Summary
Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).
Abstract
Ibridazione fluorescente in situ con l'utilizzo di sonde a DNA, il 3-dimensionale nuclei conservati seguito da 3D microscopia confocale (FISH DNA 3D) rappresenta il modo più diretto per visualizzare la posizione di loci genici, cromosomica sub-regioni o interi territori in celle singole. Questo tipo di analisi permette di comprendere meglio l'architettura globale del nucleo e il comportamento dei loci genomici e regioni nello spazio nucleare. Immunofluorescenza, invece, permette la rilevazione di proteine nucleari (istoni modificati, varianti istoniche e modificatori, macchinari e fattori di trascrizione nucleari, sotto-compartimenti, ecc). La sfida in combinazione FISH DNA immunofluorescenza e 3D è, da un lato di preservare l'epitopo riconosciuto dagli anticorpi così come l'architettura 3D del nucleo, e dall'altro, per consentire la penetrazione della sonda di DNA per rilevare loci genici o territori cromosomici 1-5. Qui forniamo un protocollo che combina la visualizzazione di modificazioni della cromatina con loci genomici in 3D nuclei conservato.
Introduction
Epigenetica meccanismi di creazione di trigger e l'eredità di profili specifici di sviluppo e delle cellule di tipo trascrizionale. A un certo livello si tratta di modulazione degli imballaggi cromatina che definisce regioni genomiche attive o in silenzio. Su una scala più ampia, globale organizzazione 3D del genoma e architettura nucleare anche svolgere un ruolo nel controllo trascrizionale di modelli. Così, la dissezione di queste caratteristiche epigenomic è essenziale per una piena comprensione di come i geni sono regolati 6-11.
Combinato FISH DNA immunofluorescenza e 3D offrono una possibilità unica per integrare le analisi molecolari e biochimici valutando specifiche interazioni / associazioni di sequenze di DNA e / o proteine all'interno del nucleo. Inoltre, mentre il genoma tecniche ad alto rendimento, come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) o la cattura conformazione cromosoma accoppiata con sequenziamento profondo (4C-seq, 5C, Hi-C) forniscono dat globaleuna su popolazioni cellulari 12, immunofluorescenza / DNA tecniche FISH affinché le analisi a livello di singola cellula.
Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-FISH). Il vantaggio di questo protocollo è la visualizzazione combinata di DNA e conservazione delle strutture proteiche. La nostra esperienza in questo campo ci ha consentito di migliorare e semplificare i protocolli esistenti. Anche se abbiamo usato questo protocollo per rilevare il DNA a doppio filamento rompe in linfociti sottoposti ricombinazione, questo metodo può essere applicato ad altre proteine e altri tipi di cella.
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Protocol
1. DNA Etichettatura Sonda con Fluorofori: Nick Traduzione (~ 6 ore)
- Pulito BAC DNA (preparato da maxi-prep) o plasmidi o prodotti PCR, tutti risospeso in H 2 O, possono essere utilizzati per l'etichettatura. Noti che per un segnale FISH robusta, le sonde devono estendersi almeno 10 kb.
- Incubare DNA in RNasi A per 30 min a 37 ° C (Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella 1).
- Incubare la reazione traduzione nick per 2 ore a 16 ° C (vedi tabelle 2 e 3). Metodi alternativi di etichettatura diretta può essere utilizzato (esempio: Tag FISH, Invitrogen).
- Inattivare la reazione per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C.
- Determinare le dimensioni della sonda su un gel di agarosio al 2%. Lo striscio dovrebbe essere compreso tra 100 e 1.000 bp, con la maggioranza di circa 300-500 bp (Si noti che la macchia di Cy5-sonde non è visibile). Se il DNA non è digerito abbastanza, più DNA Pol I eDNasi I può essere aggiunto alla reazione ed incubata per due ore più a 16 ° C.
- Purificare sonde su filtri 0,025 mm in due bicchieri litro riempite con H 2 0 per due ore al buio.
- Aggiungere fattori bloccanti alle sonde come segue: 10 mg di DNA Cot-1, 10 ug di DNA Hybloc e 100 pg di sperma di salmone per 10 pg di sonde di DNA. DNA sonde Conservare a -20 ° C.
2. Sonda Precipitazioni / Denaturazione / Pre-ricottura (ore 3-4)
- Tra 0,3 mg e 1 mg di test sul DNA viene utilizzato per coprioggetto. Sonde mescolare con 0,1 volume di 3M NaAc (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%, incubare per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C e centrifugare a 13.000 rpm a 4 ° C per 30 min. Si noti che la quantità di sonda di DNA può essere regolata a seconda della qualità del DNA nucleare e la regione di ibridazione. Metodi alternativi di etichettatura diretta può consentire l'utilizzo di ridotte quantità disonda. Per il rilevamento di segnali multipli FISH DNA su una diapositiva, diverse sonde può essere precipitato insieme (tranne le sonde che non dovrebbero essere pre-cotto, come sequenze ripetute). Sonde per diversi esperimenti eseguiti contemporaneamente può anche essere precipitato insieme. Pellet dovrebbe essere leggermente colorata secondo i fluorofori utilizzati (se piccole quantità di sonde vengono precipitati, il pellet può non essere visibile).
- Pellet secco e risospendere in 15 microlitri tampone di ibridazione (cfr. tabella 4) per coprioggetto con agitazione (con un Thermomixer Eppendorf) al buio a 37-45 ° C (per circa 20 min).
- Sonde Denaturare per 5 minuti a 75-95 ° C.
- Pre-ricottura sonde a 37 ° C per 30-60 min. Lunghezza del pre-ricottura può essere regolata a seconda della complessità e qualità delle sonde.
- Applicare i coprioggetti sonde per l'ibridazione durante la notte (cfr. sezione 3).
3. 3-Dimensionale FISH DNA - Primo Giorno (~ 3 ore)
- Cellule non aderenti sono concentrate in un piccolo volume di PBS 1x (~ 2x10 5 cellule in 5-10 microlitri 1x PBS per vetrino) e scaricati sul centro di un poli-L-lisina coprioggetto rivestiti. Cellule aderenti dovrebbero essere coltivate su vetrini per almeno 24 ore (confluenza ~ 70%) (vetrini possono essere rivestiti con gelatina 0,1%). Quadrati 18x18 a 24-24 coprioggetti mm sono poste in piastre da 6 pozzetti, e tutto il protocollo, due ml di ciascuna soluzione viene usato per pozzetto (in alternativa rotonde coprioggetto 1,5 millimetri può essere posto in piastre 12/24-well).
- Fissare cellule in paraformaldeide al 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, per 10 minuti a RT (4% PFA scorte possono essere aliquotati, conservati a -20 ° C). Paraformaldeide possono essere acquistati in soluzione (16%), o soluzioni di riserva del 4% può essere preparato da polvere / granuli. Paraformaldeide in polvere viene dissolto in PBS 1x a> 60 ° C (pH può essere portato a 8-9 per facilitare la dissoluzione), raffreddato in ghiaccio, regolareed a pH 7-7,4, filtrata, aliquotare falchi e conservati per settimane a -20 ° C.
- Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS per 5 minuti in ghiaccio. Lunghezza di permeabilizzazione può essere regolata a seconda del tipo cellulare. NB: Se FISH DNA viene combinato con immunofluorescenza, l'immunocolorazione deve essere eseguita in questa fase (vedi sezione 4).
- Dopo tre lavaggi in PBS 1x, incubare le cellule con 0,1 mg / microlitri RNasi A in PBS 1x per un ora a 37 ° C. Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetto vengono poi accuratamente rimosso con una pinza. Se si incontra una resistenza, coprioggetto deve essere allagato con PBS 1x per evitare di danneggiare le cellule.
- Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,7% Triton-X-100 / HCl 0,1 M per 10 min in ghiaccio.
- Dopo tre lavaggi in 1x PBS, le cellule denaturate in HCl 1,9 M per 30 minuti a RT. Alternativamente, le cellule possono essere denaturati in 50% di formammide / 2x SSC a 75-80 ° C per almeno 30 min. Notare che la lunghezza ibridazione (e temperatura) può essere ottimizzato a seconda del tipo cellulare.
- Dopo tre lavaggi in ghiacciata 1x PBS, le cellule ibridare con sonde notte a 37 ° C in una camera oscura e umida. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo del 15 microlitri di sonda su un vetrino, e sigillato con mastice.
4. 3-dimensionale Immuno-FISH - Primo Giorno (~ 6-7 ore)
- Per combinato immunofluorescenza / DNA FISH, immuno-colorazione deve essere eseguita dopo la permeabilizzazione nello 0,4% Triton-X-100 (punto 3.3).
- Incubare le cellule in soluzione di blocco per 30 minuti a RT (2,5% di sieroalbumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,1% Tween-20). La soluzione bloccante è filtrata, aliquotare Eppendorfs 1,5 ml e conservati per mesi a -20 ° C.
- Incubare le cellule con l'anticorpo primario sollevata contro la proteina o la modificazione degli istoni di interesse diluito in soluzione di bloccaggio, per un ora a RT in una camera umida. Qui vi mostriamo l'esempio di un anticorpo contro fosforilati della serina-139 di H2AX (γ-H2AX, Millipore: vedi Tabella 5 per i dettagli). Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetti sono poi accuratamente rimosso con una pinza (inondato con PBS 1x se necessario). Notare che la diluizione e la lunghezza di incubazione può essere regolata a seconda della qualità del anticorpo e cellule-tipi.
- Lavare le cellule in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione.
- Incubare le cellule con il fluoroforo appropriato anticorpo secondario coniugato diluito in soluzione di blocco per un ora a RT in una camera oscura e umida. Qui mostriamo un esempio di rilevamento con unsecondario di capra anti-topo (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen, vedere la Tabella 5 per i dettagli). Anticorpi secondari coniugati aptene-(biotina, digossigenina, etc) potrebbe anche essere usato. In questo caso, un ulteriore passaggio per il rilevamento appropriato (streptavidina, anti-dig, ecc) può essere eseguita prima o dopo over-notte ibridazione DNA-FISH.
- Risciacquare le cellule in 0,1% di Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione al buio.
- Post-fix cellule nel 2% paraformaldeide / 1x PBS per 10 min a temperatura ambiente al buio.
- Continua FISH DNA come sopra da incubazione a RNasi A (passo 3.4).
5. 3-dimensionale DNA FISH / Immuno-FISH - Secondo giorno (circa 2 ore)
- Rimuovere con cautela cemento di gomma, vetrini alluvione con 2x SSC, rimuovere con cautela con una pinza e metterli in pozzetti contenenti soluzione di lavaggio.
- Lavare le cellule in 2x SSC per 30 min a 37 ° C al buio con agitazione.
- Lavare le cellule in 2x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione.
- Lavare le cellule in 1x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione noti che in caso di denaturazione con formammide, lavaggi deve essere sostituito dal seguente:. 3 lavaggi a 50% formammide lavaggi / 2x SSC e 3 in 2x SSC, 5 min ciascuna, a 37 ° C.
- Montare cellule in mezzo prolungare oro montaggio contenente 1,5 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo) per controcolorazione di DNA totale. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo di 10-15 ml di mezzo di montaggio su un vetrino e sigillato con smalto. I vetrini sono conservati per mesi a -20 ° C.
6. Microscopia e analisi 3D
- Le immagini 3D possono essere acquisite con sistemi microscopio diversi. Nei nostri esperimenti, sezioni ottiche separate di 0,3 micron vengono raccolti su un sistema Leica SP5 AOBS confocale (acusto-ottico Beam Splitter). Notare che la distanza tra ottical piani possono essere regolati a seconda del tipo di analisi.
- Stack di immagini 3D possono essere analizzati utilizzando diversi software e strumenti. Usiamo il software J immagine per valutare le misure di distanza tra i loci di interesse e di analizzare i diversi tipi di associazione dei loci di interesse con sub-nucleare compartimenti o proteine.
- Tutte le analisi statistiche sono effettuate per confrontare due (o più) diverse condizioni biologiche con coppie di valutazione (s) di importanza: confronto tra diversi tipi di cellule o fasi, il confronto tra i diversi loci di interesse. In tutti i test statistici, P-value ≤ 5.00E-2 (a = 0.05) sono presi per essere significativo (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * molto significativo, p <1,00 E-3 *** altamente significativo).
Analisi statistica delle distribuzioni intero distanze tra due alleli. Abbiamo prima construct cumulativi curve di frequenza di distribuzione su tutta la gamma di distanze misurate tra i due alleles.To valutare la significatività delle differenze tra le distribuzioni empiriche di inter-alleliche distanze che utilizziamo il non parametrico due campioni di Kolmogorov-Smirnov (KS) prova 13,14.
L'analisi statistica di una stretta associazione (pairing cioè) di due alleli con una distanza ottimale di cut-off. Per identificare la gamma di robusti maggior parte delle differenze in termini di distanze tra due alleli o loci, si usa una serie di due code test esatto di Fisher 15 s. Vale a dire, ad ogni distanza misurata abbiamo verificare se una condizione è significativamente sovrarappresentati a brevi distanze tra i due campioni. Il minimo nella distribuzione dei valori p indica l'intervallo di distanze che devono essere considerati come un cut-off per la stretta associazione (pairing cioè) dei due alleli. Successivamente il due code test esatto di Fisher è usato to valutare l'importanza di accoppiamento di due alleli al identificato cut-off 15. Correzioni test multipli vengono conteggiati per il numero totale di test eseguiti Fisher 16.
Analisi statistica di associazione del locus di interesse con compartimenti sub-nucleari o proteine. La due code esatto di Fisher-test viene utilizzato per analizzare il significato di associazione del locus di interesse con diversi scomparti o proteine 15.
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Representative Results
DNA e immuno-FISH vengono utilizzate in laboratorio Skok di studiare le variazioni dell'organizzazione nucleare associati al processo di V (D) J ricombinazione dei loci recettore per l'antigene durante lo sviluppo dei linfociti B e T. Le tecniche sopra descritte ci permettono di i) misurare le distanze tra le due estremità di un locus (contrazione), ii) misurare le distanze tra alleli o loci (pairing), iii) analizzare il danno al DNA che si verificano all'interno loci, iv) verificare la posizione degli alleli e loci relativi al nucleare sub-comparti (repressivo eterocromatina pericentromerica nel nostro studio), e v) valutare l'associazione di proteine nucleari alleli e loci (associazione dei fosforilata dell'istone γ-H2AX nel nostro studio). In particolare, abbiamo analizzato il ruolo della dinamica locus nella regolazione della V (D) J ricombinazione dei loci delle immunoglobuline per lo sviluppo di cellule B 17-30, e nella regolazione di impegno linea tra CD4 + e CD8 + Tcellule 14. Abbiamo anche valutato danno al DNA in una delle T-cellule recettore locus, TCRA / d, nello sviluppo delle cellule T che trasportano una forma mutante della proteina RAG2 ricombinasi 31.
Figura 1. Analisi delle distanze tra due alleli o loci. (A) sezioni confocali mostrano rappresentativi spaiati (a destra) o in coppia (a sinistra) alleli in singoli nuclei. La sonda FISH DNA è stato generato da un BAC (~ 200 kb) che attraversa il locus di interesse. Distanze tra alleli sono stati misurati tra il centro di massa di ciascun segnale in BAC stack di immagini 3D. Cerchi tratteggiati delineare forme nucleo. Barre di scala = 1 micron. (B) cumulativi curve di distribuzione di frequenza che mostra l'intera gamma di distanze tra le due alleles misurata in due diverse condizioni biologiche (wild-type vs mutante). I due campioni di test non parametrico KS è stato utilizzato per valutare la significatività delle differenze tra le due distribuzioni. La gamma della maggior parte delle differenze robusti in inter-alleliche distanze è stata valutata utilizzando una serie di due-coda test esatto di Fisher (punti blu). I più robusti P-valori più elevati (punti) sono stati trovati per le distanze di circa 1 micron. Così il cut-off per la stretta associazione (pairing cioè) dei due alleli è stato istituito a 1 micron. (C) curve di frequenza cumulativa che indica le distanze tra i due alleli 0-1,5 um in due diverse condizioni biologiche. Il significato di accoppiamento dei due alleli è stata valutata utilizzando il due code test esatto di Fisher per un cut-off a 1 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Analisi della posizione di un luogo rispetto al sub-nucleare compartimenti. Nei nostri studi si analizza il rapporto tra i nostri loci di interesse e la repressione sub-nucleare vano formato dal pericentromerica eterocromatina (PCH) 32. Alleli sono considerati trova quando il segnale PCH BAC per il locus di interesse è adiacente o sovrapposizione con la γ-satellite segnale che ibridizza PCH (nessun pixel tra i bordi del BAC e γ-satellitari segnali FISH DNA). Sezioni confocali rappresentante della posizione di alleli TCRA rispetto al PCH: (Top) nessun allele trova a PCH, (Centro) un allele a PCH, (in basso) due alleli nel PCH. Locus in rosso, e γ-satellite in bianco. Le frecce gialle mostrano i alleli situati a PCH. Cerchi tratteggiati delineare forme nucleo. Barra della scala = 1 micron.
Figura 3. Analisi dell'associazione di proteine nucleari e modifiche istoniche su un locus. (A) Nei nostri studi si analizza il rapporto tra i nostri loci di interesse e la forma fosforilata della istone H2AX (γ-H2AX), come lettura per il DNA a doppia filamento rompe 33. Sezioni confocali mostrano esempi di non-γ H2AX associazione (in alto) o associazione su un allele TCRA (in basso) in singoli nuclei. Alleli sono stati definiti come associati γ-H2AX se il segnale BAC e immunofluorescenza foci erano almeno parzialmente sovrapposti (almeno un pixel di colocalizzazione). Locus è mostrato in rosso e γ-H2AX in bianco. Cerchi tratteggiati contorno nforme ucleus. Barra della scala = 1 micron. È degno di nota che le analisi colocalizzazione del segnale BAC con PCH o γ-H2AX focolai sono eseguite manualmente utilizzando il software Image J senza soglia automatica. (B) Perdita di una parte della γ-H2AX segnale dopo denaturazione è una delle domande principali tecniche sollevate da questo immuno-DNA protocollo FISH. Qui vi mostriamo un esempio di immunofluorescenza prima (in alto) e dopo (in basso) HCl-trattamento a base di denaturazione (Formammide-trattamento ha dato risultati simili (non mostrato)). Anche se il segnale era debole, le caratteristiche principali della colorazione, in particolare il numero di foci, rimangono dopo il trattamento. L'utilizzo di un Leica SP5 confocale, le impostazioni per il laser 561 prima e dopo denaturazione sono stati i seguenti: 35% di potenza / guadagno intelligente a 730V, e il 45% di potenza / guadagno intelligente a 750V, rispettivamente. Inoltre, mostriamo un esempio di colorazione di immunofluorescenza per un altro m istoneODIFICA, H3K27me3 (pannelli di destra) che mostra che questo protocollo può essere applicato ad altri marchi istoni, come è stato precedentemente pubblicato 1,3. γ-H2AX è mostrato in giallo e in rosso H3K27me3. Cerchi tratteggiati delineare forme nucleo. Barra di scala = 2 pm. Clicca qui per ingrandire la figura .
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero Catalogm | Commenti |
| H 2 O | Pescatore | # BP2470 | |
| RNasi A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 a C-11401 | |
| Cy3 o Cy5 dUTP | Pescatore | # 45-001-xxx | |
| DNasi I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 micron filtri | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmone sperma | Sigma | # D1626 | polvere da risospese a 10 mg / ml in H 2 O |
| NaAc (Acetato di sodio, pH 5.2, soluzione tampone) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grado) | Pescatore | # 525 | |
| Polivinilpirrolidone (Mol Biol grado) | Pescatore | # BP431 | |
| Destrano solfato polvere | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodio Fosfato-EDTA) soluzione 20x | Pescatore | # BP1328 | |
| Formammide | Pescatore | # BP227 | |
| Coprioggetto | Pescatore | # 12-548-B | |
| Diapositive | Pescatore | # 12-550 | |
| 6-pozzetti | Pescatore | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Pescatore | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldeide, granuli, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (albumina di siero bovino) Frazione V | Pescatore | # BP 1600 | |
| Siero di capra normale | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (citrato di sodio Saline) 20x soluzione | Pescatore | # BP1325 | |
| Prolungare reagente Oro antifade | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-Diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Miglior prova di uno strato di cemento di gomma | D'arte o in ufficio di approvvigionamento negozi |
Tabella 1. Reagenti specifici e piccole attrezzature.
| NT con dUTP accoppiata con Alexa-fluorofori | Importo | Concentrazione finale |
| 10 pg di DNA | X pl | |
| RNasi A - 0,17 pg / pl | 10 pl | |
| H 2 O | Riempire a 260 pl | |
| TOTALE - 30 min a 37 ° C | 260 microlitri | |
| 10x NT tampone | 50 microlitri | 1x |
| 100 mM & beta;-mercaptoetanolo | 50 microlitri | 10 pM |
| dNTP mix | 40 ml | 40 mM di ciascun dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 microlitri | 10 pM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 microlitri | 30 pM |
| DNasi I (soluzione di lavoro, vedere tabella sotto riportata) | 30 microlitri | |
| DNA Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTALE - 2 ore a 16 ° C | 500 pl | |
| NT con dUTP accoppiato con Cy3 o Cy5 | Importo | Concentrazione finale |
| 10 pg di DNA | X pl | |
| RNasi A - 0,17 pg / pl | 10 pl | |
| H 2 O | Riempire fino a 300 pl | |
| TOTALE - 30 min a 37 ° C | 300 microlitri | |
| 10x NT tampone | 50 microlitri | 1x |
| 100 mM β-mercaptoetanolo | 50 microlitri | 10 pM |
| dNTP mix | 50 microlitri | 50 mM di ciascun dNTP |
| 1 mM-Cy3 o Cy5-dUTP | 12 microlitri | 30 pM |
| DNasi I | ~ 30 microlitri | ~ 1.2 U / mL |
| DNA Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTALE - 2 ore a 16 ° C | 500 pl |
Tabella 2. RNasi A trattamento e traduzione Nick DNA per 10 mcg.
| Soluzioni | Riserve | |
| RNasi A | Soluzione di lavoro: 0,17 mg / mL | Costituito da fresco |
| 10x NT buffer: | 0.5M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgCl 2, 0,5 mg / ml BSA | Provette da 1,5 ml a -20 ° C. |
| dNTP mix: | dATP, dCTP, dGTP e: 0,5 mM ciascuno in H 2 O | Provette da 1,5 ml a -20 ° C |
| DNasi I: | Soluzione madre: ricostituito a 20.000 U / ml in 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | Provette da 0,5 ml a -20 ° C |
| Soluzione di lavoro: Ogni nuovo lotto di soluzione di DNasi magazzino che devono essere testati a varie diluizioni (10 U / ml, 20 U / ml e 40 U / ml in H 2 O). La diluizione dando uno striscio di DNA compresa tra 100 e 1000 bp (vedifase 5) deve essere utilizzata come soluzione di lavoro. | Costituito da fresco |
Tabella 3. Soluzioni per RNase A cura e traduzione Nick.
| Ibridazione del buffer | Soluzioni | Riserve | |
| 10% | 50x soluzione di Denhardt: | 1 g Ficoll 400, 1 g di polivinilpirrolidone e 100 ml di H 2 0 - filtrata | 50 ml falcon a -20 ° C |
| 40% | 25% destrano solfato: | Polvere di solfato di destrano è disciolta in 12,5 x SSPE a 37-65 ° C | 50 ml falcon a -20 ° C |
| 50% | Formammide | Bottiglie a +4 ° C | |
| Aliquote in 1,5 ml Eppendorfs sono conservati a -20 ° C | |||
Tabella 4. Buffer di ibridazione.
| Anticorpi | Fornitore | Numero di catalogo | Diluizione |
| γ-H2AX - H2A.X fosfo, clone JBW301, monoclonale | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, clone, policlonali di coniglio | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-mouse | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 di capra anti-topo | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 di capra anti-coniglio | Invitrogen | # A-11.008 | 1/500 | </ Tr>
Tabella 5. Anticorpi primari e secondari.
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Discussion
Le tecniche sopra descritte sono state usate nel nostro laboratorio per analizzare la regolazione di V (D) J ricombinazione delle immunoglobuline e TCRA / d loci nello sviluppo linfociti 30,31. Siamo certi che questa tecnica può essere adattata per il rilevamento di varie proteine nucleari, vani loci nucleari e, in diversi tipi di cellule-. Modifiche del protocollo può essere necessario, e in questo caso le fasi principali di concentrarsi su sono i seguenti. Primo, la lunghezza di permeabilizzante può essere regolata a seconda del tipo cellulare. Secondo la lunghezza della incubazione anticorpo primario può essere regolata in funzione della qualità del anticorpo e l'abbondanza della proteina di interesse (per esempio, in alcuni casi, può essere effettuata l'incubazione per una notte a 4 ° C). Soprattutto, la fase di denaturazione può essere adattato, HCl e il trattamento può essere sostituita dalla denaturazione in formammide 3,4,34 e NaOH per FISH DNA 20. Anche ripetereEd congelamento-scongelamento di azoto liquido può essere applicata alle cellule dopo fissazione / permeabilizzazione per FISH DNA soli 4,34. Infine, mentre diverse modificazioni degli istoni, RNA polimerasi II e co-fattori sono stati correttamente determinati da questo metodo 30,35, immuno-colorazione per altre proteine nucleari può essere eseguita dopo l'ibridazione FISH DNA 4.
Analisi di immagine 3D può comportare l'uso di diversi tipi di microscopi, incluse largo campo epifluorescenza (accoppiato con deconvoluzione) e microscopia confocale laser 36. La scelta del metodo di imaging dipenderà dalla risoluzione richiesta, il numero di fluorofori, la profondità dei campioni e la qualità dei segnali di DNA e proteine. Lo sviluppo di nuovi microscopi ad alta risoluzione si apre una completamente nuova strada nella visualizzazione accurata dei processi nucleari e cellulari 37-39. Inoltre, nuove tecniche per la generation di misura sonde che non contengono sequenza ripetitiva consentire di rilevare pulita di regioni genomiche, da una a 15 kb locus specifico, alle piscine complesse di esoni 40. Questo aumenta la precisione e la sensibilità di microscopia ad alta risoluzione a monitorare la dinamica dei processi nucleari.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Skok, soprattutto Susannah Hewitt, per le discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Institute of sovvenzioni Salute R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS è un Leukemia & Lymphoma Society studioso. JC è un Fellow Irvington Istituto del Cancer Research Institute. MM è supportato da una formazione National Science Foundation Graduate Concessione Integrativa e tirocinio di ricerca (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
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