Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D

doi: 10.3791/50087 Published: February 3, 2013

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية DNA FISH).

Abstract

الفلورسنت في الموقع التهجين باستخدام مجسات DNA على نواة-3 الأبعاد الحفاظ تليها المجهري متحد البؤر 3D (3D FISH DNA) يمثل الطريق الأكثر مباشرة لتصور موقع مواضع الجينات، الكروموسومات أو الأقاليم الفرعية في جميع الأراضي الخلايا الفردية. هذا النوع من التحليل يقدم نظرة ثاقبة في الهندسة المعمارية العالمية للنواة وكذلك سلوك مواضع الجينومية ومناطق محددة في غضون النووية. المناعي، من ناحية أخرى، يسمح الكشف عن البروتينات النووية (الهستونات تعديل، ومعدلات المتغيرات هيستون، آلات النسخ والعوامل، النووية شبه مقصورات، الخ). التحدي الرئيسي في الجمع بين المناعي و 3D FISH DNA هو، من ناحية الحفاظ على حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة وكذلك الهندسة المعمارية 3D للنواة، وعلى الجانب الآخر، للسماح للتغلغل التحقيق للكشف عن الحمض النووي مواضع الجينات أو الكروموسومات الأراضي 1-5. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين التصور من التعديلات لونين مع مواضع الجيني في 3D النوى الحفاظ عليها.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إنشاء آليات جينية الزناد وراثة الخلية والتنموية محات من نوع النسخي محددة. في مستوى واحد وهذا ينطوي على تعديل لونين من التعبئة والتغليف التي تحدد المناطق الجينية النشطة أو الصمت. على نطاق أوسع، وتنظيم 3D العالمية للجينوم النووية والهندسة المعمارية أيضا أن تلعب دورا في السيطرة على أنماط النسخي. وهكذا، تشريح هذه الميزات epigenomic أمر ضروري لفهم كامل لكيفية الجينات وينظم 6-11.

الجمع بين FISH DNA المناعي و 3D فرصة فريدة لاستكمال التحليلات الجزيئية والكيمياء الحيوية عن طريق تقييم التفاعلات محددة / جمعيات تسلسل الحمض النووي و / أو البروتينات داخل النواة. وعلاوة على ذلك، في حين الجينوم على نطاق تقنيات إنتاجية عالية مثل مناعي لونين (رقاقة يليها) أو الكروموسوم التشكل القبض على جانب التسلسل العميق (4C-يليها، 5C، مرحبا C) تقديم دات العالميةوعلى السكان الخلية 12، تقنيات FISH المناعي / DNA يمكن من إجراء تحليلات على مستوى خلية واحدة.

نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية FISH). وميزة هذا البروتوكول هو التصور المشترك لDNA والحفاظ على هياكل البروتين. وقد مكن خبرتنا في هذا المجال لنا لتحسين وتبسيط البروتوكولات القائمة. على الرغم من أننا قد استخدمت هذا البروتوكول للكشف عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل في الخلايا الليمفاوية التي تمر إعادة التركيب، يمكن تطبيق هذه الطريقة لغيرها من البروتينات وغيرها من أنواع الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. DNA وصفها دقق مع Fluorophores: نيك ترجمة (~ 6 ساعة)

  1. ويمكن استخدام DNA نظيفة BAC (الإعدادية التي أعدتها-ماكسي) أو البلازميدات أو المنتجات PCR، كل معلق في H 2 O، لوضع العلامات. لاحظ أن إشارة قوية FISH، يجب تمتد تحقيقات لا يقل عن 10 كيلو بايت.
  2. احتضان DNA في ريبونوكلياز A لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C (يتم سرد كافة الكواشف في الجدول 1).
  3. احتضان رد فعل الترجمة لمدة 2 ساعة نيك عند 16 ° C (انظر الجدولين 2 و 3). ويمكن استخدام الطرق البديلة لوضع العلامات المباشر (على سبيل المثال: العلامة FISH، إينفيتروجن).
  4. تعطيل رد الفعل لمدة ساعة عند -80 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في -20 ° C.
  5. تحديد حجم التحقيق على هلام الاغاروز 2٪. يجب أن تكون مسحة بين 100 و BP 1،000، مع الأغلبية في حوالي 300-500 بي بي (لاحظ أن مسحة من تحقيقات-Cy5 غير مرئي). إذا لم يتم هضم ما يكفي من الحمض النووي أكثر من ذلك، وأنا بول DNAيمكن أن تضاف الدناز الأول للتفاعل وحضنت لمدة ساعة في أكثر C. ° 16
  6. تنقية تحقيقات على 0،025 ملم في اثنين من المرشحات الأكواب لتر مليئة H 2 0 لمدة ساعة في الظلام.
  7. إضافة عوامل عرقلة للتحقيقات على النحو التالي: 10 ميكروغرام من الحمض النووي-1 كوت، 10 ميكروغرام من الحمض النووي Hybloc و 100 ميكروغرام من الحيوانات المنوية السلمون لمدة 10 ميكروغرام من الحمض النووي تحقيقات. تحقيقات DNA مخزن في -20 ° C.

2. التحقيق الأمطار / تمسخ / قبل الصلب-(HR 3-4)

  1. ويستخدم بين 0.3 ميكروغرام و 1 ميكروغرام من الحمض النووي في التحقيق ساترة. تحقيقات مزيج بنسبة 0.1 حجم NAAC 3M (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 2.5 وحدات التخزين من الإيثانول بنسبة 100٪، لمدة ساعة احتضان -80 درجة مئوية في ليلة وضحاها أو في -20 درجة مئوية، وتدور إلى أسفل في 13000 دورة في الدقيقة في 4 لمدة 30 دقيقة C °. علما أنه يجوز تعديل كمية DNA التحقيق اعتمادا على نوعية الحمض النووي ومنطقة النووية من التهجين. قد طرق بديلة لوضع العلامات المباشرة تسمح باستخدام كميات مخفضة منالتحقيق. للكشف عن إشارات متعددة FISH DNA على شريحة واحدة، يمكن عجل تحقيقات مختلفة معا (ما عدا تحقيقات التي لا ينبغي أن يكون قبل صلب، مثل تكرار تسلسل). ويمكن أيضا للتحقيقات أجريت تجارب عدة في الوقت نفسه أن عجلت معا. وينبغي أن الكريات الملونة طفيفة وفقا لfluorophores المستخدمة (إذا عجلت كميات صغيرة من تحقيقات، وبيليه قد لا تكون مرئية).
  2. الكريات الجافة و resuspend لهم في 15 ميكرولتر العازلة التهجين (انظر الجدول 4) في ساترة مع اهتزاز (باستخدام thermomixer إيبندورف) في الظلام في 37-45 ° C (حوالي 20 دقيقة).
  3. تفسد تحقيقات لمدة 5 دقائق في 75-95 درجة مئوية.
  4. قبل يصلب تحقيقات في 37 ° C لمدة 30-60 دقيقة. ويمكن تعديل طول الصلب قبل تبعا لدرجة تعقيد وجودة تحقيقات.
  5. تطبيق لتحقيقات التهجين بين عشية وضحاها لcoverslips (انظر القسم 3).

3. 3الأبعاد FISH DNA - اليوم الأول (~ 3 ساعة)

  1. وتتركز الخلايا غير ملتصقة في كمية صغيرة من 1X PBS (2X10 ~ 5 خلايا في 5-10 ميكرولتر 1X PBS في ساترة) والتي ألقيت على مركز ساترة بولي-L-يسين المغلفة. وينبغي مثقف الخلايا الملتصقة على coverslips مدة لا تقل عن 24 ساعة (~ التقاء 70٪) (قد تكون مغلفة coverslips بنسبة 0.1٪ الجيلاتين). توضع coverslips ملم مربع 18x18 إلى 24-24 في 6 لوحات جيدا، وطوال البروتوكول، واستخدام اثنين مل من كل حل لكل بئر (يمكن وضعها بدلا من الجولة coverslips ملم 1.5 في لوحات 12/24-well).
  2. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ / 1X PBS، ودرجة الحموضة 7-7،4، لمدة 10 دقيقة في RT (يمكن aliquoted PFA 4٪ أسهم وتخزينها في -20 درجة مئوية). ويمكن شراء بارافورمالدهيد في حل (16٪)، أو يمكن إعداد حلول 4٪ من الأسهم مسحوق / حبيبات. يذوب مسحوق بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني 1X في> 60 ° C (يمكن زيادة درجة الحموضة إلى 8-9 لتسهيل الحل)، إلى أسفل المبرد على الجليد، وضبطإد لدرجة الحموضة 7-7،4 وتصفيتها، aliquoted في الصقور وتخزينها في -20 لأسابيع ° C.
  3. بعد ثلاثة يشطف في 1X PBS، permeabilize الخلايا في المثلج الباردة 0.4٪ تريتون X-100-PBS / 1X لمدة 5 دقائق على الجليد. ويمكن تعديل طول permeabilization تبعا لنوع الخلية NB: إذا اجتمع مع FISH DNA المناعي، ويجب أن يتم تنفيذ المناعية في هذه المرحلة (انظر القسم 4).
  4. بعد ثلاثة يشطف في 1X PBS، الخلايا احتضان بنسبة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ريبونوكلياز A PBS 1X في لمدة ساعة عند 37 ° C. توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي انخفاضا من 100 ميكرولتر من الحل على parafilm أو شريحة في غرفة رطبة. ثم يتم إزالة Coverslips بعناية مع ملقط. إذا واجهت أي مقاومة، ينبغي غمرت مع PBS 1X coverslips من أجل تجنب إتلاف الخلايا.
  5. بعد ثلاثة يشطف في 1X PBS، permeabilize الخلايا في المثلج الباردة 0.7٪ تريتون X-M-100 حمض الهيدروكلوريك / 0.1 لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  6. يشطف بعد ثلاث طن 1X PBS، الخلايا تفسد في حمض الهيدروكلوريك 1.9 متر لمدة 30 دقيقة في RT. بالتناوب، يمكن التشويه والتحريف الخلايا في SSC الفورماميد / 2X 50٪ في 75-80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. لاحظ أن طول التهجين (ودرجة الحرارة) قد يكون الأمثل اعتمادا على نوع الخلية.
  7. بعد ثلاثة يشطف في برنامج تلفزيوني 1X الجليد الباردة، هجن الخلايا مع تحقيقات ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية في غرفة مظلمة ورطبة. توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي انخفاضا من 15 ميكرولتر من التحقيق على شريحة، ومختومة مع الاسمنت والمطاط.

4. الأبعاد 3-المناعي-FISH - اليوم الأول (~ 6-7 ساعة)

  1. وبالنسبة للأسماك المناعي / DNA مجتمعة، ينبغي أن يؤديها المناعية تلطيخ بعد permeabilization 0.4٪ تريتون في-X-100 (الخطوة 3.3).
  2. احتضان الخلايا في عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة في RT (2.5٪ مصل الألبومين البقري (BSA)، و 10٪ مصل الماعز العادي، 0.1٪ توين-20). يتم تصفية حل حظر، aliquoted في Eppendorfs 1.5 مل وتخزينها لمonths في -20 ° C.
  3. احتضان خلايا مع الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت ضد البروتين أو تعديل هيستون في المصالح مخففة في حل حظر، لمدة ساعة عند RT في غرفة رطبة. هنا نعرض مثال على الأجسام المضادة ضد فسفرته 139-سيرين من H2AX (γ-H2AX، ميليبور، انظر الجدول 5 للتفاصيل). توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي انخفاضا من 100 ميكرولتر من الحل على parafilm أو شريحة في غرفة رطبة. ثم يتم إزالة Coverslips بعناية مع ملقط (1X PBS غمرت مع إذا لزم الأمر). ملاحظة أنه يجوز تعديل تخفيف وطول الحضانة تبعا لنوعية الأجسام المضادة والخلايا أنواع.
  4. غسل الخلايا في 0.2٪ BSA / 0.1٪ توين-20 / 1X PBS، ثلاث مرات في 5 دقائق RT مع اهتزاز.
  5. احتضان خلايا الجسم المضاد مع fluorophore، مترافق المناسبة الثانوية مخففة في عرقلة الحل لمدة ساعة عند RT في غرفة مظلمة ورطبة. هنا نعرض مثالا للكشف معالثانوية الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة (اليكسا فلور 488 أو 555، إينفيتروجن، انظر الجدول 5 للتفاصيل). ويمكن أيضا ناشبة، مترافق الأجسام المضادة الثانوية (البيوتين، digoxigenin، الخ) يمكن استخدامها. في هذه الحالة، يمكن إجراء خطوة إضافية للكشف المناسب (streptavidin، ومكافحة الحفر، الخ) سواء قبل أو بعد التهجين الحمض النووي FISH أكثر من الليل.
  6. شطف الخلايا في 0.1٪ توين-20 / 1X PBS، ثلاث مرات في 5 دقائق RT مع اهتزاز في الظلام.
  7. بعد الإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ / 1X PBS لمدة 10 دقيقة في RT في الظلام.
  8. تواصل FISH DNA على النحو الوارد أعلاه من الحضانة في ريبونوكلياز A (الخطوة 3.4).

5. الأبعاد 3-DNA FISH / المناعي FISH - اليوم الثاني (~ 2 ساعة)

  1. إزالة بعناية الاسمنت والمطاط، وcoverslips الفيضانات مع SSC 2X، وإزالة بعناية مع ملقط ووضعها في الآبار التي تحتوي على حل الغسيل.
  2. غسل الخلايا في SSC 2X لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام مع اهتزاز.
  3. غسل الخلايا في SSC 2X لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام مع اهتزاز.
  4. غسل الخلايا في 1X SSC لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام مع اهتزاز لاحظ أنه في حالة تمسخ مع الفورماميد، يجب أن يتم استبدال يغسل بما يلي:. يغسل يغسل 3 في الفورماميد / 2X SSC و3 50٪ في SSC 2X، 5 دقيقة لكل منها، في 37 ° C.
  5. تحميل الخلايا في إطالة متوسط ​​تصاعد الذهب تحتوي على 1.5 ميكروغرام / مل دابي (4،6-diamidino-2-phenylindole) لcounterstaining من DNA الكلي. توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي تراجع من 10-15 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة ومختومة مع طلاء الأظافر. يتم الاحتفاظ الشرائح لعدة أشهر في -20 ° C.

6. 3D المجهر والتحليل

  1. يمكن الحصول على صور 3D مع أنظمة المجهر مختلفة. في تجاربنا، يتم جمع الأجزاء البصرية بنسبة 0.3 ميكرون فصل على نظام SP5 ايكا مبائر AOBS (صوتية الحزمة الضوئية الفاصل). لاحظ أن الفصل بين البصريويمكن تعديل الطائرات L تبعا لنوع من التحليل.
  2. ويمكن تحليل الصور 3D باستخدام مداخن البرامج المختلفة والأدوات. نحن استخدام البرنامج J صورة لتقييم قياسات المسافة بين مواضع الاهتمام وتحليل أنواع مختلفة من رابطة مواضع في المصالح مع شبه حجرات النووية أو البروتينات.
  3. يتم تنفيذ كافة التحليلات الإحصائية لمقارنة اثنين (أو أكثر) الظروف البيولوجية المختلفة مع تقييم البشرى (ق) من أهمية: مقارنة بين أنواع مختلفة من الخلايا أو مراحل، والمقارنة بين مواضع مختلفة من الاهتمام. تؤخذ في جميع الاختبارات الإحصائية، P-القيم ≤ 5.00E-2 (A = 0.05) أن تكون كبيرة (1.00E-2 ≤ ≤ P-2 * 5.00E كبيرة؛ 1.00E-3 ≤ ≤ P-2 * 1.00E * هام جدا؛ P <1.00E-3 *** هامة للغاية).

التحليل الإحصائي للتوزيعات كامل مسافات بين اثنين من الأليلات، ونحن جيم أولonstruct التراكمي منحنيات التردد على توزيع مجموعة كاملة من مسافات تقاس بين alleles.To 2 تقييم أهمية الاختلافات في توزيع المسافات بين أليلية التجريبية نستخدم اللامعلمية لمدة عينة كولموغوروف-سميرنوف (KS) اختبار 13،14.

التحليل الإحصائي للارتباط وثيق (أي الاقتران) من اثنين من الأليلات باستخدام المسافة المثلى القطع. للتعرف على مجموعة من الاختلافات في المسافات أقوى بين اثنين من الأليلات أو مواضع، ونحن نستخدم سلسلة من ق 15 لمدة الذيل اختبار فيشر الدقيق. وهي، في كل مسافة قمنا بقياس اختبار ما إذا كان شرط واحد كبير ممثلة تمثيلا زائدا في أقصر المسافات بين العينتين. الحد الأدنى في توزيع القيم P-يشير إلى مجموعة من المسافات التي يجب أن تعتبر من المعالم لارتباط وثيق (أي الاقتران) من الأليلات اثنين. بعد ذلك يتم استخدام اختبار فيشر الدقيق لمدة الذيل رس تقييم أهمية الاقتران اثنين من الأليلات في قيمة قطع حددت 15. يتم تطبيق التصحيحات اختبار متعددة لحساب العدد الإجمالي للاختبارات أجريت فيشر 16.

التحليل الإحصائي لرابطة موضع في المصالح مع شبه حجرات النووية أو البروتينات. يستخدم اختبار ثنائي الذيل فيشر الدقيق لتحليل أهمية رابطة موضع في المصالح مع مقصورات مختلفة أو البروتينات 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتستخدم DNA والمناعية FISH في المختبر Skok لدراسة التغيرات في المؤسسة النووية المرتبطة بعملية إعادة التركيب من V J (D) من مواضع مستقبلات المستضد B والتنمية خلال T الخلايا اللمفاوية. تقنيات المفصلة أعلاه تمكننا من قياس المسافات ط) بين طرفي موضعا (انكماش) ​​الثاني) قياس المسافات بين الأليلات أو مواضع (الاقتران)، والثالث) تحليل الحمض النووي من التلف التي تحدث داخل مواضع، والرابع) تقييم موقع الأليلات وبالنسبة إلى مواضع النووية حجرات فرعية (المختلف pericentromeric القمعية في دراستنا)، والخامس) تقييم الارتباط من البروتينات النووية على الأليلات ومواضع (رابطة فسفرته هيستون H2AX γ-في دراستنا). على وجه الخصوص، قمنا بتحليل دور ديناميات مكان في تنظيم إعادة التركيب V J (D) من مواضع الغلوبولين المناعي في الخلايا النامية B 17-30، وفي تنظيم نسب التزام بين CD4 + T + CD8 والخلايا 14. ونحن أيضا تقييم الحمض النووي من التلف في واحد من مستقبلات موضع T-الخلية، Tcra / د، في تطوير خلايا T يحمل شكل متحولة من أصل 31 recombinase RAG2 البروتين.

الشكل 1
الشكل 1. تحليل المسافات بين اثنين من الأليلات أو مواضع. (A) أقسام متحد البؤر تظهر ممثل المفردة (الحق) أو الاقتران (يسار) في نوى الأليلات الفردية. تم إنشاء لجنة التحقيق FISH DNA من BAC (~ 200 كيلو بايت) تغطي موضع الاهتمام. تم قياس المسافات بين الأليلات بين مركز الكتلة كل إشارة في BAC مداخن صورة 3D. الدوائر متقطع تحديد الأشكال النواة. على نطاق والحانات = 1 ميكرومتر. (B) منحنيات التوزيع التكراري التراكمي تظهر مجموعة كاملة من المسافات بين أليل 2 ق تقاس شرطين البيولوجية المختلفة (البرية من نوع مقابل متحولة). تم استخدام اختبار اللامعلمية KS اثنين من عينة لتقييم أهمية الاختلافات بين التوزيعات اثنين. تم تقييم مجموعة من الاختلافات في أقوى بين أليلية المسافات باستخدام سلسلة من الاختبارات لمدة فيشر الدقيق الذيل (نقطة زرقاء). تم العثور على أقوى P-القيم (أعلى نقطة) لمسافات حوالي 1 ميكرون. وبالتالي تم تعيين النهائي للارتباط وثيق (أي الاقتران) من الأليلات 2 في 1 ميكرون حتى. (C) منحنيات التردد التراكمي تظهر المسافات بين الأليلات 2 0 حتي 1،5 ميكرومتر في شرطين البيولوجية المختلفة. وجرى تقييم أهمية الاقتران من الأليلات اثنين باستخدام اختبار فيشر لمدة الذيل الدقيق لوقف الإنتاج في 1 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الصفحة N-= "دائما"> الشكل 2
الشكل 2. تحليل الموقع من مكان قريب لشبه حجرات النووية. وفي دراساتنا نقوم بتحليل العلاقة بين مواضع لدينا من الفائدة والقمعية الفرعية النووية مقصورة التي شكلتها مغاير pericentromeric (PCH) 32. وتعتبر تقع الأليلات كما في PCH عندما تكون إشارة لBAC موضع الاهتمام مجاور أو تداخل مع الإشارة γ-الفضائية التي يهجن لPCH (لا بكسل بين حواف وBAC γ الساتلية إشارات FISH DNA). أقسام مبائر ممثل موقع الأليلات Tcra نسبة إلى PCH: (الأعلى) لا تقع في PCH أليل، (الشرق) واحد أليل في PCH، (أسفل) اثنين الأليلات في PCH. موضع باللون الأحمر، وγ الأقمار الصناعية في البيضاء. تبين الأسهم الصفراء الأليلات تقع في PCH. الدوائر متقطع تحديد الأشكال النواة. شريط مقياس = 1 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. تحليل لرابطة البروتينات النووية والتعديلات هيستون على موضع. (A) في الدراسات لدينا نقوم بتحليل العلاقة بين مواضع لدينا من الاهتمام وشكل فسفرته من H2AX هيستون (γ-H2AX)، للقراءة من لمضاعفة DNA الذين تقطعت بهم السبل فواصل 33. أقسام مبائر تظهر أمثلة من أي ارتباط γ-H2AX (الأعلى) أو جمعية على أليل Tcra واحد (القاع) في نوى الفردية. كما تم تحديد الأليلات المرتبطة H2AX γ-BAC إذا الإشارات وبؤر المناعي على الأقل جزئيا تتداخل (واحد على الأقل من colocalization بكسل). ويظهر في مكان الأحمر وγ H2AX في البيضاء. متقطع الدوائر ن مخططucleus الأشكال. مقياس بار = 1 ميكرومتر. ومن الجدير بالملاحظة أن يتم تنفيذ تحليلات colocalization للإشارة BAC مع PCH أو بؤر γ-H2AX يدويا باستخدام برنامج J صورة دون عتبة الآلي. (B) فقدان جزء من إشارة γ-H2AX بعد تمسخ هو أثارت واحدة من المسائل التقنية الرئيسية من هذا البروتوكول FISH المناعية DNA. هنا نعرض مثالا المناعي قبل (أعلى) وبعد (أسفل) العلاج القائم على حمض الهيدروكلوريك تمسخ (الفورماميد المعاملة اعطت نتائج مماثلة (لا يظهر)). على الرغم من أن إشارة كانت أضعف، والسمات الرئيسية للتلوين، ولا سيما عدد من البؤر، ما زالت بعد العلاج. باستخدام ايكا SP5 مبائر، كانت الإعدادات ليزر 561 قبل وبعد تمسخ ما يلي: قوة 35٪ / ربح الذكية في 730V، والقوة 45٪ / ربح الذكية في 750V، على التوالي. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا هنا مثال لتلطيخ المناعي لمدة ساعة هيستونodification، H3K27me3 (لوحات اليمين) تبين أن يمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى علامات أخرى هيستون، كما سبق نشره 1،3. ويرد γ-H2AX في الصفراء والحمراء في H3K27me3. الدوائر متقطع تحديد الأشكال النواة. شريط مقياس = 2 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

اسم الكاشف / المواد شركة عدد Catalogm تعليقات
H 2 O الصياد # BP2470
ريبونوكلياز A سيجما # R4642
dNTP سيجما # DNTP100
الكسا dUTP إينفيتروجن #C11397 إلى C-11401
Cy3 أو Cy5 dUTP الصياد # 45-001-XXX
الدناز I روش # 04536282001
DNA بول I Biolabs # M0209
0،025 ميكرون مرشحات ميليبور # VSWP02500
سرير DNA-1 1 ملغ / مل إينفيتروجن # 18440
Hybloc DNA 1 ملغ / مل علم الوراثة التطبيقية # MHB
سمك السلمون الحيوانات المنوية سيجما # D1626 أن مسحوق معلق في 10 ملغ / مل في H 2 O
NAAC (خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2، حل العازلة) سيجما # S7899
Ficoll 400 (مول بيول الصف) الصياد # 525
Polyvinylpyrrolidone (مول بيول الصف) الصياد # BP431
ديكستران سلفات مسحوق سيجما # D8906
SSPE (المالحة فوسفات الصوديوم EDTA-) 20X الحل الصياد # BP1328
الفورماميد الصياد # BP227
Coverslips الصياد # 12-548-B
الشرائح الصياد # 12-550
6 وحات جيدة الصياد # 0720080
PBS، 10X الصياد # MT-46-013-CM
سيجما # P8920
بارافورمالدهيد، حبيبات، 95٪ سيجما # 441244
تريتون X-100-، مول بيول الصف سيجما # T8787
BSA (ألبومين المصل البقري) الكسر V الصياد # BP 1600
مصل الماعز العادي ناقلات مختبرات # S-1000
توين-20، مول بيول الصف سيجما # P9416
SSC (المالحة سترات الصوديوم) 20X الحل الصياد # BP1325
إطالة الذهب كاشف antifade إينفيتروجن # P36930
دابي (4 '،6-diamidino-2-phenylindole) سيجما # D9542
أفضل اختبار المطاط معطف 1 الأسمنت مخازن الإمداد الفن أو المكتب

الجدول 1. الكواشف محددة والمعدات الصغيرة.

NT مع dUTP جانب اليكسا-fluorophores كمية تركيز النهائي
10 ميكروغرام DNA ميكرولتر X
ريبونوكلياز A - 0.17 ميكروغرام / ميكرولتر 10 ميكرولتر
H 2 O ملء إلى 260 ميكرولتر
المجموع - 30 دقيقة عند 37 ° C 260 ميكرولتر
10X العازلة NT 50 ميكرولتر 1X
100 ملي مول ويكونتا؛-المركابتويثانول 50 ميكرولتر 10 ميكرومتر
dNTP مزيج 40 ميكرولتر 40 ميكرون كل dNTP
0.1 مم dTTP 50 ميكرولتر 10 ميكرومتر
1 ملم اليكسا dUTP 12 ميكرولتر 30 ميكرون
الدناز I (العمل الحل، انظر الجدول أدناه) 30 ميكرولتر
DNA بول I 7،5 ميكروليتر 15 U / مل
المجموع - 2 ساعة في 16 ° C 500 ميكرولتر
NT مع dUTP جانب Cy3 أو Cy5 كمية تركيز النهائي
10 ميكروغرام DNA ميكرولتر X
ريبونوكلياز A - 0.17 ميكروغرام / ميكرولتر 10 ميكرولتر
H 2 O ملء إلى 300 ميكرولتر
المجموع - 30 دقيقة عند 37 ° C 300 ميكرولتر
10X العازلة NT 50 ميكرولتر 1X
β-100 ملي مول المركابتويثانول 50 ميكرولتر 10 ميكرومتر
dNTP مزيج 50 ميكرولتر 50 ميكرومتر كل dNTP
1 ملم Cy3 أو Cy5 dUTP- 12 ميكرولتر 30 ميكرون
الدناز I ~ 30 ميكرولتر ~ 1،2 U / ميكرولتر
DNA بول I 7،5 ميكروليتر 15 U / مل
المجموع - 2 ساعة في 16 ° C 500 ميكرولتر

الجدول 2. ريبونوكلياز A العلاج والترجمة نيك لDNA ميكروغرام 10.

حلول أسهم
ريبونوكلياز A العمل الحل: 0.17 ميكروغرام / ميكرولتر تتكون جديدة
10X العازلة NT: 0.5M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8 و 50 ملم MgCl 0.5 ملغ / مل BSA 1.5 مل أنابيب في -20 ° C.
مزيج dNTP: dATP، dCTP، وdGTP: 0.5mM في كل من H 2 O 1.5 مل أنابيب في -20 ° C
الدناز I: محلول المخزون: 20000 أعيد تشكيلها في U / مل في 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5/50٪ كلوريد الصوديوم ملي glycerol/50 0.5 مل أنابيب في -20 ° C
العمل الحل: يجب اختبار كل دفعة جديدة من حل الدناز I الأسهم في التخفيفات مختلفة (10 U / مل، 20 U / مل و 40 U / مل في H 2 O). التخفيف إعطاء مسحة DNA بين 100 و 1،000 بي بي (انظروينبغي أن تستخدم الخطوة 5) كحل العمل. تتكون جديدة

الجدول 3. حلول للريبونوكلياز A العلاج والترجمة نيك.

التهجين العازلة حلول أسهم
10٪ 50X Denhardt في الحل: 1 غرام Ficoll 400، 1 غرام Polyvinylpyrrolidone و 100 مل H 2 0 - تمت تصفيتها 50 مل الصقر في -20 ° C
40٪ 25٪ كبريتات ديكستران: يذوب مسحوق كبريتات ديكستران في SSPE 12.5x في 37-65 ° C 50 مل الصقر في -20 ° C
50٪ الفورماميد زجاجات +4 ° C في
يتم تخزين مأخوذة في Eppendorfs 1.5 مل في -20 ودرجة؛ C

الجدول 4. العازلة التهجين.

</ TR>
الأجسام المضادة مزود كتالوج رقم تخفيف
γ-H2AX - H2A.X الفوسفات، استنساخ JBW301، والماوس وحيدة النسيلة ميليبور # 05636 1/200
H3K27me3، استنساخ، الأرنب بولكلونل ميليبور # 07449 1/200
الكسا فلور 555 حمار مكافحة الماوس إينفيتروجن # A-31570 1/500
الكسا 488 فلور الماعز المضادة للماوس إينفيتروجن # A-11001 1/500
الكسا 488 فلور الماعز المضادة للأرنب إينفيتروجن # A-11008 1/500

الجدول 5. الأجسام المضادة الأولية والثانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم استخدام تقنيات المفصلة أعلاه في المختبر لتحليل تنظيم إعادة التركيب V J (D) من الغلوبولين المناعي ومواضع Tcra / د في تطوير الخلايا الليمفاوية 30،31. ونحن واثقون من أن يمكن تكييفها هذه التقنية للكشف عن البروتينات النووية المختلفة، مقصورات النووية ومواضع، في مختلف أنواع الخلايا. قد إدخال تعديلات على بروتوكول يلزم، وفي هذه الحالة الخطوات الرئيسية على التركيز على ما يلي. أولا، يمكن ضبط طول permeabilization تبعا لنوع الخلية. ويمكن أيضا ثاني طول حضانة الأجسام المضادة الأولية أن تعدل وفقا لنوعية الأجسام المضادة ووفرة من البروتين من الفائدة (على سبيل المثال في بعض الحالات، قد يتم تنفيذ الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية). الأهم، يمكن تكييفها الخطوة تمسخ، ويمكن استبدال حمض الهيدروكلوريك العلاج تمسخ في الفورماميد 3،4،34 وهيدروكسيد الصوديوم لFISH DNA 20. كرر أيضاويمكن تطبيق إد تجميد ذوبان الجليد دورات النيتروجين السائل إلى الخلايا بعد تثبيت / permeabilization للأسماك DNA وحدها 4،34. وأخيرا، في حين تم إجراء تعديلات بسيطة عدة، RNA البلمرة وشارك II-الكشف عن العوامل بنجاح باستخدام هذا الأسلوب 30،35، قد يتم تنفيذ المناعية لبروتينات تلطيخ النووية الأخرى بعد التهجين الحمض النووي FISH 4.

يمكن تحليل الصور 3D تنطوي على استخدام أنواع مختلفة من المجاهر، بما في ذلك مجال واسع epifluorescence (إلى جانب deconvolution) ومتحد البؤر المجهري ليزر 36. اختيار طريقة التصوير سيعتمد على القرار المطلوب، وعدد من fluorophores، وعمق من العينات ونوعية الإشارات DNA والبروتين. تطوير المجاهر عالية الدقة جديدة يفتح طريقا جديدا تماما في التصور الدقيق للعمليات النووية والخلوية 37-39. وعلاوة على ذلك، وتقنيات جديدة لgeneratioن حسب الطلب تحقيقات التي لا تحتوي على تسلسل المتكررة تمكين الكشف نظيفة من المناطق الجينية، من مكان 15 كيلوبايت محددة، إلى تجمعات معقدة من exons متماثلة 40. هذا يزيد من دقة وحساسية عالية الدقة المجهر في تتبع ديناميات العمليات النووية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

نود أن نشكر أعضاء المختبر Skok، وخاصة سوزانا هيويت، لإجراء مناقشات وتعليقات. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01GM086852، RC1CA145746 (JAS). JAS هو سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية عالم المجتمع. JC هو زميل معهد [إيرفينغتون] من معهد أبحاث السرطان. ويدعم MM من قبل الوطنية للعلوم منحة التعليم مؤسسة دراسات عليا التكاملية والبحوث التدريبية (NSF IGERT 0333389).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H2O Fisher # BP2470
RNase A Sigma # R4642
dNTP Sigma # DNTP100
Alexa dUTP Invitrogen # C11397 to C-11401
Cy3 or Cy5 dUTP Fisher # 45-001-xxx
DNase I Roche # 04536282001
DNA Pol I Biolabs # M0209
0.025 μm filters Millipore # VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen # 18440
Hybloc DNA 1 mg/ml Applied Genetics # MHB
Salmon sperm Sigma # D1626 powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) Sigma # S7899
Ficoll 400 (Mol Biol grade) Fisher # 525
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) Fisher # BP431
Dextran sulfate powder Sigma # D8906
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution Fisher # BP1328
Formamide Fisher # BP227
Coverslips Fisher # 12-548-B
Slides Fisher # 12-550
6-well plates Fisher # 0720080
PBS, 10x Fisher # MT-46-013-CM
Poly-L-lysine solution Sigma # P8920
Paraformaldehyde, prills, 95% Sigma # 441244
Triton-X-100, Mol Biol grade Sigma # T8787
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V Fisher # BP 1600
Normal goat serum Vector Labs # S-1000
Tween-20, Mol Biol grade Sigma # P9416
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution Fisher # BP1325
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen # P36930
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma # D9542
Best test one coat rubber cement Art or office supply stores
Table 1. Specific reagents and small equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. 376-405 (2004).
  2. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
  3. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
  4. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
  5. Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
  6. Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
  7. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
  8. Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
  9. Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
  10. Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
  11. Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
  12. van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
  13. Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
  14. Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
  15. Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
  16. Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
  17. Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
  18. Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
  19. Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
  20. Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
  21. Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. (2012).
  22. Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
  23. Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
  24. Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
  25. Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
  26. Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
  27. Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
  28. Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
  29. Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
  30. Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
  31. Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
  32. Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
  33. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
  34. Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
  35. Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  36. Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
  37. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
  38. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
  39. Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. 899-909 (2011).
  40. Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaumeil, J., Micsinai, M., Skok, J. A. Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization. J. Vis. Exp. (72), e50087, doi:10.3791/50087 (2013).More

Chaumeil, J., Micsinai, M., Skok, J. A. Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization. J. Vis. Exp. (72), e50087, doi:10.3791/50087 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter