Summary
Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de las modificaciones de histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH de ADN seguido por microscopía 3D y análisis (3D inmuno-ADN FISH).
Abstract
La hibridación fluorescente in situ con sondas de ADN sobre el 3-dimensional núcleos conservan seguido por microscopía confocal 3D (3D FISH AND) representa la forma más directa para visualizar la localización de loci de genes, cromosomas sub-regiones o territorios enteros en celdas individuales. Este tipo de análisis permite conocer la arquitectura global del núcleo, así como el comportamiento de los loci genómicos y regiones específicas dentro del espacio nuclear. Inmunofluorescencia, por otro lado, permite la detección de proteínas nucleares (histonas modificadas, variantes de histonas y modificadores, maquinaria de transcripción y factores nucleares, sub-compartimientos, etc.) El principal reto en la combinación de ADN FISH inmunofluorescencia y 3D es, por un lado, para preservar el epítopo detectados por el anticuerpo, así como la arquitectura 3D del núcleo, y por otra parte, para permitir la penetración de la sonda de ADN para detectar loci de genes o cromosomas territorios 1-5. A continuación presentamos un protocolo que combina la visualización de las modificaciones de la cromatina con loci genómicos en los núcleos 3D conserva.
Introduction
Epigenética establecimiento de mecanismos de disparo y la herencia de desarrollo y el tipo de células perfiles de transcripción específicos. Por un lado se trata de la modulación de la cromatina embalaje que define regiones genómicas activas o en silencio. En una escala mayor, la organización global de 3D del genoma nuclear y de la arquitectura también desempeñar un papel en el control de los patrones transcripcionales. Por lo tanto, la disección de estas características epigenomic es esencial para una comprensión completa de cómo se regulan los genes 6-11.
FISH Combinado de ADN de inmunofluorescencia y 3D ofrecen una oportunidad única para complementar los análisis moleculares y bioquímicos mediante la evaluación de las interacciones específicas / asociaciones de secuencias de ADN y / o proteínas en el núcleo. Por otra parte, mientras que en todo el genoma técnicas de alto rendimiento, tales como cromatina immunoprecipitation (CHIP-seq) o conformación cromosoma captura junto con la secuenciación profunda (4C-seq, 5C, Hi-C) ofrecen dat mundialuna en 12 poblaciones celulares, inmunofluorescencia / ADN técnicas de FISH permitir el análisis a nivel de células individuales.
Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de modificaciones de las histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH ADN seguido por microscopía y análisis 3D (3D inmuno-FISH). La ventaja de este protocolo es la visualización combinada de ADN y la preservación de las estructuras proteicas. Nuestra experiencia en este campo nos ha permitido mejorar y simplificar los protocolos existentes. Aunque hemos utilizado este protocolo para detectar ADN de doble cadena se rompe en los linfocitos sometidos a recombinación, este método se puede aplicar a otras proteínas y otros tipos de células.
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Protocol
1. Etiquetado de ADN Probe con fluoróforos: Nick Translation (~ 6 horas)
- Clean BAC ADN (preparado por maxi-prep) o plásmidos o productos de PCR, todos resuspendió en H 2 O, se puede utilizar para el etiquetado. Tenga en cuenta que para una señal de FISH robusto, sondas deberían abarcar al menos 10 kb.
- Incubar ADN en RNasa A durante 30 min a 37 ° C (Todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1).
- Incubar la reacción de traducción nick durante 2 horas a 16 ° C (véanse los cuadros 2 y 3). Los métodos alternativos de etiquetado directo puede ser utilizado (Ejemplo: Etiqueta FISH, Invitrogen).
- Inactivar la reacción durante una hora a -80 ° C o durante la noche a -20 ° C.
- Determinar el tamaño de la sonda en un 2% de gel de agarosa. La prueba debe ser de entre 100 y 1.000 pares de bases, con la mayoría en aproximadamente 300-500 pb (Tenga en cuenta que la mancha de Cy5 sondas no es visible). Si el ADN no se digiere suficiente, más ADN Pol I yDNasa I se puede añadir a la reacción y se incubaron durante dos horas más a 16 ° C.
- Purificar sondas en filtros 0,025 mm en dos vasos de precipitados litro llenos de H 2 0 durante dos horas en la oscuridad.
- Añadir factores de bloqueo para las sondas de la siguiente manera: 10 g de ADN Cot-1, 10 g de ADN Hybloc y 100 g de esperma de salmón de 10 g de sondas de ADN. Sondas de ADN Tienda a -20 ° C.
2. Probe Precipitación / desnaturalización / hibridación Pre-(hr 3-4)
- Entre 0,3 mg y 1 g de sonda de ADN se utiliza por cubreobjetos. Las sondas se mezclan con 0,1 volumen de NaAc 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%, incubar durante una hora a -80 ° C o durante la noche a -20 ° C y centrifugar a 13.000 rpm a 4 ° C durante 30 min. Tenga en cuenta que la cantidad de sonda de ADN puede ser ajustada dependiendo de la calidad del ADN y la región nuclear de la hibridación. Los métodos alternativos de etiquetado directo puede permitir el uso de cantidades reducidas desonda. Para la detección de múltiples señales de ADN de FISH en una diapositiva, las diferentes sondas pueden precipitarse juntos (excepto sondas que no deberían estar pre-recocido, como secuencias de repetición). Las sondas para varios experimentos realizados al mismo tiempo también se puede precipitar juntos. Pellets debe ser ligeramente coloreado de acuerdo con los fluoróforos utilizados (en caso de pequeñas cantidades de sondas se precipitan, el precipitado puede no ser visible).
- Pellets secos y resuspender ellos en 15 l de tampón de hibridación (véase la Tabla 4) por cubreobjetos con agitación (usando un termomezclador Eppendorf) en la oscuridad a 37-45 ° C (aproximadamente 20 min).
- Sondas desnaturalizan durante 5 minutos a 75-95 ° C.
- Pre-recocido de sondas a 37 º C durante 30-60 min. Longitud de pre-recocido puede ser ajustada dependiendo de la complejidad y la calidad de las sondas.
- Aplicar las sondas a los cubreobjetos para la hibridación durante la noche (véase la Sección 3).
3. 3Tridimensional del ADN FISH - Primer día (~ 3 h)
- Las células no adherentes se concentran en un pequeño volumen de PBS 1x (~ 2x10 5 células en 5-10 l de PBS 1x por cubreobjeto) y se dejó caer sobre el centro de un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. Las células adherentes se cultivaron en cubreobjetos durante al menos 24 horas (confluencia ~ 70%) (cubreobjetos se pueden recubrir con gelatina 0,1%). Cuadrados 18x18 a 24-24 mm cubreobjetos se colocan en placas de 6 pocillos, y durante todo el protocolo, dos ml de cada solución se utiliza por pocillo (alternativamente redondas 1,5 mm cubreobjetos se pueden colocar en placas 12/24-well).
- Fijar las células en 2% de paraformaldehído / PBS 1x, pH 7-7.4, durante 10 min a TA (4% PFA existencias puede alícuotas, se almacenó a -20 ° C). El paraformaldehído se pueden comprar en solución (16%), o 4% soluciones madre se puede preparar a partir de polvo / gránulos. Paraformaldehído en polvo se disuelve en 1x PBS a> 60 ° C (pH puede aumentarse a 8.9 para facilitar la disolución), enfriado en hielo, ajustared a pH 7-7.4, se filtró, alícuotas de halcones y almacenados durante semanas a -20 ° C.
- Después de tres enjuagues en PBS 1x, permeabilizar las células en hielo enfriado con 0,4% Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min en hielo. Longitud de permeabilización puede ajustarse dependiendo de la célula de tipo NB:. Si FISH de ADN se combina con la inmunofluorescencia, la inmunotinción se debe realizar en esta etapa (véase la Sección 4).
- Después de tres enjuagues en 1x PBS, las células se incuban con 0,1 g / l de RNasa A en 1x PBS durante una hora a 37 ° C. Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 100 l de solución en parafilm o un portaobjetos en una cámara húmeda. Los cubreobjetos son entonces cuidadosamente con fórceps. Si alguno se encuentra resistencia, los cubreobjetos se inundó con 1x PBS con el fin de evitar daños en las células.
- Después de tres enjuagues en PBS 1x, permeabilizar las células en hielo enfriado con 0,7% Triton-X-100 HCl / 0,1 M durante 10 min en hielo.
- Después de tres lavados in 1x PBS, las células desnaturalizan en 1,9 M HCl durante 30 min a TA. Alternativamente, las células pueden ser desnaturalizados en formamida / SSC 2x 50% a 75-80 ° C durante al menos 30 min. Cuenta que la longitud de hibridación (y la temperatura) puede ser optimizada en función del tipo de célula.
- Después de tres enjuagues en hielo frío 1x PBS, las células se hibridan con sondas durante la noche a 37 ° C en una cámara oscura y húmeda. Los cubreobjetos se colocan celda hacia abajo en una caída de 15 l de la sonda en un portaobjetos, y se sella con cemento de goma.
4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 h)
- Para combinar inmunofluorescencia / ADN FISH, inmuno-tinción debe realizarse después de la permeabilización en el 0,4% de Triton-X-100 (Paso 3,3).
- Se incuban las células en solución de bloqueo durante 30 min a TA (2,5% albúmina de suero bovino (BSA), 10% de suero de cabra normal, 0,1% de Tween-20). La solución de bloqueo se filtra, se dividió en alícuotas en Eppendorfs 1,5 ml y se almacenó para meses a -20 ° C.
- Se incuban las células con el anticuerpo primario contra la proteína o la modificación de las histonas de interés diluido en solución de bloqueo, durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Aquí se muestra el ejemplo de un anticuerpo contra fosforilados serina-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, Ver Tabla 5 para más detalles). Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 100 l de solución en parafilm o un portaobjetos en una cámara húmeda. Los cubreobjetos son entonces cuidadosamente con fórceps (inundado con 1x PBS si es necesario). Nota que la dilución y la duración de la incubación puede ser ajustado dependiendo de la calidad de los anticuerpos y de células tipos.
- Lavar las células en 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, tres veces 5 min a TA con agitación.
- Se incuban las células con el apropiado fluoróforo conjugado con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo durante una hora a RT en una cámara oscura y húmeda. Aquí se muestra un ejemplo de detección con unsecundario de cabra anti-ratón de anticuerpos (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen; Ver Tabla 5 para más detalles). Hapteno conjugado con anticuerpos secundarios (biotina, digoxigenina, etc) también podría ser utilizado. En este caso, un paso adicional para la detección apropiado (estreptavidina, anti-dig, etc) se puede realizar ya sea antes o después de ADN-FISH hibridación durante la noche.
- Enjuagar las células en 0,1% de Tween-20 / 1x PBS, tres veces 5 min a TA con agitación en la oscuridad.
- Post-fix células en 2% de paraformaldehído / PBS 1x durante 10 min a TA en la oscuridad.
- Continuar FISH ADN como anteriormente a partir de la incubación en RNasa A (Paso 3,4).
5. 3-dimensional de ADN FISH / Immuno-FISH - Segundo día (~ 2 h)
- Retire con cuidado el cemento de goma, cubreobjetos de inundación con 2x SSC, retire con cuidado con unas pinzas y colóquelos en los pocillos con solución de lavado.
- Lavar las células en 2x SSC durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad con agitación.
- Lavar las células en 2x SSC durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación.
- Lavar las células en 1x SSC durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación Tenga en cuenta que en caso de desnaturalización con formamida, lavados debe ser sustituido por el siguiente:. 3 lavados en lavados de 50% de formamida / SSC 2x y 3 en 2x SSC, 5 minutos cada uno, a 37 º C.
- Montar las células en ProLong oro medio de montaje que contiene 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para la contratinción de ADN total. Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 10-15 l de medio de montaje en un portaobjetos y se sellaron con esmalte de uñas. Las diapositivas se mantuvo durante meses a -20 ° C.
6. Microscopia y Análisis de 3D
- Imágenes 3D pueden ser adquiridos con los sistemas de microscopios. En nuestros experimentos, las secciones ópticas separadas por 0,3 micras se recogen en un sistema Leica SP5 AOBS confocal (acústico-óptico divisor de haz). Tenga en cuenta que la separación entre Optical planos se pueden ajustar dependiendo del tipo de análisis.
- Pilas de imágenes 3D se pueden analizar usando software diferente y herramientas. Usamos el software Image J para evaluar las mediciones de distancia entre loci de interés y analizar diferentes tipos de asociación de los lugares de interés con los sub-compartimientos nucleares o proteínas.
- Todos los análisis estadísticos se realizaron para comparar dos (o más) diferentes condiciones biológicas con pairwise evaluación (s) de significación: Comparación entre diferentes tipos de células o fases, la comparación entre los diferentes loci de interés. En todas las pruebas estadísticas, los valores de p ≤ 5.00e-2 (a = 0,05) se considera que son significativos (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00e-2 * significativo; 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * muy significativa, p <1,00 E-3 *** altamente significativo).
El análisis estadístico de las distribuciones de enteros de las distancias entre los dos alelos. Hemos primera construct acumulativos curvas de distribución de frecuencias en toda la gama de distancias medidas entre el alleles.To NAEP la significación de las diferencias en las distribuciones empíricas de inter-alélicas distancias que usamos la prueba no paramétrica de dos muestras de Kolmogorov-Smirnov (KS) prueba de 13,14.
El análisis estadístico de una estrecha asociación (es decir, el emparejamiento) de dos alelos con una distancia óptima de corte. Identificar el rango de la mayoría de las diferencias robustas en las distancias entre dos alelos o loci, utilizamos una serie de 15 dos colas prueba exacta de Fisher s. Es decir, en cada distancia medida se prueba si una condición es significativamente más representadas en distancias más cortas entre las dos muestras. El mínimo en la distribución de los valores P indica la gama de distancias que deben ser considerados como un límite para cerrar asociación (es decir, emparejamiento) de los dos alelos. Posteriormente, la prueba de dos colas exacta de Fisher se utiliza to evaluar la importancia de emparejamiento de dos alelos en el identificada valor de corte 15. Correcciones de prueba múltiples se aplica a la cuenta para el número total de pruebas de Fisher realizó 16.
El análisis estadístico de la asociación del locus de interés con sub-compartimentos nucleares o proteínas. La prueba de dos colas de Fisher-exacta se utiliza para analizar la significación de la asociación del locus de interés con diferentes compartimentos o proteínas 15.
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Representative Results
ADN y la inmuno-FISH se utilizan en el laboratorio Skok para estudiar los cambios en la organización nuclear asociados con el proceso de V (D) J recombinación de loci receptores de antígenos durante el desarrollo de linfocitos B y T. Las técnicas detalladas anteriormente nos permiten i) medir distancias entre los dos extremos de un locus (contracción) ii) medir distancias entre los alelos o loci (emparejamiento), iii) analizar el daño del ADN que ocurre dentro de loci, iv) evaluar la ubicación de los alelos y en relación con loci nucleares sub-compartimentos (heterocromatina represiva pericentromeric en nuestro estudio), y v) evaluar la asociación de proteínas nucleares en alelos y loci (asociación de la histona fosforilada γ-H2AX en nuestro estudio). En particular, se analizó el papel de la dinámica locus en la regulación de la recombinación V J (D) de los loci de inmunoglobulina en el desarrollo de las células B 17-30, y en la regulación de linaje compromiso entre CD4 + y CD8 + Tcélulas 14. También se evaluó el daño del ADN en uno de los locus del receptor de células T, TCRA / d, en el desarrollo de las células T que llevan una forma mutante de la proteína recombinasa RAG2 31.
Figura 1. El análisis de las distancias entre los dos alelos o loci. (A) Secciones confocal que muestran representativas desapareados (derecha) o en pares (izquierda) alelos en núcleos individuales. La FISH sonda de ADN se generó a partir de un BAC (~ 200 kb) que abarcan el locus de interés. Las distancias entre los alelos se mide entre el centro de masa de cada señal de BAC en las pilas de imágenes 3D. Círculos de trazos esbozar formas núcleo. Las barras de escala = 1 m. (B) acumuladas curvas de distribución de frecuencia que muestra toda la gama de distancias entre el alelo doss, medidos en dos diferentes condiciones biológicas (de tipo salvaje versus mutante). El no paramétrico de dos muestras de prueba KS se utilizó para evaluar la significación de las diferencias entre las dos distribuciones. El rango de la mayoría de las diferencias entre sólidos en alélicas distancias se evaluó a través de una serie de dos colas prueba exacta de Fisher (puntos azules). Los más robustos valores de P (mayores puntos) se encontraron para las distancias de alrededor de 1 m. Así, el corte de una estrecha asociación (emparejamiento es decir) de los dos alelos se creó la 1 micra. (C) las curvas de frecuencia acumulada que muestra las distancias entre los dos alelos de 0 a 1,5 micras en las dos condiciones biológicas diferentes. La importancia de la vinculación de los dos alelos se evaluó mediante la prueba de dos colas exacta de Fisher para un punto de corte a 1 micra. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. Análisis de la localización de un locus relativa a sub-compartimientos nucleares. En nuestros estudios se analiza la relación entre nuestros loci de interés y el represivo sub-nuclear compartimiento formado por la pericentromeric heterocromatina (PCH) 32. Los alelos se considera como situado en PCH cuando la señal de BAC para el locus de interés está adyacente o superposición con la señal de γ-satélite que se hibrida con PCH (sin pixel entre los bordes de la BAC y γ-satélite señales de FISH de ADN). Secciones confocales representativa de la ubicación de los alelos TCRA relativos a PCH: (Arriba) ningún alelo localizado en PCH, (Medio) un alelo en PCH, (inferior) dos alelos en PCH. Locus en rojo, y γ satélite en color blanco. Las flechas amarillas muestran los alelos ubicados en PCH. Círculos de trazos esbozar formas núcleo. Barra de escala = 1 m.
Figura 3. El análisis de la asociación de proteínas nucleares y modificaciones de las histonas en un locus. (A) En nuestros estudios se analiza la relación entre los loci de interés y la forma fosforilada de la histona H2AX (γ-H2AX), como lectura de ADN de doble hebra se rompe 33. Secciones confocal muestran ejemplos de ninguna asociación γ-H2AX (Arriba) o la asociación en un alelo TCRA (Abajo) en núcleos individuales. Los alelos se definen como asociado con γ-H2AX Si las señales de BAC y focos de inmunofluorescencia fueron al menos parcialmente superpuestos (al menos un píxel de colocalización). Locus se muestra en rojo y γ-H2AX en blanco. Círculos de trazos esquema nformas ucleus. Barra de escala = 1 m. Cabe señalar que los análisis de colocalización de la señal de BAC con PCH o focos γ-H2AX se realizan manualmente utilizando el software Image J sin umbral automatizado. (B) la pérdida de una parte de la señal de γ-H2AX después de la desnaturalización es una de las principales cuestiones técnicas que plantea este protocolo FISH inmuno-DNA. Aquí se muestra un ejemplo de inmunofluorescencia antes (superior) y después (inferior) tratamiento de desnaturalización HCl basado en (formamida-tratamiento dio resultados similares (no mostrados)). Aunque la señal era débil, las principales características de la tinción, en particular, el número de focos, quedan tras el tratamiento. El uso de un confocal Leica SP5, los ajustes para el láser 561 antes y después de la desnaturalización fueron los siguientes: 35% de potencia / ganancia inteligente a 730V, y el 45% de la potencia / ganancia inteligente a 750V, respectivamente. Además, se muestra aquí un ejemplo de una tinción de inmunofluorescencia para otro m histonaODIFICACIÓN, H3K27me3 (paneles de la derecha) que muestra que este protocolo se puede aplicar a otras marcas de histona, tal como ha sido publicada previamente 1,3. γ-H2AX se muestra en amarillo y H3K27me3 en rojo. Círculos de trazos esbozar formas núcleo. Barra de escala = 2 m. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
| Nombre del reactivo / material | Empresa | Número Catalogm | Comentarios |
| H 2 O | Pescador | # BP2470 | |
| RNasa A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 a C-11401 | |
| Cy3 o Cy5 dUTP | Pescador | º 45-001-xxx | |
| DNasa I | Roche | # 04536282001 | |
| ADN Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 micras filtros | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc ADN 1 mg / ml | Genética Aplicada | # MHB | |
| De esperma de salmón | Sigma | # D1626 | polvo que se volvieron a suspender a 10 mg / ml en H 2 O |
| NaAc (acetato de sodio, pH 5,2, solución tampón) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol. grado) | Pescador | # 525 | |
| Polivinilpirrolidona (Mol Biol. grado) | Pescador | # BP431 | |
| Polvo de sulfato de dextrano | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (solución salina fosfato de sodio-EDTA) 20x solución | Pescador | # BP1328 | |
| Formamida | Pescador | # BP227 | |
| Cubreobjetos | Pescador | # 12-548-B | |
| Diapositivas | Pescador | # 12-550 | |
| 6-y las placas | Pescador | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Pescador | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehído, gránulos, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol. grado | Sigma | # T8787 | |
| BSA (albúmina de suero bovino) fracción V | Pescador | # BP 1600 | |
| Suero normal de cabra | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol. grado | Sigma | # P9416 | |
| SSC (citrato sódico salino) 20x solución | Pescador | # BP1325 | |
| Prolongar reactivo Antifade Oro | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma | # D9542 | |
| Mejor prueba de una capa de cemento de goma | Arte o tiendas de suministros de oficina |
Tabla 1. Reactivos específicos y pequeños equipos.
| NT con dUTP junto con Alexa-fluoróforos | Cantidad | Concentración final |
| 10 g de ADN | X l | |
| RNasa A - 0,17 g / l | 10 l | |
| H 2 O | Llene hasta 260 l | |
| TOTAL - 30 min a 37 ° C | 260 l | |
| 10x tampón NT | 50 l | 1x |
| 100 mM y seta,-mercaptoetanol | 50 l | 10 mM |
| Mezcla de dNTP | 40 l | 40 mM de cada dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 l | 10 mM |
| 1 mM dUTP Alexa | 12 l | 30 mM |
| DNasa I (solución de trabajo, véase la tabla siguiente) | 30 l | |
| ADN Pol I | 7,5 l | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 hr a 16 ° C | 500 l | |
| NT con dUTP junto con Cy3 o Cy5 | Cantidad | Concentración final |
| 10 g de ADN | X l | |
| RNasa A - 0,17 g / l | 10 l | |
| H 2 O | Llene hasta 300 l | |
| TOTAL - 30 min a 37 ° C | 300 l | |
| 10x tampón NT | 50 l | 1x |
| 100 mM β-mercaptoetanol | 50 l | 10 mM |
| Mezcla de dNTP | 50 l | 50 mM de cada dNTP |
| 1 mM de Cy3-o Cy5-dUTP | 12 l | 30 mM |
| DNasa I | ~ 30 l | ~ 1,2 U / l |
| ADN Pol I | 7,5 l | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 hr a 16 ° C | 500 l |
Tabla 2. RNasa A y tratamiento Nick Translation g de ADN por 10.
| Soluciones | Acciones | |
| RNasa A | Solución de trabajo: 0,17 mg / l | Compuesto fresco |
| 10x tampón NT: | 0,5 M Tris-HCl, pH 8; 50 mM MgCl 2; 0,5 mg / ml de BSA | Tubos de 1,5 ml a -20 ° C. |
| dNTP mix: | dATP, dCTP, y dGTP: 0,5 mM cada uno en H 2 O | Tubos de 1,5 ml a -20 ° C |
| DNasa I: | Solución stock: reconstituido a 20.000 U / ml en 20 mM Tris pH 7.5/50 mM glycerol/50% NaCl | Tubos de 0,5 ml a -20 ° C |
| Solución de trabajo: Cada nuevo lote de solución stock de DNasa I debe ser probado en diferentes diluciones (10 U / ml, 20 U / ml y 40 U / ml en H 2 O). La dilución que da una tinción de ADN entre 100 y 1.000 pb (véasepaso 5) debe ser usado como la solución de trabajo. | Compuesto fresco |
Tabla 3. Soluciones para el tratamiento de RNasa A y traducción de Nick.
| Tampón de hibridación | Soluciones | Acciones | |
| 10% | Solución de Denhardt 50x: | 1 g de Ficoll 400, 1 g de polivinilpirrolidona y 100 ml de H 2 0 - Filtrado | Falcon de 50 ml a -20 ° C |
| 40% | 25% sulfato de dextrano: | Polvo de sulfato de dextrano se disuelve en 12,5 x SSPE a 37-65 ° C | Falcon de 50 ml a -20 ° C |
| 50% | Formamida | Botellas a +4 ° C | |
| Alícuotas de 1,5 ml Eppendorfs se almacenan a -20 ygrados; C | |||
Tabla 4. Tampón de hibridación.
| Anticuerpos | Proveedor | El número de catálogo | Dilución |
| γ-H2AX - H2A.X fosfato, clon JBW301, monoclonal de ratón | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, clon, conejo policlonal | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 burro anti-ratón | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tabla 5. Anticuerpos primarios y secundarios.
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Discussion
Las técnicas detalladas anteriormente se han utilizado en nuestro laboratorio para analizar la regulación de V (D) J recombinación de la inmunoglobulina y loci TCRA / d en el desarrollo de los linfocitos 30,31. Estamos seguros de que esta técnica se puede adaptar para la detección de varias proteínas nucleares, compartimentos nucleares y los loci, en diferentes tipos de células. Las modificaciones del protocolo puede ser necesaria, y en este caso los pasos principales de enfocar son los siguientes. En primer lugar, la longitud de la permeabilización se puede ajustar dependiendo de la célula de tipo. En segundo lugar la longitud de la incubación del anticuerpo primario también puede ser ajustado de acuerdo a la calidad del anticuerpo y la abundancia de la proteína de interés (por ejemplo, en algunos casos, la incubación puede realizarse durante la noche a 4 ° C). Es importante destacar que la etapa de desnaturalización se puede adaptar, y tratamiento con HCl puede ser sustituido por desnaturalización en formamida 3,4,34 y NaOH para FISH ADN 20. También se repitaed congelación y descongelación de nitrógeno líquido se puede aplicar a las células después de la fijación / permeabilización para FISH ADN solo 4,34. Finalmente, mientras que varias modificaciones de las histonas, ARN polimerasa II y co-factores se han detectado con éxito usando este método 30,35, la inmunotinción para otras proteínas nucleares se puede realizar después de la hibridación FISH ADN 4.
Análisis de imagen 3D puede implicar el uso de diferentes tipos de microscopios, incluyendo campo amplio de epifluorescencia (junto con deconvolución) y microscopía láser confocal 36. La elección del método de formación de imágenes dependerá de la resolución requerida, el número de fluoróforos, la profundidad de las muestras y la calidad de las señales de ADN y de proteínas. El desarrollo de nuevos microscopios de alta resolución abre toda una nueva avenida en la visualización precisa de los procesos nucleares y celulares 37-39. Además, las nuevas técnicas para la generation de los productos a medida sondas que no contienen secuencias repetitivas permiten la detección de regiones genómicas limpio, de un 15-kb del locus específico, para piscinas de complejos de los exones 40. Esto aumenta la precisión y la sensibilidad de microscopía de alta resolución en el seguimiento de la dinámica de los procesos nucleares.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Skok, especialmente Susannah Hewitt, para los debates y comentarios. Este trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS es un erudito Leukemia & Lymphoma Society. JC es un compañero Irvington Instituto de Investigación del Cáncer Institute. MM es apoyado por una Educación Nacional Science Foundation Graduate Beca Integral y Prácticas de Investigación (NSF IGERT 0.333.389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
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| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
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