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Biology

संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस और 3 डी संरक्षित अंतरावस्था नाभिक पर डीएनए मछली 3D परमाणु संगठन में परिवर्तन का अध्ययन

doi: 10.3791/50087 Published: February 3, 2013

Summary

यहाँ हम डीएनए मछली द्वारा immunofluorescence और डीएनए दृश्यों 3 डी माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण (3 डी मछली इम्युनो डीएनए) द्वारा पीछा द्वारा histone संशोधनों के साथ - साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

स्वस्थानी तीन dimensionally संरक्षित 3 डी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा नाभिक पर डीएनए जांच का उपयोग संकरण में प्रतिदीप्त (3 डी डीएनए मछली) सबसे सीधा जीन loci के स्थान, उप क्षेत्रों गुणसूत्र या व्यक्ति की कोशिकाओं में पूरे प्रदेशों कल्पना का प्रतिनिधित्व करता है. विश्लेषण के इस प्रकार के नाभिक की वैश्विक वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट जीनोमिक loci और क्षेत्रों परमाणु अंतरिक्ष के भीतर के व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. इम्यूनोफ्लोरेसेंस, दूसरे हाथ पर, परमाणु प्रोटीन (संशोधित histones, histone वेरिएंट और संशोधक, प्रतिलेखन मशीनरी और कारकों, परमाणु उप डिब्बों, आदि) का पता लगाने की अनुमति देता है. immunofluorescence और 3 डी डीएनए में मछली के संयोजन में प्रमुख चुनौती एक एंटीबॉडी द्वारा नाभिक के 3 डी वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता लगाया मिलान रक्षा हाथ पर है, और दूसरे हाथ पर, का पता लगाने के लिए डीएनए जांच की पहुंच की अनुमति जीन loci या गुणसूत्र प्रदेशों 1-5. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल कि 3 डी संरक्षित नाभिक में जीनोमिक loci के साथ chromatin संशोधनों के दृश्य को जोड़ती है प्रदान करते हैं.

Introduction

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Epigenetic तंत्र ट्रिगर स्थापना और विकास और सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional प्रोफाइल की विरासत है. एक स्तर पर इस chromatin पैकेजिंग है कि सक्रिय या चुप जीनोमिक क्षेत्रों को परिभाषित मॉडुलन शामिल है. एक बड़े पैमाने पर, जीनोम और परमाणु वास्तुकला की वैश्विक 3D संगठन भी transcriptional पैटर्न के नियंत्रण में एक भूमिका निभाते हैं. इस प्रकार, इन epigenomic सुविधाओं का विच्छेदन कैसे जीन 6-11 विनियमित रहे हैं की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है.

संयुक्त immunofluorescence और 3 डी डीएनए मछली एक अद्वितीय विशिष्ट बातचीत / डीएनए दृश्यों और / या प्रोटीन नाभिक के भीतर के संघों का आकलन करके आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के पूरक का अवसर प्रदान करते हैं. इसके अलावा, जबकि जीनोम चौड़ा chromatin immunoprecipitation (चिप seq) या गुणसूत्र पर कब्जा गहरी अनुक्रमण के साथ मिलकर रचना के रूप में इस तरह के उच्च throughput तकनीक (4C seq, 5C, हाय - सी) वैश्विक dat प्रदानसेल 12 आबादी पर एक, इम्यूनोफ्लोरेसेंस डीएनए / मछली तकनीक एकल कोशिका के स्तर पर विश्लेषण सक्षम.

यहाँ हम डीएनए मछली द्वारा immunofluorescence और डीएनए दृश्यों 3 डी माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण (3D इम्युनो मछली) द्वारा पीछा द्वारा histone संशोधनों के साथ - साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का लाभ डीएनए और प्रोटीन संरचनाओं के संरक्षण के संयुक्त दृश्य है. इस क्षेत्र में हमारा अनुभव हमें सक्षम है सुधार करने के लिए और मौजूदा प्रोटोकॉल को सरल. हालांकि हम इस प्रोटोकॉल पुनर्संयोजन के दौर से गुजर लिम्फोसाइटों में डीएनए डबल असहाय टूट का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया है, इस विधि अन्य प्रोटीन और अन्य सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.

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Protocol

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1. डीएनए fluorophores साथ जांच लेबल: निक अनुवाद (~ 6 घंटा)

  1. स्वच्छ बीएसी डीएनए (मैक्सी प्रस्तुत करने द्वारा तैयार) या plasmids या पीसीआर उत्पादों, सभी एच 2 हे में resuspended, लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नोट है कि एक मजबूत मछली संकेत के लिए, जांच अवधि कम से कम 10 केबी चाहिए.
  2. RNase में डीएनए सेते पर 30 मिनट के लिए 37 ° C (सभी अभिकर्मकों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं).
  3. 16 में 2 घंटे के लिए निक अनुवाद प्रतिक्रिया सेते ° सी (2 टेबल्स और 3 देखें). प्रत्यक्ष लेबलिंग के वैकल्पिक तरीकों (मछली टैग, Invitrogen उदाहरण) इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. -80 में एक घंटा के लिए प्रतिक्रिया निष्क्रिय डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर
  5. 2% agarose जेल पर जांच आकार का निर्धारण करते हैं. धब्बा लगभग 300-500 बीपी (ध्यान दें कि Cy5 जांच के धब्बा दिखाई नहीं देता है) में बहुमत के साथ 100 और 1,000 बीपी के बीच होना चाहिए. अगर डीएनए पर्याप्त नहीं पच जाता है, अधिक डीएनए पोल और मैंDNase मैं प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है और 16 डिग्री सेल्सियस पर दो अधिक घंटे के लिए incubated
  6. दो लीटर एच के साथ अंधेरे में दो घंटे के लिए 0 2 beakers भरा में 0.025 मिमी फिल्टर पर जांच शुद्ध.
  7. के रूप में निम्नानुसार जांच करने के लिए अवरुद्ध कारकों जोड़ें: खटिया एक डीएनए के 10 ग्राम, Hybloc डीएनए के 10 ग्राम और 10 ग्राम के लिए डीएनए जांच की सामन शुक्राणु की 100 ग्राम. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर डीएनए जांच

2. जांच वर्षा विकृतीकरण / / पूर्व annealing (3-4 घंटा)

  1. Coverslip प्रति 0.3 ग्राम और डीएनए जांच की 1 ग्राम के बीच किया जाता है. 3M (5.2 पीएच) राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद और 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों के 0.1 मात्रा के साथ मिक्स जांच -80 में एक घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात और 13,000 rpm पर नीचे 4 सी ° 30 मिनट के लिए स्पिन. ध्यान दें कि डीएनए जांच की राशि डीएनए की गुणवत्ता और संकरण के परमाणु क्षेत्र के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. प्रत्यक्ष लेबलिंग के वैकल्पिक तरीकों की कम मात्रा के इस्तेमाल की अनुमति दे सकता हैजांच. एक स्लाइड पर कई डीएनए मछली संकेतों का पता लगाने के लिए विभिन्न जांच एक साथ उपजी जा सकता (जांच कि पूर्व annealed नहीं होना चाहिए, जैसे दोहराने दृश्यों को छोड़कर). कई प्रयोगों के लिए एक ही समय में प्रदर्शन जांच भी उपजी एक साथ किया जा सकता है. हिमपात हल्के रंग का प्रयोग किया जाता है (अगर जांच की छोटी मात्रा में उपजी हैं, गोली दिखाई नहीं हो सकता) fluorophores के अनुसार किया जाना चाहिए.
  2. सूखी छर्रों और उन्हें 15 μl संकरण बफर में resuspend (4 टेबल देखें) अंधेरे में (एक Eppendorf thermomixer का उपयोग) के साथ 37-45 में मिलाते coverslip प्रति डिग्री सेल्सियस (लगभग 20 मिनट के लिए).
  3. 75-95 में 5 मिनट के लिए denature जांच ° सी.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए जांच पूर्व पानी रखना. पूर्व annealing लंबाई जटिलता और जांच की गुणवत्ता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.
  5. संकरण के लिए रातोंरात coverslips (देखें धारा 3) के लिए जांच को लागू.

3. 3आयामी डीएनए मछली - प्रथम दिवस (~ 3 घंटा)

  1. गैर पक्षपाती कोशिकाओं 1x पीबीएस (~ 2x10 5-10 coverslip प्रति μl 1x पीबीएस में 5 कोशिकाओं) की एक छोटी मात्रा में ध्यान केंद्रित कर रहे हैं और एक पाली एल lysine लेपित coverslip के केंद्र पर गिरा दिया. पक्षपाती कोशिकाओं coverslips पर कम से कम 24 घंटा (~ 70% संगम) (coverslips जेलाटीन 0.1% के साथ लेपित किया जा सकता है) के लिए सभ्य होना चाहिए. स्क्वायर 18x18 24-24 मिमी coverslips 6 अच्छी तरह प्लेटें में रखा जाता है, और प्रोटोकॉल भर में, प्रत्येक समाधान के दो मिलीलीटर प्रति प्रयोग किया जाता है (वैकल्पिक रूप दौर 1.5 मिमी coverslips 12/24-well प्लेटों में रखा जा सकता है).
  2. 2% paraformaldehyde / 1x पीबीएस, 7-7.4 पीएच में कोशिकाओं RT (4% पीएफए ​​शेयरों, aliquoted -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है) में 10 मिनट के लिए, ठीक है. Paraformaldehyde समाधान में खरीदा जा सकता है (16%), या 4% शेयर समाधान / पाउडर prills से तैयार किया जा सकता है. Paraformaldehyde पाउडर 1x पीबीएस में> 60 ° C (पीएच 8-9 करने के लिए बढ़ाया जा सकता है विघटन की सुविधा), बर्फ पर ठंडा नीचे समायोजित करने के लिए, पर भंग कर रहा है7-7.4 पीएच एड, फ़िल्टर, फाल्कस् में aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर सप्ताह के लिए भंडारित
  3. 1x पीबीएस में तीन rinses के बाद, आइस्ड ठंड 0.4% ट्राइटन-X-100 / 1x पीबीएस में बर्फ पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize. की लंबाई permeabilization सेल प्रकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है नायब: यदि डीएनए मछली immunofluorescence के साथ संयुक्त है, immunostaining इस स्तर पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए (धारा 4 देखें).
  4. 1x पीबीएस, सेते कोशिकाओं में rinses के बाद एक घंटे के लिए 0.1 ग्राम / 1x पीबीएस में μl RNase एक 37 डिग्री सेल्सियस के साथ तीन Coverslips सेल पक्ष parafilm पर समाधान या एक नम चैम्बर में एक स्लाइड के 100 μl की एक बूंद पर नीचे रखा जाता है. Coverslips तो ध्यान संदंश से हटाया. यदि किसी भी प्रतिरोध का सामना करना पड़ा है, coverslips 1x पीबीएस के साथ बाढ़ किया जाना चाहिए क्रम में कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए.
  5. 1x पीबीएस में तीन rinses के बाद, आइस्ड ठंड 0.7% ट्राइटन-X-100 / 0.1 एम एचसीएल में बर्फ पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize.
  6. मैं तीन rinses के बादn 1x पीबीएस, आरटी पर 30 मिनट के लिए 1.9 एम एचसीएल में denature कोशिकाओं. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को 75-80 डिग्री सेल्सियस पर 50% / Formamide 2x एसएससी में विकृत किया जा सकता है कम से कम 30 मिनट के लिए ध्यान दें कि संकरण लंबाई (और तापमान) सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है.
  7. ठंडा 1x पीबीएस में तीन rinses के बाद, 37 पर रात भर ° C एक अंधेरे और उमस भरे कक्ष में जांच के साथ कोशिकाओं संकरण. सेल - पक्ष Coverslips रखा जाता है नीचे एक स्लाइड पर जांच की 15 μl की एक बूंद पर, और रबर सीमेंट के साथ सील.

4. तीन आयामी इम्यूनो - मछली - प्रथम दिवस (~ 6-7 घंटे)

  1. संयुक्त मछली / immunofluorescence डीएनए के लिए, इम्युनो धुंधला 0.4% ट्राइटन-X 100 (3.3 चरण) में permeabilization के बाद किया जाना चाहिए.
  2. आरटी पर 30 मिनट (2.5% गोजातीय सीरम albumin (BSA), 10% सामान्य बकरी सीरम, 0.1% बीच 20) के लिए समाधान को रोकने में कोशिकाओं सेते हैं. अवरुद्ध समाधान फ़िल्टर, 1.5 मिलीलीटर Eppendorfs में aliquoted और मीटर के लिए संग्रहीत-20 डिग्री सेल्सियस पर onths
  3. प्राथमिक प्रोटीन या अवरुद्ध समाधान में पतला ब्याज की histone संशोधन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं आरटी पर एक घंटे के लिए एक नम कक्ष में सेते हैं. यहाँ हम H2AX (विवरण के लिए 5 तालिका देखें γ H2AX, Millipore) phosphorylated सेरीन-139 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के उदाहरण दिखाते हैं. Coverslips सेल पक्ष parafilm पर समाधान या एक नम चैम्बर में एक स्लाइड के 100 μl की एक बूंद पर नीचे रखा जाता है. Coverslips तो ध्यान संदंश (यदि आवश्यक 1x पीबीएस के साथ बाढ़) के साथ हटा दिया नोट है कि कमजोर पड़ने और ऊष्मायन लंबाई एंटीबॉडी और सेल प्रकार की गुणवत्ता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.
  4. 0.2% BSA / 0.1% Tween-20 / 1x पीबीएस, तीन बार मिलाते साथ आरटी पर 5 मिनट. कोशिकाओं धो
  5. उपयुक्त fluorophore संयुग्मित माध्यमिक आरटी पर एक घंटे के लिए अंधेरे और उमस भरे कक्ष में समाधान रोकने में पतला एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं सेते हैं. यहाँ हम एक साथ पता लगाने के एक उदाहरण दिखामाध्यमिक बकरी विरोधी माउस प्रतिरक्षी (Alexa Fluor 488 या 555, Invitrogen, जानकारी के लिए 5 तालिका देखें). Hapten संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (बायोटिन, digoxigenin, आदि) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, उपयुक्त पता लगाने (streptavidin विरोधी खुदाई, आदि) के लिए एक अतिरिक्त कदम अधिक रात मछली डीएनए संकरण से पहले या बाद में या तो प्रदर्शन कर सकते हैं.
  6. 0.1% में कोशिकाओं कुल्ला बीच 20 / 1x पीबीएस, तीन बार अंधेरे में झटकों के साथ आरटी पर 5 मिनट.
  7. 2% / आरटी पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में paraformaldehyde 1x पीबीएस में परसर्ग कोशिकाओं.
  8. डीएनए रूप में RNase A (3.4 चरण) में गर्मी से ऊपर मछली जारी.

5. 3 आयामी डीएनए / इम्यूनो मछली मछली - दूसरे दिन (~ 2 घंटा)

  1. ध्यान से रबर सीमेंट निकाल, 2x एसएससी के साथ बाढ़ coverslips, संदंश के साथ सावधानी से हटाने और उन्हें धोने समाधान युक्त कुओं में जगह.
  2. 2x एसएससी में 37 में 30 मिनट ° झटकों के साथ अंधेरे में सी के लिए कोशिकाओं को धो लें.
  3. 2x एसएससी में झटकों के साथ अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लें.
  4. कोशिकाओं में 1x एसएससी झटकों के साथ अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए ध्यान दें कि Formamide साथ विकृतीकरण के मामले में, washes निम्नलिखित द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए धो: 3 washes 50% 2x एसएससी, 5 / Formamide 2x एसएससी और 3 washes में प्रत्येक 37 में न्यूनतम ° सी.
  5. गोल्ड बढ़ते डीएनए की कुल counterstaining के लिए 1.5 ग्राम / मिलीलीटर DAPI (4,6 - diamidino-2-phenylindole) युक्त मध्यम लम्बा कोशिकाओं माउंट. सेल - पक्ष Coverslips रखा जाता है नीचे और स्लाइड पर बढ़ते मध्यम के 10-15 μl की एक बूंद पर नेल पॉलिश के साथ सील. स्लाइड महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है

6. 3 डी माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण

  1. 3 डी छवियों अलग खुर्दबीन सिस्टम के साथ प्राप्त किया जा सकता है. हमारे प्रयोगों में, ऑप्टिकल 0.3 सुक्ष्ममापी द्वारा अलग वर्गों एक Leica SP5 AOBS confocal प्रणाली (Acousto ऑप्टिकल बीम फाड़नेवाला) पर एकत्र कर रहे हैं नोट कि optica के बीच अलगावएल विमानों विश्लेषण के प्रकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.
  2. 3 डी छवि के ढेर अलग सॉफ्टवेयर और उपकरणों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. हम छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए ब्याज की loci के बीच दूरी की माप का आकलन करने के लिए और उप परमाणु डिब्बों या प्रोटीन के साथ ब्याज की loci के सहयोग के विभिन्न प्रकार का विश्लेषण.
  3. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं या चरणों के बीच तुलना हित के विभिन्न loci के बीच तुलना: सभी सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए दोनों के बीच तुलना (या अधिक) जोड़ो महत्व का मूल्यांकन (ओं) के साथ अलग जैविक स्थितियों प्रदर्शन कर रहे हैं. सांख्यिकीय सभी परीक्षणों में ≤ 5.00E-2 (= 0.05) पी मूल्यों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है (1.00E-2 के लिए लिया जाता है ≤ ≤ 5.00E-2 पी * महत्वपूर्ण, 1.00E-3 ≤ पी ≤ 1.00E-2 * * बहुत महत्वपूर्ण, <1.00E-3 *** अत्यधिक महत्वपूर्ण पी).

दो alleles के बीच दूरी के पूरे वितरण के सांख्यिकीय विश्लेषण हम पहली गदो alleles.To बीच मापा दूरी अनुभवजन्य के अंतर allelic दूरी हम दो नमूना Kolmogorov Smirnov (KS) परीक्षण 13,14 nonparametric के वितरण में मतभेद के महत्व का आकलन की पूरी रेंज पर संचयी वितरण आवृत्ति घटता onstruct.

दो एक इष्टतम दूरी काट का उपयोग alleles के निकट सहयोग से (यानी बाँधना) के सांख्यिकीय विश्लेषण दो alleles या loci के बीच की दूरी में सबसे मजबूत मतभेद की सीमा को पहचानने, हम दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण 15 की एक श्रृंखला का उपयोग करें. अर्थात्, हम परीक्षण है कि एक हालत काफी दो नमूनों के बीच कम दूरी पर ज्यादा प्रतिनिधित्व प्रत्येक मापा दूरी पर. पी मूल्यों के वितरण में न्यूनतम दूरी है कि एक दो alleles के घनिष्ठ संघ (यानी बाँधना) के लिए कट ऑफ के रूप में विचार किया जाना चाहिए की सीमा को इंगित करता है. इसके बाद दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण टी प्रयोग किया जाता हैओ पहचान की कट ऑफ 15 मूल्य में दो alleles के बाँधना के महत्व का आकलन. एकाधिक परीक्षण सुधार फिशर परीक्षण की कुल संख्या के लिए खाते में लागू कर रहे हैं 16 प्रदर्शन.

उप परमाणु डिब्बों या प्रोटीन के साथ ब्याज की बिन्दुपथ के सहयोग के सांख्यिकीय विश्लेषण दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण करने के लिए अलग अलग डिब्बों या 15 प्रोटीन के साथ ब्याज की बिन्दुपथ के सहयोग के महत्व का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Representative Results

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डीएनए और इम्युनो मछली Skok प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है बी और टी लिम्फोसाइट विकास के दौरान वी (डी) जम्मू पुनर्संयोजन के प्रतिजन रिसेप्टर loci की प्रक्रिया के साथ जुड़े परमाणु संगठन में परिवर्तन का अध्ययन कर रहे हैं. ऊपर विस्तृत तकनीक हमें i) एक ठिकाना (संकुचन) के दोनों सिरों के बीच दूरी उपाय ii) alleles या loci (बाँधना) के बीच उपाय दूरी, iii) डीएनए loci, चतुर्थ के भीतर होने वाली क्षति का विश्लेषण करने के लिए सक्षम) alleles के स्थान का आकलन और परमाणु के सापेक्ष उप डिब्बों (हमारे अध्ययन में दमनकारी pericentromeric heterochromatin), और वी loci) alleles और loci (हमारे अध्ययन में phosphorylated histone γ-H2AX संघ) पर परमाणु प्रोटीन के सहयोग का आकलन. विशेष रूप से, हम वी (डी) बी 17-30 कोशिकाओं को विकसित करने में इम्यूनोग्लोबिन loci के जम्मू पुनर्संयोजन के नियमन में बिन्दुपथ गतिकी की भूमिका का विश्लेषण किया है, और CD4 के बीच वंश प्रतिबद्धता के नियमन में + और ​​CD8 + टी14 कोशिकाओं. हम भी एक टी सेल रिसेप्टर बिन्दुपथ, घ / Tcra के टी recombinase प्रोटीन RAG2 31 की एक उत्परिवर्ती फार्म ले कोशिकाओं के विकास में डीएनए की क्षति का आकलन किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. दो alleles या loci के बीच दूरी का विश्लेषण (ए) Confocal वर्गों प्रतिनिधि (दाएं) unpaired या बनती व्यक्ति नाभिक में (बाएं) alleles दिखा. डीएनए मछली जांच एक (~ 200 केबी) बीएसी ब्याज का ठिकाना फैले से उत्पन्न किया गया. Alleles के बीच की दूरी 3 डी छवि के ढेर में प्रत्येक बीएसी संकेत के द्रव्यमान का केंद्र के बीच मापा गया. डैश्ड हलकों नाभिक आकृतियों रूपरेखा. स्केल सलाखों = 1 सुक्ष्ममापी. (बी) संचयी आवृत्ति वितरण घटता दो एलील के बीच दूरी की संपूर्ण रेंज दिखाएस दो अलग जैविक शर्तों (जंगली प्रकार बनाम उत्परिवर्ती) में मापा जाता है. nonparametric दो नमूना KS परीक्षण करने के लिए दो वितरण के बीच मतभेद के महत्व का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अंतर - allelic दूरी में सबसे मजबूत मतभेद की सीमा दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण (नीले डॉट्स) की एक श्रृंखला का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. सबसे मजबूत पी मान (उच्च डॉट्स) 1 सुक्ष्ममापी चारों ओर दूरी के लिए पाया गया. इस प्रकार दो alleles के घनिष्ठ संघ (यानी बाँधना) के लिए कट ऑफ 1 सुक्ष्ममापी में स्थापित किया गया था. (सी) संचयी आवृत्ति curves दो अलग जैविक स्थितियों में 0 से 1.5 सुक्ष्ममापी से दो alleles के बीच की दूरी को दर्शाता है. दो alleles के बाँधना के महत्व 1 सुक्ष्ममापी पर एक कट ऑफ के लिए दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 2. हमारे अध्ययन में हम ब्याज की हमारे loci और दमनकारी उप परमाणु pericentromeric (PCH) heterochromatin 32 द्वारा गठित डिब्बे के बीच संबंध का विश्लेषण लिए एक उप परमाणु डिब्बों को सापेक्ष बिन्दुपथ के स्थान का विश्लेषण. Alleles के रूप में माना जाता है PCH में स्थित जब ब्याज की लोकस के लिए बीएसी संकेत आसन्न या γ उपग्रह संकेत है कि PCH (बीएसी और γ उपग्रह डीएनए मछली संकेतों के किनारों के बीच में कोई पिक्सेल) hybridizes साथ अतिव्यापी है. Confocal वर्गों Tcra PCH के सापेक्ष alleles के स्थान के प्रतिनिधि: (शीर्ष) नहीं PCH में स्थित एलील, (मध्य) PCH में एक एलील (नीचे) PCH में दो alleles. लाल रंग में लोकस, सफेद में और γ उपग्रह. पीला तीर PCH में स्थित alleles दिखाने. डैश्ड हलकों नाभिक आकृतियों रूपरेखा. पैमाने बार = 1 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा 3. परमाणु प्रोटीन और एक ठिकाना पर histone संशोधनों के सहयोग का विश्लेषण (ए) हमारे अध्ययन में हम ब्याज की हमारे loci और histone H2AX (γ-H2AX) phosphorylated फार्म के बीच संबंध का विश्लेषण, डीएनए डबल के लिए के रूप में पढ़ने के लिए बाहर असहाय 33 टूटता है. Confocal वर्गों एक व्यक्ति नाभिक में Tcra एलील (नीचे) पर कोई γ H2AX (शीर्ष) संघ या संघ के उदाहरणों से पता चलता है. Alleles रूप में γ H2AX साथ जुड़े में परिभाषित किया गया है अगर बीएसी संकेतों और immunofluorescence foci थे कम से कम आंशिक रूप से छा (colocalization की कम से कम एक पिक्सेल). लोकस लाल और सफेद में γ-H2AX में दिखाया गया है. डैश्ड रूपरेखा n हलकोंucleus आकार. स्केल बार = 1 सुक्ष्ममापी यह ध्यान दें कि PCH या γ-H2AX foci के साथ बीएसी संकेत के colocalization विश्लेषण मैन्युअल रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं स्वचालित सीमा के बिना छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बाद विकृतीकरण है (बी) संकेत γ-H2AX का हिस्सा की हानि एक मुख्य तकनीकी सवालों का इस मछली इम्युनो डीएनए प्रोटोकॉल द्वारा उठाए गए. यहाँ हम (शीर्ष) पहले और (नीचे) विकृतीकरण एचसीएल आधारित उपचार (Formamide उपचार इसी तरह के परिणाम दे दी है (नहीं दिखाया)) के बाद immunofluorescence का एक उदाहरण दिखाते हैं. हालांकि संकेत कमजोर था, की मुख्य विशेषताएं इस धुंधला हो जाना, विशेष रूप से foci की संख्या, इलाज के बाद रहते हैं. एक SP5 Leica confocal का उपयोग, विकृतीकरण के पहले और बाद में 561 लेजर के लिए सेटिंग्स निम्न थे: 35% बिजली / 730V में स्मार्ट लाभ, और 45% बिजली / 750v स्मार्ट लाभ, क्रमशः. इसके अलावा, हम एक और histone मीटर के लिए यहाँ एक immunofluorescence धुंधला हो जाना का एक उदाहरण दिखाodification, H3K27me3 (सही पैनल) दिखा रहा है कि इस प्रोटोकॉल अन्य histone निशान करने के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में पहले 1,3 प्रकाशित किया गया है. γ H2AX पीले और लाल रंग में H3K27me3 में दिखाया गया है. डैश्ड हलकों नाभिक आकृतियों रूपरेखा. पैमाने बार = 2 सुक्ष्ममापी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

अभिकर्मक / सामग्री के नाम कंपनी Catalogm संख्या टिप्पणियां
एच 2 हे मछुआ BP2470 #
RNase एक सिग्मा R4642 #
dNTP सिग्मा DNTP100 #
Alexa dUTP Invitrogen #C11397 करने के लिए सी - +११,४०१
Cy3 या dUTP Cy5 मछुआ # 45-001-xxx
DNase मैं Roche 04536282001 #
डीएनए पोल मैं Biolabs M0209 #
0.025 सुक्ष्ममापी फिल्टर Millipore VSWP02500 #
खटिया-1 डीएनए 1 मिलीग्राम / एमएल Invitrogen 18440 #
Hybloc 1 मिलीग्राम / एमएल डीएनए एप्लाईड जेनेटिक्स MHB #
Salmon शुक्राणु सिग्मा D1626 # पाउडर एच 2 हे में 10 मिलीग्राम / एमएल में resuspended
राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद (सोडियम एसीटेट, 5.2 पीएच, बफर समाधान) सिग्मा S7899 #
Ficoll 400 (मॉल बॉय ग्रेड) मछुआ # 525
(मॉल बॉय ग्रेड) Polyvinylpyrrolidone मछुआ BP431 #
Dextran सल्फेट पाउडर सिग्मा D8906 #
SSPE (खारा सोडियम फास्फेट EDTA) 20x समाधान मछुआ BP1328 #
Formamide मछुआ BP227 #
Coverslips मछुआ # 12-548-B
स्लाइड मछुआ 12-550 #
6 अच्छी तरह प्लेटें मछुआ 0720080 #
पीबीएस, 10x मछुआ # मीट्रिक टन-46-013-CM
सिग्मा P8920 #
Paraformaldehyde, prills, 95% सिग्मा 441244 #
ट्राइटन-X-100, मॉल बॉय ग्रेड सिग्मा T8787 #
BSA (गोजातीय सीरम albumin) भिन्न वी मछुआ # 1600 बी.पी.
सामान्य बकरी सीरम वेक्टर लैब्स # S-1000
Tween-20, मॉल बॉय ग्रेड सिग्मा P9416 #
एसएससी (खारा सोडियम साइट्रेट) 20x समाधान मछुआ BP1325 #
गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा Invitrogen P36930 #
DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) सिग्मा D9542 #
परीक्षण एक कोट रबर सीमेंट कला या कार्यालय आपूर्ति भंडार

तालिका 1 विशिष्ट अभिकर्मकों और छोटे उपकरणों.

DUTP साथ NT Alexa fluorophores साथ युग्मित राशि अंतिम एकाग्रता
10 ग्राम डीएनए Μl एक्स
RNase एक 0.17 ग्राम / μl 10 μl
एच 2 हे 260 μl तक भरें
कुल 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट 260 μl
10x NT बफर 50 μl 1x
100 मिमी औरटा, mercaptoethanol 50 μl 10 सुक्ष्ममापी
dNTP मिश्रण 40 μl 40 सुक्ष्ममापी प्रत्येक dNTP
0.1 मिमी dTTP 50 μl 10 सुक्ष्ममापी
1 मिमी Alexa dUTP 12 μl 30 सुक्ष्ममापी
DNase मैं (समाधान काम कर रहा है, नीचे तालिका देखें) 30 μl
डीएनए पोल मैं 7.5 μl 15 यू / मिलीलीटर
कुल 16 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा 500 μl
DUTP साथ Cy3 या Cy5 के साथ मिलकर NT राशि अंतिम एकाग्रता
10 ग्राम डीएनए Μl एक्स
RNase एक 0.17 ग्राम / μl 10 μl
एच 2 हे 300 μl तक भरें
कुल 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट 300 μl
10x NT बफर 50 μl 1x
100 मिमी β-mercaptoethanol 50 μl 10 सुक्ष्ममापी
dNTP मिश्रण 50 μl 50 सुक्ष्ममापी प्रत्येक dNTP
1 Cy3 या मिमी Cy5 dUTP 12 μl 30 सुक्ष्ममापी
DNase मैं ~ 30 μl ~ 1.2 यू / μl
डीएनए पोल मैं 7.5 μl 15 यू / मिलीलीटर
कुल 16 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा 500 μl

तालिका 2 RNase उपचार और 10 ग्राम डीएनए के लिए निक अनुवाद.

समाधान स्टाक
RNase एक काम करने के लिए 0.17 ग्राम / μl: समाधान ताजा मेड
10x NT बफर: 0.5M Tris एचसीएल, पीएच 8, 50 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिलीग्राम / एमएल BSA -20 डिग्री सेल्सियस में 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों
dNTP मिश्रण: dATP, dCTP, और dGTP: 0.5mm एच 2 हे में प्रत्येक -20 डिग्री सेल्सियस में 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों
DNase मैं: स्टॉक समाधान 20 मिमी Tris पीएच 7.5/50% glycerol/50 मिमी NaCl में 20,000 यू / एमएल में पुनर्गठन -20 डिग्री सेल्सियस में 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों
समाधान: DNase मैं स्टॉक समाधान के प्रत्येक नया बैच अलग dilutions पर परीक्षण किया जाना चाहिए (10 यू / मिलीलीटर, 20 यू / मिलीलीटर और एच 2 हे में 40 यू / मिलीलीटर). 100 और 1,000 बीपी (देखें के बीच एक डीएनए धब्बा देने के कमजोर पड़नेचरण 5) के रूप में काम कर समाधान किया जाना चाहिए. ताजा मेड

3 टेबल एक का उपचार और निक अनुवाद RNase के लिए समाधान.

संकरण बफर समाधान स्टाक
10% 50x Denhardt समाधान: 1 ग्राम Ficoll 400, 1 ग्राम Polyvinylpyrrolidone और 100 मिलीलीटर 0 2 एच - फ़िल्टर -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर बाज़
40% 25% Dextran सल्फेट: Dextran सल्फेट पाउडर 12.5x SSPE में 37-65 में भंग कर रहा है डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर बाज़
50% Formamide 4 डिग्री सेल्सियस पर बोतलें
1.5 मिलीलीटर Eppendorfs में aliquots -20 और संग्रहित कर रहे हैंडिग्री, सी

4 तालिका संकरण बफर.

</ Tr>
एंटीबॉडी प्रदायक कैटलॉग संख्या मन्दन
γ-H2AX phospho H2A.X, JBW301 क्लोन, मोनोक्लोनल माउस Millipore 05636 # 1/200
H3K27me3, क्लोन, खरगोश पॉलीक्लोनल Millipore 07449 # 1/200
Alexa Fluor 555 विरोधी माउस गधा Invitrogen A # 31,570 / 1 500
Alexa Fluor 488 बकरी विरोधी माउस Invitrogen A # 11,001 / 1 500
Alexa Fluor 488 बकरी विरोधी खरगोश Invitrogen A # +११००८ / 1 500

तालिका 5 प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी.

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Discussion

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ऊपर विस्तृत तकनीक हमारी प्रयोगशाला में वी (डी) और लिम्फोसाइटों 30,31 विकास में इम्यूनोग्लोबिन Tcra / घ loci जम्मू पुनर्संयोजन के विनियमन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हमें विश्वास है कि इस तकनीक को विभिन्न परमाणु प्रोटीन, परमाणु डिब्बों और loci के अलग सेल प्रकार में पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैं. प्रोटोकॉल के संशोधन के लिए आवश्यक हो सकता है और इस मामले में प्रमुख कदम पर ध्यान केंद्रित करने का अनुसरण कर रहे हैं. सबसे पहले, permeabilization की लंबाई सेल प्रकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन का दूसरा लंबाई भी एंटीबॉडी के गुणवत्ता और ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत है (उदाहरण के लिए कुछ मामलों में, ऊष्मायन 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर से प्रदर्शन हो सकते हैं) के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, विकृतीकरण कदम अनुकूलित किया जा सकता है और एचसीएल उपचार 3,4,34 Formamide और NaOH में 20 मछली के लिए डीएनए विकृतीकरण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. इसके अलावा दोहराने केएड तरल नाइट्रोजन फ्रीज पिघलना चक्र निर्धारण के लिए permeabilization / डीएनए 4,34 मछली अकेले के बाद कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है. अंत में, जबकि कई histone संशोधनों, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय और सह कारकों सफलतापूर्वक किया गया है इस 30,35 पद्धति का उपयोग करके पता लगाया है, इम्युनो धुंधला अन्य परमाणु प्रोटीन के लिए डीएनए मछली 4 संकरण के बाद किया जा सकता है.

3 डी छवि विश्लेषण सूक्ष्मदर्शी के व्यापक क्षेत्र (deconvolution साथ मिलकर) epifluorescence और लेजर confocal 36 माइक्रोस्कोपी सहित विभिन्न प्रकार के इस्तेमाल को शामिल कर सकते हैं. इमेजिंग विधि का चुनाव आवश्यक संकल्प पर निर्भर करेगा, fluorophores की संख्या, नमूने और डीएनए और प्रोटीन के संकेतों के गुणवत्ता की गहराई. नए उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप के विकास के परमाणु और सेलुलर 37-39 प्रक्रियाओं का सही दृश्य में एक पूरी तरह से नए अवसर खुल जाता है. Generatio के लिए इसके अलावा, नई तकनीकn कस्टम निर्मित जांच कि कोई दोहराव अनुक्रम शामिल जीनोमिक क्षेत्रों की साफ पता लगाने को सक्षम करने के लिए, एक 15-केबी विशिष्ट बिन्दुपथ से 40 exons की जटिल पूल. यह सटीकता और परमाणु प्रक्रियाओं की गतिशीलता पर नज़र रखने में उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता बढ़ जाती है.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

हम चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए Skok प्रयोगशाला, विशेष रूप से Susannah हेविट, के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) द्वारा समर्थित है. JAS एक लेकिमिया और लिंफोमा सोसायटी विद्वान है. जे.सी. कैंसर अनुसंधान संस्थान के एक Irvington संस्थान फैलो है. एम.एम. एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एकीकृत स्नातकोत्तर शिक्षा तथा अनुसंधान Traineeship (NSF IGERT 0333389) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H2O Fisher # BP2470
RNase A Sigma # R4642
dNTP Sigma # DNTP100
Alexa dUTP Invitrogen # C11397 to C-11401
Cy3 or Cy5 dUTP Fisher # 45-001-xxx
DNase I Roche # 04536282001
DNA Pol I Biolabs # M0209
0.025 μm filters Millipore # VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen # 18440
Hybloc DNA 1 mg/ml Applied Genetics # MHB
Salmon sperm Sigma # D1626 powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) Sigma # S7899
Ficoll 400 (Mol Biol grade) Fisher # 525
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) Fisher # BP431
Dextran sulfate powder Sigma # D8906
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution Fisher # BP1328
Formamide Fisher # BP227
Coverslips Fisher # 12-548-B
Slides Fisher # 12-550
6-well plates Fisher # 0720080
PBS, 10x Fisher # MT-46-013-CM
Poly-L-lysine solution Sigma # P8920
Paraformaldehyde, prills, 95% Sigma # 441244
Triton-X-100, Mol Biol grade Sigma # T8787
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V Fisher # BP 1600
Normal goat serum Vector Labs # S-1000
Tween-20, Mol Biol grade Sigma # P9416
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution Fisher # BP1325
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen # P36930
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma # D9542
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Table 1. Specific reagents and small equipment.

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References

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संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस और 3 डी संरक्षित अंतरावस्था नाभिक पर डीएनए मछली 3D परमाणु संगठन में परिवर्तन का अध्ययन
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Chaumeil, J., Micsinai, M., Skok, J. A. Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization. J. Vis. Exp. (72), e50087, doi:10.3791/50087 (2013).More

Chaumeil, J., Micsinai, M., Skok, J. A. Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization. J. Vis. Exp. (72), e50087, doi:10.3791/50087 (2013).

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