajustada em função da qualidade do anticorpo e tipos de células.
- Lave as células em 0,2% BSA / 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação.
- Incubar as células com o anticorpo conjugado com fluoróforo adequado secundário diluído em solução de bloqueio durante uma hora, à temperatura ambiente numa câmara escura e húmida. Aqui vamos mostrar um exemplo de detecção com umasecundário anticorpo de cabra anti-rato (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Consulte a Tabela 5 para detalhes). Hapteno-anticorpos secundários conjugados (biotina, digoxigenina, etc) podem também ser usados. Neste caso, um passo adicional para a detecção apropriada (estreptavidina, anti-dig, etc) pode ser realizada antes ou depois durante a noite a hibridação de DNA-FISH.
- Enxaguar as células em 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação no escuro.
- Pós-fix células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x durante 10 min à RT, no escuro.
- Continuar FISH DNA como acima de incubação em RNase A (Passo 3.4).
5. 3-dimensional DNA FISH / Imuno-FISH - Segundo dia (~ 2 horas)
- Remova cuidadosamente cimento de borracha, lamínulas de inundação com 2x SSC, remova cuidadosamente com uma pinça e colocá-los em poços contendo solução de lavagem.
- Lave as células em 2x SSC durante 30 min a 37 ° C no escuro, com agitação.
- Lave as células em 2x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação.
- Lave as células em 1x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação Note-se que em caso de desnaturação com formamida, lavagens deve ser substituído pelo seguinte:. Lavagens três lavagens em 50% de formamida / SSC 2x e 3 em 2x SSC, 5 min cada, a 37 ° C.
- Montar as células em meio de prolongar a ouro de montagem contendo 1,5 ug / ml de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para contracoloração de DNA total. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 10-15 ul de meio de montagem de um slide e selado com unha polonês. As lâminas são mantidos durante meses a -20 ° C.
6. Microscopia 3D e Análise
- Imagens em 3D podem ser adquiridos com diversos sistemas de microscópio. Nas nossas experiências, secções ópticas separadas por 0,3 pm são recolhidas num AOBS SP5 Leica sistema confocal (acústico-óptico divisor de feixe). Note-se que a separação entre optical aviões pode ser ajustada dependendo do tipo de análise.
- Pilhas de imagens em 3D podem ser analisados utilizando um software diferente e ferramentas. Usamos o software Image J para avaliar medidas de distância entre loci de interesse e analisar diferentes tipos de associação dos locos de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas.
- Todas as análises estatísticas foram realizadas para comparar dois (ou mais) diferentes condições biológicas com pairwise avaliação (s) de significância: comparação entre diferentes tipos de células ou estágios, a comparação entre os diferentes loci de interesse. Em todos os testes estatísticos, valores de P ≤ 5.00E-2 (a = 0,05) estão a ser tomadas significativa (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * muito significativa, P <1.00E-3 *** altamente significativo).
A análise estatística das distribuições inteiras de distâncias entre dois alelos. Nós c primeiroonstruct curvas de freqüência acumulada em toda a faixa de distâncias entre dois alleles.To avaliar a significância das diferenças nas distribuições de empíricos inter-alélicas distâncias usamos o teste não paramétrico de duas amostras de Kolmogorov-Smirnov (KS) 13,14.
A análise estatística da associação estreita (ou seja, o emparelhamento) de dois alelos usando uma distância ideal de corte. Para identificar a gama de a maioria das diferenças robustas em distâncias entre dois alelos ou loci, usamos uma série de bicaudal teste exato de Fisher 15 s. Ou seja, em cada distância medida que testa se uma condição é significativamente sobre-representados em distâncias mais curtas entre as duas amostras. A mínima na distribuição dos valores de P indica a gama de distâncias que devem ser considerados como um ponto de corte para a íntima associação (emparelhamento ie) um dos dois alelos. Posteriormente, a bicaudal teste exato de Fisher é usado tó avaliar a importância do emparelhamento de dois alelos identificados no valor de corte 15. Correcções de teste são aplicados a contabilizar o número total de testes de Fisher realizada 16.
A análise estatística da associação entre o locus de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas. O teste de duas caudas exacto de Fisher-é utilizado para analisar a importância da associação do locus de interesse com compartimentos diferentes ou proteínas 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA e imuno-FISH são utilizados no laboratório Skok para estudar as alterações na organização nuclear associadas com o processo de recombinação V (D) J de receptor de antigénio, durante loci B e T o desenvolvimento de linfócitos. As técnicas acima descritas nos permitir i) medir distâncias entre as duas extremidades de um locus (contração) ii) medir distâncias entre alelos ou loci (emparelhamento), iii) analisar os danos no DNA que ocorrem dentro loci, iv) avaliar a localização de alelos e locos em relação ao nuclear sub-compartimentos (heterocromatina pericentromérica repressivo em nosso estudo), e v) avaliar a associação de proteínas nucleares em alelos e locos (Associação dos fosforilada histona γ-H2AX em nosso estudo). Em particular, analisamos o papel do locus dinâmica na regulação de recombinação V (D) J dos loci de imunoglobulina em células B em desenvolvimento 17-30, e na regulação do compromisso entre a linhagem T CD4 + e CD8 + Tcélulas 14. Foram também avaliadas danos no DNA, um do locus do receptor de células T, Tcra / d, no desenvolvimento de células T que transportam uma forma mutante da proteína recombinase RAG2 31.
Figura 1. Análise de distâncias entre dois alelos ou loci. (A) seções confocal mostrando representativas desemparelhados (direita) ou combinado (esquerda) alelos em núcleos individuais. A sonda de FISH DNA foi gerado a partir de um BAC (~ 200 kb) abrangendo o local de interesse. As distâncias entre os alelos foram medidos entre o centro de massa de cada sinal de BAC em pilhas de imagens em 3D. Círculos tracejadas delinear formas núcleo. Barra de escala = 1 uM. (B) as curvas de distribuição de frequências acumuladas mostrando toda a gama de distâncias entre o alelo doiss medidos em duas diferentes condições biológicas (de tipo selvagem versus mutante). O teste não paramétrico de duas amostras de teste KS foi utilizado para avaliar a significância das diferenças entre as duas distribuições. A gama de a maioria das diferenças robustas em distâncias inter-alélicas foi avaliada através de uma série de testes de dois cauda exato de Fisher (pontos azuis). Os mais robustos P-valores (pontos mais altos) foram encontrados para as distâncias a cerca de 1 m. Assim, o ponto de corte para associação estreita (emparelhamento, por exemplo) dos dois alelos foi criado em 1 mícron. (C) As curvas de frequência cumulativa mostrando as distâncias entre os dois alelos de 0-1,5 M em duas diferentes condições biológicas. O significado do emparelhamento dos dois alelos foi avaliada através do teste bicaudal exato de Fisher para um corte em 1 m. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Análise da localização de um locus em relação ao sub-compartimentos nucleares. Nos nossos estudos, analisamos a relação entre os nossos loci de interesse eo compartimento sub-nuclear repressivo formado pela heterocromatina pericentromérica (PCH) 32. Alelos são considerados localizado na PCH quando o sinal de BAC para o locus de interesse é adjacente ou sobreposta com o sinal de satélite γ-que hibrida com PCH (não de pixel entre as arestas do CCB e γ-satélite sinais de FISH de DNA). Seções confocal representante da localização de alelos Tcra relativos à PCH: (Top) alelo não localizado na PCH, (Médio) um alelo em PCH, (Inferior) dois alelos em PCH. Locus em vermelho, e γ satélite em branco. Setas amarelas mostram os alelos situados em PCH. Círculos tracejadas delinear formas núcleo. Escala da barra = 1 m.
Figura 3. Análise da associação de proteínas nucleares e modificações de histonas em um locus. (A) Em nossos estudos, analisar a relação entre nossos loci de interesse ea forma fosforilada da H2AX histona (γ-H2AX), como leitura de DNA para dupla quebras de cadeia 33. Seções confocal mostram exemplos de nenhuma associação γ-H2AX (Superior) ou associação em um alelo Tcra (Inferior) em núcleos individuais. Foram definidos como alelos associados com γ-H2AX se a sinais de BAC e imunofluorescência focos foram pelo menos parcialmente sobrepostas (pelo menos, um pixel de colocalização). Locus é mostrado em vermelho e γ-H2AX em branco. Círculos tracejadas esboço nformas ucleus. Barra de escala = 1 m. Destaca-se que as análises co-localização do sinal CCB com PCH ou γ-H2AX focos são realizados manualmente, utilizando o software Image J sem limite automatizado. (B) a perda de parte do sinal de γ H2AX após desnaturação é uma das principais questões técnicas levantadas por este protocolo FISH imuno-DNA. Aqui, mostramos um exemplo de imunofluorescência antes (em cima) e após (em baixo) de tratamento de desnaturação HCl-based (Formamida-tratamento deu resultados semelhantes (não mostrada)). Embora o sinal foi mais fraca, as características principais da coloração, em particular, o número de focos, permanecer após o tratamento. Usando uma Leica SP5 confocal, as configurações para o laser 561 antes e depois de desnaturação foram os seguintes: 35% de potência / ganho inteligente em 730V, e potência de 45% / ganho inteligente em 750V, respectivamente. Além disso, mostramos aqui um exemplo de uma técnica de imunofluorescência para outro m histonaODIFICAÇÃO, H3K27me3 (painéis da direita), mostrando que este protocolo pode ser aplicado a outras marcas de histona, tal como foi previamente publicado 1,3. γ-H2AX é mostrado a amarelo e H3K27me3 em vermelho. Círculos tracejadas delinear formas núcleo. Barra de escala = 2 m. Clique aqui para ver maior figura .
| Nome do reagente / Material | Companhia | Número Catalogm | Comentários |
| H 2 O | Pescador | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 a C-11401 | |
| Cy3 ou Cy5 dUTP | Pescador | N º 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 mM filtros | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc ADN de 1 mg / ml | Genética Aplicada | # MHB | |
| Esperma de salmão | Sigma | # D1626 | pó a serem ressuspensas a 10 mg / ml em H2O |
| NaAc (Acetato de sódio, pH 5,2, solução tampão) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol. Biol grau) | Pescador | # 525 | |
| Polivinilpirrolidona (Mol Biol grau) | Pescador | # BP431 | |
| Dextran pó de sulfato | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Solução salina-fosfato de sódio-EDTA) solução 20x | Pescador | # BP1328 | |
| Formamida | Pescador | # BP227 | |
| Lamelas | Pescador | º 12-548-B | |
| Slides | Pescador | # 12-550 | |
| Placas de 6 poços | Pescador | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Pescador | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldeído, grânulos, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grau | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Albumina de Soro Bovino) Fracção V | Pescador | # BP 1600 | |
| Soro normal de cabra | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grau | Sigma | # P9416 | |
| SSC (citrato de sódio Saline) solução 20x | Pescador | # BP1325 | |
| Prolongar reagente Antifade Ouro | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma | # D9542 | |
| Melhor teste de um cimento de borracha casaco | Abastecimento de lojas de arte ou de escritório |
Tabela 1. Reagentes específicos e pequenos equipamentos.
| NT com dUTP juntamente com Alexa-fluoróforos | Quantidade | Concentração Final |
| 10 ug de ADN | X ul | |
| RNase A - 0,17 ug / uL | 10 ul | |
| H 2 O | Preencha a 260 ul | |
| 30 min a 37 ° C - TOTAL | 260 ul | |
| Tampão NT 10x | 50 ul | 1x |
| 100 mM e serta;-mercaptoetanol | 50 ul | 10 uM |
| dNTP mix | 40 ul | 40 uM de cada dNTP |
| 0,1 mM de dTTP | 50 ul | 10 uM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 ul | 30 uM |
| DNase I (solução de trabalho, ver tabela abaixo) | 30 ul | |
| DNA Pol I | 7,5 ul | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 horas a 16 ° C | 500 ul | |
| NT com dUTP juntamente com Cy3 ou Cy5 | Quantidade | Concentração Final |
| 10 ug de ADN | X ul | |
| RNase A - 0,17 ug / uL | 10 ul | |
| H 2 O | Encher até 300 ml | |
| 30 min a 37 ° C - TOTAL | 300 ul | |
| Tampão NT 10x | 50 ul | 1x |
| 100 mM β-mercaptoetanol | 50 ul | 10 uM |
| dNTP mix | 50 ul | 50 uM de cada dNTP |
| 1 mM-Cy3 ou Cy5-dUTP | 12 ul | 30 uM |
| DNase I | ~ Ul 30 | ~ 1,2 U / uL |
| DNA Pol I | 7,5 ul | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 horas a 16 ° C | 500 ul |
Tabela 2. RNase A e tratamento de tradução Nick por 10 ug de ADN.
| Soluções | Estoques | |
| RNase A | Solução de trabalho: 0,17 ug / uL | Fez-se fresco |
| Tampão NT 10x: | 0,5 M Tris-HCl, pH 8, 50 mM de MgCl2, 0,5 mg / ml de BSA | Tubos de 1,5 ml a -20 ° C. |
| dNTP misturar: | dATP, dCTP, dGTP e: 0,5 mM de cada um de H2O | Tubos de 1,5 ml a -20 ° C |
| DNase I: | Solução stock: reconstituída a 20.000 U / ml em 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | Tubos de 0,5 ml a -20 ° C |
| Solução de trabalho: Cada novo lote de solução-mãe de DNase I deve ser testado em diluições diferentes (10 U / ml, 20 U / ml e 40 U / ml de H 2 O). A diluição que dá uma mancha de ADN entre 100 e 1000 pb (verpasso 5) deve ser utilizado como solução de trabalho. | Fez-se fresco |
Tabela 3. Soluções para tratamento RNase A e tradução Nick.
| Tampão de hibridação | Soluções | Estoques | |
| 10% | 50x solução de Denhardt: | 1 g de Ficoll 400, 1 g Polivinilpirrolidona e 100 ml de H 2 0 - Filtro | 50 ml falcon a -20 ° C |
| 40% | 25% de sulfato de dextrano: | Dextran pó de sulfato é dissolvido em 12,5 x SSPE a 37-65 ° C | 50 ml falcon a -20 ° C |
| 50% | Formamida | Garrafas a +4 ° C | |
| Alíquotas de 1,5 ml eppendorfs são armazenadas à temperatura de -20 ° C | |||
Tabela 4. Tampão de hibridação.
| Anticorpos | Fornecedor | Número de catálogo | Diluição |
| γ-H2AX - H2A.X fosfo, clone JBW301, mouse monoclonal | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, clone, policlonal de coelho | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-rato | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-rato | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-coelho | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tabela 5. Anticorpos primários e secundários.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As técnicas descritas acima foram usadas no nosso laboratório para analisar a regulação da recombinação V (D) J de imunoglobulina e Tcra / d loci no desenvolvimento de linfócitos 30,31. Estamos confiantes de que esta técnica pode ser adaptada para a detecção de várias proteínas nucleares, compartimentos nucleares e locos, em diferentes tipos de células. Modificações do protocolo pode ser necessário, e, neste caso, os passos principais para se concentrar são as seguintes. Em primeiro lugar, o comprimento de permeabilização pode ser ajustada dependendo do tipo de célula. O segundo comprimento da incubação do anticorpo primário pode também ser ajustada de acordo com a qualidade do anticorpo, e a abundância da proteína de interesse (por exemplo, em alguns casos, a incubação pode ser realizada durante a noite a 4 ° C). É importante notar que o passo de desnaturação pode ser adaptada, e no tratamento de HCl pode ser substituído por desnaturação em Formamida 3,4,34 e NaOH para ADN FISH 20. Também repetired ciclos de congelação-descongelação de azoto líquido pode ser aplicada às células após fixação / permeabilização por FISH DNA sozinha 4,34. Finalmente, embora várias modificações de histonas, RNA polimerase II e co-factores têm sido detectado com sucesso usando este método 30,35, imuno-coloração para outras proteínas nucleares pode ser realizada após a hibridação de ADN FISH 4.
Análise da imagem 3D pode envolver o uso de diferentes tipos de microscópios, incluindo de campo amplo de epifluorescência (juntamente com desconvolução) e microscopia confocal a laser 36. A escolha do método de imagem depende da resolução necessário, o número de fluoróforos, a profundidade das amostras e da qualidade dos sinais de ADN e proteína. O desenvolvimento de novos de alta resolução microscópios abre um novo caminho na visualização precisa dos processos nucleares e celulares 37-39. Além disso, novas técnicas para o generation de custom-made sondas que não contêm seqüências repetitivas de permitir a detecção limpo de regiões genômicas, a partir de 15 kb-locus específico, para complexos de piscinas exons 40. Isto aumenta a sensibilidade e a precisão de alta resolução da microscopia em rastrear a dinâmica dos processos nucleares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Skok, especialmente Susannah Hewitt, para discussões e comentários. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de bolsas de Saúde R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS é um Leukemia & Lymphoma Society estudioso. JC é um Irvington Fellow Instituto do Cancer Research Institute. MM é apoiado por um National Science Foundation Grant Integrativa Pós-Graduação Pesquisa e Estágio (NSF IGERT 0.333.389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
