Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.
Abstract
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden auf 3-dimensional erhalten Kerne durch 3D-konfokale Mikroskopie verfolgt (3D DNA FISH) stellt die direkteste Weg, um die Lage der Gen-Loci, chromosomalen Subregionen oder ganze Gebiete in einzelnen Zellen zu visualisieren. Diese Art der Analyse gibt einen Einblick in die globale Architektur des Zellkerns als auch das Verhalten der spezifischen genomischen Loci und Regionen innerhalb der nuklearen Raum. Immunfluoreszenz, auf der anderen Seite erlaubt die Detektion von nuklearen Proteinen (modifizierte Histone, Histon-Varianten und Modifikatoren, Transkription Maschinen und Faktoren, Atom-U-Fächer, etc). Die große Herausforderung in der Kombination Immunfluoreszenz und 3D DNA FISH ist, einerseits um das Epitop von dem Antikörper sowie die 3D-Architektur des Kerns detektiert erhalten und andererseits, damit das Eindringen der DNA-Sonde zu detektieren Genloci oder Chromosom Gebieten 1-5. Hier bieten wir ein Protokoll, das die Visualisierung von Chromatin Modifikationen mit genomischen Loci in 3D erhalten Kernen kombiniert.
Introduction
Epigenetische Mechanismen auslösen Aufbau und Vererbung von Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Transkriptions-Profilen. Auf einer Ebene Dies beinhaltet Modulation der Chromatinstruktur Verpackungen, die aktive oder stille genomischen Regionen definiert. In einem größeren Maßstab, globale 3D Organisation des Genoms und Zellkernarchitektur spielen ebenfalls eine Rolle bei der Kontrolle der Transkriptions-Mustern. So ist Dissektion dieser epigenomischen wesentliche Merkmale für ein volles Verständnis, wie Gene 6-11 geregelt.
Kombiniert Immunfluoreszenz-und 3D-DNA FISH bieten eine einzigartige Möglichkeit, molekulare und biochemische Analysen Beurteilung spezifischer Interaktionen / Verbände von DNA-Sequenzen und / oder Proteinen im Zellkern zu ergänzen. Hinzu kommt, dass genomweite Hochdurchsatztechniken wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-seq) oder Chromosom capture Konformation mit deep sequencing gekoppelt (4C-seq, 5C, Hallo-C) liefern globale data auf Zellpopulationen 12 ermöglichen Immunfluoreszenz / DNA FISH-Techniken Analysen der einzelnen Zelle Ebene.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-FISH) gefolgt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die kombinierte Visualisierung von DNA und Konservierung von Proteinstrukturen. Unsere Erfahrung in diesem Bereich hat es uns ermöglicht, zu verbessern und zu vereinfachen bestehende Protokolle. Obwohl wir dieses Protokoll verwendet wurden, um DNA-Doppelstrang-Pausen in Lymphozyten unterziehen Rekombination detektieren kann dieses Verfahren an andere Proteine und andere Zelltypen verwendet werden.
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Protocol
Ein. DNA Probe Labeling mit Fluorophoren: Nick Translation (~ 6 h)
- Saubere BAC DNA (hergestellt von Maxi-Prep) oder Plasmiden oder PCR-Produkte, die alle in H 2 O resuspendiert, kann für die Etikettierung verwendet werden. Beachten Sie, dass für eine robuste FISH Signal, Sonden sollten mindestens 10 kb überspannen.
- Inkubieren DNA in RNase A während 30 min bei 37 ° C (alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt).
- Inkubieren Sie die Nick-Translation Reaktion für 2 h bei 16 ° C (siehe Tabellen 2 und 3). Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung verwendet werden (Beispiel: FISH Tag, Invitrogen) werden.
- Inaktivieren die Reaktion für eine Stunde bei -80 ° C oder über Nacht bei -20 ° C.
- Bestimmen Sondengröße auf einem 2% Agarosegel. Der Abstrich sollte zwischen 100 und 1.000 bp, wobei die Mehrheit bei ca. 300-500 bp (Beachten Sie, dass der Abstrich von Cy5-Sonden nicht sichtbar ist). Wenn die DNA nicht verdaut ist genug, mehr DNA Pol I undDNase I kann in die Reaktion hinzugefügt und inkubiert für zwei weitere Stunden bei 16 ° C.
- Läutern Sonden auf 0,025 mm Filter in zwei Liter-Becher gefüllt mit H 2 0 für zwei Stunden im Dunkeln.
- Fügen Sie blockierende Faktoren zu den Sonden wie folgt: 10 ug Cot-1 DNA, 10 ug Hybloc DNA und 100 ug Lachssperma für 10 pg DNA-Sonden. Shop DNA-Sonden bei -20 ° C.
2. Probe Niederschlag / Denaturierung / Pre-Annealing (3-4 Std.)
- Zwischen 0,3 ug und 1 pg DNA-Sonde wird pro Deckglas verwendet. Mischung Sonden mit 0,1 Vol. 3 M NaAc (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100% Ethanol für eine Stunde bei -80 ° C inkubieren oder über Nacht bei -20 ° C und Spin-down bei 13.000 rpm bei 4 ° C für 30 min. Man beachte, dass die Menge an DNA-Sonde eingestellt werden kann, je nach Qualität der DNA und der Kernbereich der Hybridisierung werden. Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung kann die Verwendung der reduzierten MengenSonde. Zur Detektion von mehreren DNA FISH-Signale auf einer Folie können die unterschiedlichen Sonden zusammen ausgefällt werden (außer Sonden, die nicht vorher geglüht, sollte ähnlichen Repeat-Sequenzen). Sonden für mehrere Experimente zur gleichen Zeit ausgeführt werden können auch zusammen ausgefällt werden. Pellets sollten leicht nach den Fluorophoren verwendet werden (wenn kleine Mengen von Sonden ausgefällt werden, das Pellet möglicherweise nicht sichtbar) eingefärbt werden.
- Trockene Pellets und resuspendieren Sie in 15 ul Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 4) pro Deckglas unter Schütteln (mit einem Eppendorf Thermomixer) im Dunkeln bei 37-45 ° C (ca. 20 min).
- Denaturieren Sonden für 5 min bei 75-95 ° C.
- Pre-annealen Sonden bei 37 ° C für 30-60 min. Länge Vorglühen kann in Abhängigkeit von der Komplexität und Qualität der Sonden werden.
- Bewerben Sonden an die Deckgläser über Nacht Hybridisierung (siehe Abschnitt 3).
3. 3-Dimensionalen DNA FISH - First Day (~ 3 Stunden)
- Nicht-adhärente Zellen werden in einem kleinen Volumen von 1x PBS (~ 2x10 5 Zellen in 5-10 ul PBS 1x pro Deckglas) eingeengt und ließ sich auf der Mitte eines Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen. Adhärenten Zellen auf Deckgläsern sollte mindestens 24 Stunden (~ 70% Konfluenz) (Deckgläser kann mit 0,1% Gelatine beschichtet sein) kultiviert werden. Quadratischen 18x18 um 24-24 mm-Deckgläschen werden in 6-well Platten gegeben und während des Protokolls, zwei ml jeder Lösung wird pro Vertiefung verwendet (alternativ runde Deckgläser 1,5 mm können in 12/24-well Platten platziert werden).
- Fix Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS, pH 7-7,4, 10 min bei RT (4% PFA Bestände aliquotiert, gelagert bei -20 ° C). Paraformaldehyd in Lösung erworben werden (16%) bzw. 4% Stammlösungen aus Pulver / Granulat zubereitet werden. Paraformaldehyd Pulver wird in 1x PBS bei> 60 ° C (pH kann auf 8-9 erhöht werden, um die Auflösung zu erleichtern), abgekühlten auf Eis, passen gelösted zu pH 7-7,4, filtriert, in falcons aliquotiert und über Wochen bei -20 ° C.
- Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS für 5 min auf Eis. Länge der Permeabilisierung kann angepasst je nach Zelltyp werden. Hinweis: Wenn DNA FISH mit Immunfluoreszenz kombiniert wird, die Immunfärbung sollten in dieser Phase durchgeführt werden (siehe Abschnitt 4).
- Nach drei Spülungen in 1x PBS, inkubieren Zellen mit 0,1 ug / ul RNase A in 1x PBS für eine Stunde bei 37 ° C. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser werden dann vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Wenn ein Widerstand auftritt, sollte Deckgläser mit 1x PBS geflutet werden, um eine Beschädigung der Zellen.
- Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl für 10 min auf Eis.
- Nach drei Spülungen in 1x PBS, denaturieren Zellen in 1,9 M HCl für 30 min bei RT. Alternativ können Zellen, die in 50% Formamid / 2 × SSC bei 75-80 ° C für mindestens 30 min denaturiert. Beachte, dass Hybridisierung Länge (und Temperatur) können optimiert, je nach Zelltyp werden.
- Nach drei Spülungen in eiskaltem 1x PBS, hybridisieren Zellen mit Sonden über Nacht bei 37 ° C in einem dunklen und feuchten Kammer. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf ein Minus von 15 ul der Sonde auf einem Schlitten, und versiegelt mit Gummi-Zement.
4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 Std.)
- Für kombinierte Immunfluoreszenz / DNA FISH sollte Immunfärbung nach Permeabilisierung in 0,4% Triton-X-100 (Schritt 3.3) durchgeführt werden.
- Inkubieren Zellen in Blocking-Lösung für 30 min bei RT (2,5% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,1% Tween-20). Die Blockierungslösung wird filtriert, in 1,5 ml aliquotiert Eppendorfs und gespeichert monate bei -20 ° C.
- Inkubieren von Zellen mit dem primären Antikörper gegen das Protein oder das Histonmodifikation von Interesse in Blockierungslösung verdünnt angehoben, für eine Stunde bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Hier zeigen wir am Beispiel eines Antikörpers gegen phosphoryliertes Serin-139 der H2AX (γ-H2AX, Millipore; siehe Tabelle 5 für Details). Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser Dann gibt man vorsichtig mit einer Pinzette (geflutet mit 1x PBS falls erforderlich) entfernt. Hinweis, dass eine Verdünnung und Inkubation Länge eingestellt werden kann, je nach Qualität des Antikörpers und Zell-Typen verwendet werden.
- Waschen der Zellen in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln.
- Inkubieren von Zellen mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in Blocking-Lösung für eine Stunde bei RT in einer dunklen und feuchten Kammer verdünnt. Hier zeigen wir ein Beispiel für einen Nachweis mitsekundären Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Alexa Fluor 488 oder 555, Invitrogen; siehe Tabelle 5 für Details). Hapten-konjugierten Sekundärantikörper (Biotin, Digoxigenin, etc) könnten ebenfalls verwendet werden. In diesem Fall kann ein zusätzlicher Schritt für geeignete Nachweismethoden (Streptavidin, anti-dig, etc) entweder vor oder nach der Über-Nacht-DNA-FISH-Hybridisierung durchgeführt werden.
- Spülen Zellen in 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln im Dunkeln.
- Post-Update-Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS für 10 min bei RT im Dunkeln.
- Weiter DNA FISH wie oben beschrieben aus der Inkubation in RNase A (Schritt 3,4).
5. 3-dimensional DNA FISH / Immuno-FISH - Zweiter Tag (~ 2 h)
- Entfernen Sie vorsichtig Gummilösung, Überschwemmung Deckgläser mit 2x SSC, vorsichtig mit einer Pinzette zu entfernen und sie in Vertiefungen mit Waschlösung.
- Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln unter Schütteln.
- Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei RT im Dunkeln unter Schütteln.
- Waschen der Zellen in 1x SSC 30 min lang bei RT im Dunkeln unter Schütteln beachte, dass im Falle der Denaturierung mit Formamid, Waschungen durch die folgende ersetzt werden:. 3 Waschschritten in 50% Formamid / 2 × SSC und 3 Waschungen in 2 × SSC, 5 min jeweils bei 37 ° C.
- Montieren Zellen in ProLong Gold Montagetyp Medium mit 1,5 g / ml DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) für Gegenfärbung der Gesamt-DNA. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 10-15 ul Eindeckmedium auf einer Folie und versiegelt mit Nagellack. Slides sind für Monate bei -20 ° C gehalten
6. 3D-Mikroskopie und Analyse
- 3D-Bilder können mit verschiedenen Mikroskop-Systeme erworben werden. In unseren Experimenten werden optische Schnitte von 0,3 um getrennt auf einem Leica SP5 AOBS konfokalen System (Akusto-Optical Beam Splitter) gesammelt. Beachten Sie, dass die Trennung zwischen optical Ebenen kann in Abhängigkeit von der Art der Analyse ist.
- 3D-Bild Stapel analysiert mit unterschiedlichen Software und Tools werden. Wir verwenden das Image J Software Abstandsmessungen zwischen Loci von Interesse zu beurteilen und verschiedene Arten der Assoziation der Loci von Interesse mit sub-atomaren Fächer oder Proteine zu analysieren.
- Alle statistischen Analysen durchgeführt, um zwei Vergleichen (oder mehr) unterschiedlichen biologischen Bedingungen mit paarweise Beurteilung (en) von Bedeutung: Vergleich zwischen verschiedenen Zelltypen oder Stufen, Vergleich zwischen verschiedenen Loci von Interesse. In allen statistischen Tests, P-Werte ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) werden als signifikant (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * signifikant; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * sehr bedeutsam; P <1,00 E-3 *** hoch signifikant).
Die statistische Analyse der gesamten Verteilungen der Abstände zwischen zwei Allelen. Zunächst construct Verteilungsfunktion Frequenz-Kurven über den gesamten Bereich der gemessenen Abstände zwischen den beiden alleles.To Beurteilung der Signifikanz der Unterschiede in der Verteilung der empirischen inter-Allel Distanzen nutzen wir die nichtparametrische zwei Stichproben Kolmogorov-Smirnov (KS-Test) 13,14.
Statistische Analyse der engen Verbindung (dh Paarung) zweier Allele mit einem optimalen Abstand abgeschnitten. Um den Bereich der robustesten Unterschieden in der Entfernung zwischen zwei Allele oder Loci zu identifizieren, verwenden wir eine Reihe von zweiseitigen Fisher Exact Test 15 s. Nämlich an jedem gemessenen Abstand testen wir, ob eine Bedingung signifikant ist bei kürzeren Entfernungen zwischen den zwei Proben überrepräsentiert. Die minimale in der Verteilung der P-Werte gibt den Bereich von Abständen, der als Grenzwert für enge Verbindung (dh Paarung) der beiden Allele berücksichtigt werden sollten. Anschließend wird die zweiseitigen Fisher Exact Test wird t verwendeto Beurteilung der Bedeutung der Paarung zweier Allele bei der identifizierten cut-off-Wert 15. Mehrere Tests Korrekturen zur Berücksichtigung der Gesamtzahl der Fisher-Tests angewendet durchgeführt 16.
Statistische Analyse der Assoziation der Ort des Interesses mit sub-atomaren Fächer oder Proteine. Die zweiseitigen Fisher-Exact-Test wird verwendet, um die Bedeutung der Vereinigung der Locus von Interesse mit verschiedenen Fächern oder Proteine 15 zu analysieren.
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Representative Results
DNA und Immuno-FISH sind im Laborbetrieb Skok um die Änderungen in Atom-Organisation mit dem Verfahren der V (D) J-Rekombination von Antigenrezeptors Loci während der B-und T-Lymphozyten-Entwicklung verbunden studieren. Die Techniken zuvor dargelegten uns ermöglichen, i) Messung Abstände zwischen den beiden Enden eines Locus (Kontraktion) ii) messen Abstände zwischen Allelen oder Loci (Paarung), iii) eine Analyse der DNA-Schädigung, die innerhalb Loci, iv) Bewertung der Standort der Allele und loci Bezug auf Atom-U-Fächer (repressive perizentromerischen Heterochromatin in unserer Studie), und v) Beurteilung der Association of Nuclear Proteine auf Allele und loci (Verband der phosphoryliertes Histon γ-H2AX in unserer Studie). Insbesondere, analysierten wir die Rolle des Locus Dynamik in der Regelung der V (D) J-Rekombination der Immunglobulin-Loci in Entwicklungsländern B-Zellen 17-30, und in der Regulierung der Abstammungslinie Verpflichtung zwischen CD4 + und CD8 +-TZellen 14. Auch DNA-Schaden an einer der T-Zell-Rezeptor-Locus, TCRA / d beurteilt, in sich entwickelnden T-Zellen, die eine mutante Form des Rekombinaseprotein RAG2 31.
Abbildung 1. Analyse der Abstände zwischen zwei Allele oder loci. (A) Konfokale Abschnitten zeigt repräsentative ungepaarten (rechts) oder paarweise (links) Allele in den einzelnen Kernen. Die DNA-FISH-Sonde wurde von einer BAC (~ 200 kb) überspannt den Locus von Interesse erzeugt. Abstände zwischen Allelen wurden zwischen dem Zentrum der Masse jeder BAC Signal in 3D Bildstapeln gemessen. Gestrichelten Kreise skizzieren Kern Formen. Maßstabsbalken = 1 um. (B) Summenhäufigkeitsverteilung Kurven, welche die gesamte Palette der Abstände zwischen den beiden Allels in zwei verschiedenen biologischen Bedingungen (Wildtyp vs Mutante) gemessen. Der parametrische zwei Stichproben KS Test wurde verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den zwei Verteilungen zu beurteilen. Die Palette der robustesten Unterschiede in inter-Allel Distanzen wurde anhand einer Reihe von zwei-tail Fisher genaue Tests (blaue Punkte). Die robustesten P-Werte (höhere dots) wurden für die Abstände um 1 um gefunden. So ist die cut-off für enge Assoziation (dh Pairing) der beiden Allele wurde bei 1 um eingestellt. (C) Summenhäufigkeit Kurven, welche die Abstände zwischen den zwei Allele von 0 bis 1,5 um in den beiden unterschiedlichen biologischen Bedingungen. Die Bedeutung der Paarung der beiden Allele wurde mit dem zweiseitigen Fisher Exact Test für einen cut-off bei 1 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Analyse der Lage eines Ortes in Bezug auf sub-atomaren Fächern. In unseren Studien haben wir die Beziehung zwischen unseren Loci von Interesse und das repressive sub-atomaren Fach durch die perizentromerische Heterochromatin (PCH) 32 gebildet analysieren. Allele gelten als bei PCH befindet, wenn der BAC-Signal für den Locus von Interesse benachbart ist oder überlappend mit der γ-Satellitensignal, die PCH (kein Pixel zwischen den Rändern des BAC und γ-Satelliten-DNA FISH-Signale) hybridisiert. Konfokale Schnitte Vertreter der Lage TCRA Allele gegenüber PCH: (oben) keine Allel am PCH befinden, (Mitte) ein Allel am PCH, (Unterseite) zwei Allele an PCH. Locus in rot und γ-satellite in weiß. Gelbe Pfeile zeigen die Allele an PCH entfernt. Gestrichelten Kreise skizzieren Kern Formen. Maßstab = 1 um.
Abbildung 3. Analyse der Assoziation von nuklearen Proteinen und Histon-Modifikationen auf einem Locus. (A) In unseren Studien analysieren wir die Beziehung zwischen unseren Loci von Interesse und die phosphorylierte Form des Histon H2AX (γ-H2AX), wie Auslesen zum DNA-Doppelstrang -stranded Pausen 33. Konfokale Abschnitte zeigen Beispiele von nicht γ-H2AX Verband (Top) oder Vereinigung auf einer TCRA Allel (Bottom) in den einzelnen Kernen. Allele wurden als assoziiert mit γ-H2AX definiert, wenn die BAC-Signale und Immunfluoreszenz Foci wurden zumindest teilweise überlappen (mindestens ein Pixel der Kolokalisation). Locus ist in rot und γ-H2AX in weiß dargestellt. Gestrichelten Kreise Umriss nucleus Formen. Maßstab = 1 um. Es ist bemerkenswert, dass Kolokalisationsanalysen der BAC-Signal mit PCH oder γ-H2AX Foci manuell mit Hilfe von Image J Software ohne automatisierte Schwelle durchgeführt. (B) Verlust eines Teils der γ-H2AX Signal nach Denaturierung eine der wichtigsten technischen Fragen aufgeworfen dieses Immun-DNA FISH-Protokoll. Hier zeigen wir ein Beispiel Immunfluoreszenz vor (oben) und nach (unten) HCl-basierte Denaturierungsbehandlung (Formamid-Behandlung ergab ähnliche Ergebnisse (nicht gezeigt)). Obwohl das Signal schwächer war, die wichtigsten Merkmale der Färbung, insbesondere die Zahl der Herde nach der Behandlung bleiben. Mit Hilfe eines SP5 Leica konfokalen waren die Einstellungen für den 561-Laser vor und nach Denaturierung der folgende: 35% Leistung / smart Verstärkung bei 730V und 45% Leistung / smart Verstärkung bei 750V bzw.. Darüber hinaus zeigen wir hier ein Beispiel eines Immunfluoreszenzfärbung für einen anderen Histon mNDERUNG, H3K27me3 (Right Platten) zeigt, dass dieses Protokoll andere Histonmarkierungen angewendet werden kann, wie bisher 1,3 veröffentlicht worden. γ-H2AX wird in gelb und H3K27me3 in rot dargestellt. Gestrichelten Kreise skizzieren Kern Formen. Maßstab = 2 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
| Name des Reagenz / Material | Firma | Catalogm Anzahl | Kommentare |
| H 2 O | Fischer | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397-C-11401 | |
| Cy3 oder Cy5 dUTP | Fischer | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 um Filter | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1-DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Angewandte Genetik | # MHB | |
| Lachssperma | Sigma | # D1626 | Pulver bei 10 mg / ml in H 2 O resuspendiert werden |
| NaAc (Natriumacetat, pH 5,2, Puffer-Lösung) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fischer | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol grade) | Fischer | # BP431 | |
| Dextransulfat Pulver | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x-Lösung | Fischer | # BP1328 | |
| Formamid | Fischer | # BP227 | |
| Deckgläser | Fischer | # 12-548-B | |
| Slides | Fischer | # 12-550 | |
| 6-Well-Platten | Fischer | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fischer | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehyd, Prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol Grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraktion V | Fischer | # BP 1600 | |
| Normalem Ziegenserum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol Grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x-Lösung | Fischer | # BP1325 | |
| ProLong Gold-antifade Reagenz | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Phenylindol) | Sigma | # D9542 | |
| Bester Test eine Schicht Gummi-Zement | Kunst oder Büromärkten |
Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Kleingeräten.
| NT mit dUTP mit Alexa-Fluorophore gekoppelt | Menge | Endkonzentration |
| 10 ug DNA | X ul | |
| RNase A - 0,17 ug / ul | 10 ul | |
| H 2 O | Füllen bis 260 ul | |
| TOTAL - 30 min bei 37 ° C | 260 ul | |
| 10x NT-Puffer | 50 ul | 1x |
| 100 mM und seinta;-Mercaptoethanol | 50 ul | 10 uM |
| dNTP-Mix | 40 ul | 40 &mgr; M von jedem dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 ul | 10 uM |
| 1 mM dUTP Alexa | 12 ul | 30 uM |
| DNase I (Arbeitslösung, siehe Tabelle unten) | 30 ul | |
| DNA Pol I | 7,5 ul | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 h bei 16 ° C | 500 ul | |
| NT mit dUTP mit Cy3 oder Cy5 verbunden | Menge | Endkonzentration |
| 10 ug DNA | X ul | |
| RNase A - 0,17 ug / ul | 10 ul | |
| H 2 O | Füllen auf 300 ul | |
| TOTAL - 30 min bei 37 ° C | 300 ul | |
| 10x NT-Puffer | 50 ul | 1x |
| 100 mM β-Mercaptoethanol | 50 ul | 10 uM |
| dNTP-Mix | 50 ul | 50 uM jedes dNTP |
| 1 mM Cy3-oder Cy5-dUTP | 12 ul | 30 uM |
| DNase I | ~ 30 ul | ~ 1,2 U / ul |
| DNA Pol I | 7,5 ul | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 h bei 16 ° C | 500 ul |
Tabelle 2. RNase A Behandlung und Nick Übersetzung für 10 ug DNA.
| Lösungen | Vorräte | |
| RNase A | Arbeitslösung: 0,17 ug / ul | Up frisch gemacht |
| 10x NT-Puffer: | 0,5 M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgCl 2, 0,5 mg / ml BSA | 1,5 ml Röhrchen bei -20 ° C. |
| dNTP Mix: | dATP, dCTP und dGTP: 0,5 mM jeweils in H 2 O | 1,5 ml Röhrchen bei -20 ° C |
| DNase I: | Stammlösung: rekonstituiert bei 20.000 U / ml in 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | 0,5 ml Röhrchen bei -20 ° C |
| Arbeitslösung: Jede neue Charge von DNase I Stammlösung sollte in verschiedenen Verdünnungen getestet werden (10 U / ml, 20 U / ml und 40 U / ml in H 2 O). Die Verdünnung, die eine DNA-Abstrich zwischen 100 und 1.000 bp (sieheSchritt 5) sollte als die Arbeitslösung verwenden. | Up frisch gemacht |
Tabelle 3. Lösungen für RNase A Behandlung und Nick Translation.
| Hybridisierungspuffer | Lösungen | Vorräte | |
| 10% | 50x Denhardt-Lösung: | 1 g Ficoll 400, 1 g Polyvinylpyrrolidon und 100 ml H 2 0 - gefilterte | 50 ml Falcon bei -20 ° C |
| 40% | 25% Dextransulfat: | Dextransulfat Pulver wird in 12,5 x SSPE bei 37 bis 65 ° C gelöst | 50 ml Falcon bei -20 ° C |
| 50% | Formamid | Flaschen bei +4 ° C | |
| Aliquots in 1,5 ml Eppendorfs werden bei -20 gelagert unddeg; C | |||
Tabelle 4. Hybridisierungspuffer.
| Antikörper | Lieferant | Katalognummer | Verdünnung |
| γ-H2AX - phospho H2A.X, Klon JBW301, monoklonalen Maus | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, Klon, polyklonalen Kaninchen | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Esel Anti-Maus- | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus- | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen- | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tabelle 5. Primäre und sekundäre Antikörper.
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Discussion
Die Techniken detailliert wurden oben in unserem Labor verwendet werden, um die Regulation der V (D) J-Rekombination der Immunglobulin und TCRA / d loci in Entwicklungsländern Lymphozyten 30,31 analysieren. Wir sind sicher, dass diese Technik für die Detektion verschiedener Kernproteinen, nukleare Abteile und Loci, in verschiedenen Zelltypen angepasst werden kann. Modifikationen des Protokolls notwendig sein kann, und in diesem Fall die Hauptschritte zu konzentrieren sind die folgenden. Erstens kann die Länge eingestellt Permeabilisierung je nach Zelltyp werden. Zweite der Länge des primären Antikörpers Inkubation können auch je nach der Qualität des Antikörpers und die Fülle des Proteins von Interesse (z. B. in einigen Fällen kann der Inkubation über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden) eingestellt werden. Wichtig ist, kann der Denaturierungsschritt angepasst und HCl-Behandlung kann durch Denaturierung in Formamid 3,4,34 und NaOH für DNA FISH 20 ersetzt werden. Auch wiederholened Gefrier-Auftau-Zyklen von flüssigem Stickstoff können die Zellen nach der Fixierung / Permeabilisierung für die DNA-FISH allein 4,34 angewendet werden. Schließlich, während mehrere Histonmodifikationen RNA Polymerase II und Co-Faktoren erfolgreich erkannt wurden mit dieser Methode 30,35 kann Immunfärbung für andere Proteine nach der nuklearen DNA FISH-Hybridisierung 4 durchgeführt werden.
3D-Bildanalyse können die Verwendung von verschiedenen Arten von Mikroskopen, einschließlich Breitbild-Epifluoreszenz (gekoppelt mit Dekonvolution) und konfokale Laser-Mikroskopie 36. Die Wahl des bildgebenden Verfahrens wird auf die benötigte Auflösung abhängen, die Anzahl der Fluorophore, die Tiefe der Proben und die Qualität der DNA-und Protein-Signale. Die Entwicklung der neuen hochauflösenden Mikroskopen öffnet eine völlig neue Wege in die genaue Visualisierung von nuklearen und zelluläre Prozesse 37-39. Darüber hinaus wurden neue Techniken für die generation von maßgeschneiderten Sonden, die keine sich wiederholenden Sequenz enthalten ermöglichen die saubere Erkennung von genomischen Regionen, von einer 15-kb spezifischen Ort, bis hin zu komplexen Pools von Exons 40. Dies erhöht die Genauigkeit und Empfindlichkeit der hochauflösenden Mikroskopie bei der Verfolgung der Dynamik der Kernprozesse.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir möchten die Mitglieder des Skok Labor, vor allem Susannah Hewitt, für Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wird durch das National Institute of Health Zuschüsse R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) unterstützt. JAS ist ein Leukemia & Lymphoma Society Gelehrter. JC ist ein Irvington Institute Fellow des Cancer Research Institute. MM wird von der National Science Foundation Grant Integrative Graduate Bildung und Forschung Traineeship (NSF IGERT 0.333.389) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
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| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
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