Summary
ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。
Abstract
3D共焦点顕微鏡（3DのDNA FISH）を、続いて3次元的に保存核にDNAプローブを用いた蛍光 in situハイブリダイゼーションは、個々の細胞における遺伝子座の位置、サブ領域の染色体または全体の領土を視覚化するための最も直接的な方法を表しています。このタイプの分析は、核のグローバルアーキテクチャだけでなく、核空間内の特定のゲノム遺伝子座や地域の行動への洞察を提供します。免疫蛍光法は、他の一方で、核タンパク質の検出（修正ヒストン、ヒストンバリアントと修飾、転写機構や要因、原子力サブコンパートメントなど）を許可します。免疫蛍光法および3DのDNA FISHを組み合わせるにおける主要な課題は核の3Dアーキテクチャと同様に抗体によって検出されるエピトープを保持する一方であり、他方では、DNAプローブの浸透が検出できるように遺伝子座や染色体テリトリーの1月5日。ここでは、3D保存核内ゲノム遺伝子座とクロマチン修飾の可視化を組み合わせたプロトコルを提供します。
Introduction
エピジェネティックなメカニズムトリガ成立と発達と細胞型特異的転写プロファイルの継承。 1レベルでこれは、アクティブまたはサイレントゲノム領域を定義クロマチン包装の変調を伴う。大規模に、ゲノムと核構造のグローバル3D組織はまた、転写パターンの制御に役割を果たしています。したがって、これらのepigenomic機能の解剖は、遺伝子が6-11を規制されている方法を完全に理解するために不可欠です。
組み合わせた免疫蛍光法および3DのDNA FISHは、特異的な相互作用/核内のDNA配列および/またはタンパク質の関連を評価することによって、分子および生化学的解析を補完するユニークな機会を提供します。さらに、このようなクロマチン免疫沈降（ChIP-seq）が染色体またはキャプチャのコンフォメーションなどのゲノムワイドなハイスループット技術は深いシーケンシングと相まってしばらく（4C-SEQ、5Cは、Hi-C）にグローバルdatを提供細胞集団は12日 、免疫蛍光/ DNA FISHの技術は、単一細胞レベルでの解析を可能にします。
ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫FISH）が続いたDNA FISHによって免疫蛍光法およびDNA配列によってヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。このプロトコルの利点は、DNAやタンパク質の構造の保全を組み合わせた視覚化したものです。この分野での我々の経験では、既存のプロトコルを改善し、簡素化することができるようになりました。我々は組換えを受けてリンパ球におけるDNA二本鎖切断を検出するには、このプロトコルを使用していたが、この方法は、他のタンパク質と他の細胞型に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。フルオロフォアとのDNAプローブのラベリング：ニック翻訳（〜6時間）
- クリーンBAC DNA（マキシプレップにより調製）またはプラスミドやPCR産物は、H 2 Oに再懸濁した全てが、標識に使用することができます注堅牢FISHの信号については、プローブは少なくとも10キロバイトに及ぶべきであること。
- 37℃（全ての試薬 を表1に記載されています）で30分間のRNaseのDNAインキュベートする。
- 16℃（ 表2、表3を参照）で2時間、ニックトランスレーション反応をインキュベートする。直接標識の代替方法は、（：魚タグ、インビトロジェン例）を使用することができる。
- -80℃で1時間反応を不活性化する-20℃℃または一晩
- 2％アガロースゲル上でプローブサイズを決定します。塗抹標本は、約300から500塩基対（Cy5でプローブのスミアが表示されていないことに注意してください ）での過半数で、100〜1,000 bpの間でなければなりません。 DNAが十分に消化されていない場合は、それ以上のDNA Pol IはとDNase Iを反応に添加し、16℃でさらに2時間インキュベートすることができます
- 暗闇の中で2時間、H 2 0で埋め2リットルビーカーで0.025ミリメートルフィルター上のプローブを精製する。
- 次のようにプローブにブロッキング要因を追加します：COT-1 DNA、Hybloc10μgのDNAとDNAプローブ10μgのためのサケ精子の100μg10μgの。 -20℃で保存されたDNAプローブ
2。プローブ降水量/変性/プレアニーリング（3-4時間）
- 0.3μgおよびDNAプローブ1μgの間には、カバースリップあたりに使用されます。ミックス-80℃で1時間インキュベート3M NAACの0.1倍量（pH5.2）との100％エタノールを2.5倍量のプローブ、℃または-20℃で一晩、4℃、13,000 rpmでスピンダウン℃で30分間。 DNAプローブの量はDNAとハイブリダイゼーションの核領域の品質に応じて調整することができることに注意してください。直接標識の代替方法は、減少した量の使用を許すかもしれませんプローブ。 1スライド上の複数のDNA FISHシグナルの検出のために、異なるプローブ（反復配列のようなプレアニーリングしてはならないプローブを除く）一緒に沈殿させることができる。同時に行われ、いくつかの実験のためのプローブも一緒に析出させることができる。ペレットを軽く（プローブの少量が沈殿している場合は、ペレットが見えないかもしれません）を使用する蛍光団によると着色することがあります。
- 乾燥ペレットと37から45℃（約20分間）で暗所（エッペンドルフサーモミキサーを使用して）を振とうしながらカバースリップあたり（ 表4を参照）15μlのハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁します。
- 75から95で5分間変性プローブ℃、
- 30〜60分間、37℃でプローブをプレアニール。プレアニールの長さは、プローブの複雑さと品質に応じて調整することができる。
- 一晩ハイブリダイゼーション用のカバーガラス（セクション3を参照）にプローブを適用します。
3。 3次元DNA魚 - 一日目（〜3時間）
- 非接着細胞を1×PBS（カバースリップあたり5〜10μlの1×PBS中〜2×10 5細胞）を少量に濃縮し、ポリ-L-リジンコートカバースリップの中央にドロップされます。接着細胞は、少なくとも24時間（〜70％コンフルエント）（カバーガラスを0.1％ゼラチンでコーティングしてもよい）のカバースリップ上で培養されるべきである。スクエア18×18に24〜24ミリメートルのカバーを6ウェルプレートに配置され、プロトコル全体、各溶液2ミリリットルを（あるいはラウンド1.5mmのカバーガラスが12/24-wellプレートに配置することができます）ウェルあたりに使用されます。
- RT（4％PFAの株式は-20℃で保存し、等分することができます）で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1×PBS、pHが7から7.4で細胞を固定してください。パラホルムアルデヒド（16％）溶液で購入することができ、または4％の原液を粉末/プリルから調製することができる。パラホルムアルデヒド粉末を調整し、氷の上で> 60℃（pHは溶解を容易にするために8-9に増加させることができる）、冷却されたダウンで1X PBSに溶解さED pHが7から7.4にし、濾過し、ハヤブサに分注し、-20℃で週間保存
- 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で5分間冷やした冷0.4パーセントトリトン-X-100 / 1X PBSで細胞を透過。透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができるNBは ：DNAのFISHは免疫と組み合わされている場合は、免疫染色は（ セクション4を見てください）、この段階で行うべきである。
- 37℃で1時間、1×PBS、1×PBS中の0.1μg/μLのRNase Aを持つインキュベート細胞内で3回洗浄した後℃にカバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセットで除去されます。任意の抵抗が発生した場合は、カバーガラスは、細胞の損傷を避けるために、1×PBSでフラッディングされなければなりません。
- 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で10分間冷やした冷0.7パーセントトリトン-X-100 / 0.1M HCl中で細胞を透過。
- 3回洗浄した後、私nを1×PBS、室温で30分間1.9 M塩酸で変性細胞。交互に、細胞を少なくとも30分間75から80℃で50％ホルムアミド/ 2×SSC中で変性させることができます。ハイブリダイゼーション長（および温度）細胞型に応じて最適化することができることに注意してください 。
- 氷冷1X PBSで3回洗浄した後、℃の暗多湿室で37℃で一晩プローブを用いて細胞をハイブリダイズする。カバーガラスをスライド上のプローブの15μlの上にドロップセル側を下に置かれ、ラバーセメントで封止されている。
4。 3次元免疫魚 - 初日（6月7日〜HR）
- 組み合わせた免疫蛍光DNA /魚のため、免疫染色は、0.4％トリトンX-100（ ステップ3.3）で透過処理した後に実行されるべきである。
- 室温で30分（2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清、0.1％のTween-20）のためにブロッキング溶液中で細胞をインキュベートします。ブロッキング溶液を濾過し、1.5mlのEppendorfsに等分し、mに格納されている-20℃でonths
- 湿潤チャンバー内の室温で1時間、タンパク質またはブロッキング溶液で希釈した関心のヒストン修飾に対して惹起された一次抗体を用いて細胞を培養する。ここでは、H2AXのリン酸化セリン-139（;詳細については、 表5を参照して 、γ-H2AX、ミリポア）に対する抗体の一例を示す。カバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセット（必要に応じて1×PBSで水浸し）で削除されます。希釈およびインキュベーション長は抗体および細胞型の品質に応じて調整することができることに注意してください。
- 振とうしながら、0.2％のBSA / 0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。
- 暗くて湿ったチャンバー内で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切な蛍光色素標識二次抗体を用いて細胞をインキュベートします。ここでは、との検出の例を示す二次ヤギ抗マウス抗体（のAlexa Fluor 488または555、インビトロジェン、詳細については表5を参照）。ハプテン標識二次抗体（ビオチン、ジゴキシゲニン、等）を使用することもできる。この場合、適切な検出（ストレプトアビジン、抗DIG、etc）のための余分なステップは一晩、DNA-FISHハイブリダイゼーションの前または後に実行することができます。
- 暗闇の中で振とうしながら、0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。
- 暗闇の中で室温で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1X PBSでポストフィックス細胞。
- 前述のRNase A（ ステップ3.4）中でのインキュベーションからのDNA FISHを続ける。
5。 3次元DNA FISH /免疫魚 - 2日目（〜2時間）
- 慎重にラバーセメント、2X SSCと洪水のカバーを取り外し、慎重にピンセットで除去し、洗浄液を含むウェルの中に置いてください。
- 37℃で30分間振とうしながら、暗闇の中でCの2×SSC中で細胞を洗浄します。
- 振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間2×SSC中で細胞を洗浄します。
- 振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間1×SSC中で細胞を洗浄ホルムアミドと変性の場合には、洗浄は、次のように置き換えなければならないことに注意してください：50％ホルムアミド/ 2×SSCおよび2x SSC、5で3回洗浄で3回洗浄37℃で、それぞれをmin℃に
- 全DNAの対比は1.5μg/ mlのDAPI（4,6 - ジアミジノ-2 - フェニル）を含むゴールドマウンティングメディウムを延長で細胞をマウントします。カバーガラスをスライド上に媒体をマウントの10〜15μlのドロップにセル側を下に配置し、マニキュアで封止されている。スライドは、-20℃で数ヶ月のために保持されてい
6。 3D顕微鏡と分析
- 3D画像は、異なる顕微鏡システムで取得することができます。我々の実験では、0.3μm以下で区切ら光学切片はライカSP5 AOBS共焦点システム（音響光学ビームスプリッタ）で収集されます。 視神経の間の分離に注意してくださいリットルプレーンは分析の種類に応じて調整することができる。
- 3D画像スタックは、さまざまなソフトウェアやツールを用いて分析することができる。我々は、関心のある遺伝子座の間の距離の測定値を評価するために、サブ核コンパートメントまたはタンパク質と興味のある遺伝子座の協会の様々なタイプを分析するイメージJソフトを使用しています。
- 異なる種類の細胞やステージ間の比較は、目的の異なる遺伝子座の間の比較：すべての統計分析は意義のペアごとの評価（複数可）と2（またはそれ以上）の異なる生物学的条件を比較するために行われている。 1.00E-3≤P≤1.00E-2 *;すべての統計的検定では、P値≤5.00E-2（= 0.05）（1.00E-2≤*著しいP≤5.00E-2重要であると解釈される*非常に重要な、P <1.00E-3 ***非常に重要）。
二つの対立遺伝子間の距離の全体の分布の統計解析。我々は最初のc我々はノンパラメトリック二標本コルモゴロフ·スミルノフ（KS）のテスト13,14を使用する実証的対立遺伝子間の距離の分布の差の有意性を評価する2 alleles.To間で測定された距離の範囲全体にわたって累積分布の周波数曲線をonstruct。
カットオフの最適な距離を使用して、2つの対立遺伝子の密接な関連の統計解析（すなわちペアリング）。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離で最も堅牢な差の範囲を指定するには、我々は2つのテールフィッシャー正確確率検定15秒のシリーズをご使用ください。すなわち、それぞれの測定距離で、我々は一つの条件が大幅に2つのサンプル間の短い距離で過剰表現されているかどうかをテストします。 P値の分布の最小値は、二つの対立遺伝子の密接な関連のカットオフ（ すなわちペアリング）として考慮されるべきである距離の範囲を示しています。続いて2テールフィッシャー正確確率検定は、tを使用されている同定されたカットオフ値15で2つの対立遺伝子のペアリングの意義を評価O。多重検定補正は16を実行フィッシャーテストの総数を考慮するために適用されます。
サブ核コンパートメントまたはタンパク質と目的の遺伝子座の協会の統計分析は、2つのテールフィッシャー正確確率検定は、異なる区画またはタンパク質15を用いて目的の遺伝子座の協会の意義を分析するために使用されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNAと免疫FISHはBおよびTリンパ球の開発時に抗原受容体遺伝子座のV（D）J組み換えのプロセスに関連付けられている核の組織の変化を研究するためにSkokラボで使用されています。私に私たちを有効にする）遺伝子座の両端（収縮）の間の測定距離は上記の詳細技術ⅱ）対立遺伝子または遺伝子座の間の測定距離（ペアリング）、iii）は座、静脈内で発生するDNA損傷を解析するには）対立遺伝子の位置を評価すると（我々の研究では抑圧的なセントロメアヘテロクロマチン）サブコンパートメント核、およびvの相対座は）対立遺伝子と遺伝子座（我々の研究では、γ-H2AXのリン酸化ヒストンの協会）に核タンパク質の関連を評価する。特に、我々はB細胞の17から30を開発中の免疫グロブリン遺伝子座の V（D）J組換えの制御における軌跡ダイナミクスの役割を分析し、CD4 +およびCD8 + Tの間に系譜コミットメントの調節にセル14。我々はまた、コンビナーゼタンパク質RAG2 31の変異型を運ぶT細胞の開発には、T細胞受容体遺伝子座の一つ、TCRA / dでDNA損傷を評価した。
図1。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離の解析（A）共焦点のセクションでは、個々の核内で対になっていない代表（右）またはペア（左）対立遺伝子を示す。のDNA FISHプローブは、目的の遺伝子座にまたがるBAC（〜200キロバイト）から生成されました。対立遺伝子間の距離は、3D画像スタック内の各BAC信号の重心との間で測定した。破線の円は、核の形状を簡単に説明します。スケールバー=1μmである。 （B）の累積度数分布曲線は、2つの対立遺伝子間の距離の全範囲を示す■2つの異なる生物学的条件（野生型対変異）で測定。ノンパラメトリック二標本KSテストは2つの分布間の差の有意性を評価するために使用されていました。間対立遺伝子の距離で最も堅牢な差の範囲は、二尾フィッシャー正確検定（ブルードット）のシリーズを使用して評価した。最も堅牢なP値は（高いドット）1μm付近の距離でした。したがって、2つの対立遺伝子の密接な関係（ つまり、ペアリング）のカットオフは1μmに設定された。 （C）の累積度数曲線は、2つの異なった生物学的条件で0から1.5μmから2対立遺伝子間の距離を示す。二つの対立遺伝子のペアリングの意義は、1μmでカットオフするための2つのテールフィッシャー正確確率検定を用いて評価した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。サブ核コンパートメントに相対座の位置の解析。我々の研究では、我々の興味のある遺伝子座およびセントロメアヘテロクロマチン（PCH）32によって形成された抑圧的なサブ核コンパートメントとの間の関係を分析する。目的の遺伝子座のためのBAC信号は、PCH（BACおよびγ-サテライトDNA FISHシグナルのエッジ間ではピクセル）にハイブリダイズする、γ-衛星信号と隣接または重複するときは、PCHの対立にあると見なされます。共焦点セクションPCHに対する相対TCRA対立遺伝子の位置の代表：PCHにある（ 上 ）ノー対立、（ 中東 ）、PCHで一つの対立、（ 下 ）PCHにおける二つの対立。赤の軌跡、そして白のγ-衛星。黄色の矢印は、PCHにある対立遺伝子を示す。破線の円は、核の形状を概説。スケールバー=1μmである。
図3。核タンパク質と遺伝子座上のヒストン修飾の関連を分析した結果、（A）我々の研究では、DNAの二重のために、私たちの興味のある遺伝子座およびヒストンH2AX（γ-H2AX）のリン酸化形態の関係をとして読み出し解析本鎖切断33。共焦点のセクションでは、個々の核内に1 TCRA対立遺伝子（ 下 ）上の無γ-H2AX協会（ トップ ）若しくは団体の例を示しています。 γ-H2AXに関連付けられているとして、BAC信号および免疫蛍光巣が少なくとも部分的に重なっていた場合、対立遺伝子が（共局在の少なくとも1つの画素）定義されていました。座は白に赤とγ-H2AXに示されている。破線の円輪郭Nucleus形状。スケールバー=1μmである。 それはPCHまたはγ-H2AX病巣BACに信号の共局在化分析が自動化されたしきい値なしでイメージJソフトウェアを使用して手動で実行されていることに注意です。（B）は変性した後、γ-H2AXの信号の一部の損失であるこの免疫のDNA FISHプロトコルによって提起される主要な技術的な質問の1。ここでは、前（ 上 ）と（ 下 ）塩酸ベースの変性処理（ホルムアミド処理（図示せず）が同様の結果が得られた）後の免疫の一例を示す。信号が弱かったが、染色の主な機能は、特に病巣の数は、治療後に残っている。ライカ共焦点SP5を使用して、前と変性後561レーザーの設定は以下のとおりであった：35％のパワー/スマートゲイン730Vで、それぞれ750Vで45％の電力/スマートゲイン。さらに、我々はここで別のヒストンmの免疫蛍光染色の例を示し以前に1,3公開されているように、このプロトコルは、他のヒストンマークにも適用できることを示すodification、H3K27me3（ 右パネル ）。 γ-H2AXは赤に黄色とH3K27me3に示されている。破線の円は、核の形状を簡単に説明します。スケールバー=2μmである。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
| 試薬/材料の名称 | 会社 | Catalogm番号 | 注釈 |
| H 2 O | フィッシャー | ＃BP2470 | |
| アーゼ | シグマ | ＃R4642 | |
| のdNTP | シグマ | ＃DNTP100 | |
| アレクサdUTPを | インビトロジェン | ＃C11397はC-11401 | |
| Cy3またはCy5 dUTPを | フィッシャー | ＃45-001-XXX | |
| DNase Iを | ロッシュ | ＃04536282001 | |
| DNA Pol Iは | バイオラボズ | ＃M0209 | |
| 0.025μmフィルター | ミリポア | ＃VSWP02500 | |
| COT-1 DNAを1 mg / mlの | インビトロジェン | ＃18440 | |
| Hybloc DNAを1 mg / mlの | 応用遺伝学 | ＃MHB | |
| サケ精子 | シグマ | ＃D1626 | 粉末をH 2 O中に10 mg / mlで再懸濁される |
| NAAC（酢酸ナトリウム、pH 5.2緩衝液） | シグマ | ＃S7899 | |
| フィコール400（モルBIOLグレード） | フィッシャー | 第525位 | |
| ポリビニルピロリドン（MOL BIOLグレード） | フィッシャー | ＃BP431 | |
| デキストラン硫酸パウダー | シグマ | ＃D8906 | |
| SSPE（生理食塩水リン酸ナトリウム、EDTA）を20倍ソリューション | フィッシャー | ＃BP1328 | |
| ホルムアミド | フィッシャー | ＃BP227 | |
| カバースリップ | フィッシャー | ＃12-548-B | |
| スライド | フィッシャー | ＃12から550 | |
| 6ウェルプレート | フィッシャー | ＃0720080 | |
| 10×PBS、 | フィッシャー | ＃MT-46-013-CM | |
| シグマ | ＃P8920 | ||
| パラホルムアルデヒド、プリル、95％ | シグマ | ＃441244 | |
| トリトンX-100、MOL BIOLグレード | シグマ | ＃T8787 | |
| BSA（ウシ血清アルブミン）フラクションV | フィッシャー | ＃BP 1600 | |
| 正常ヤギ血清 | ベクトルラボ | ＃S-1000 | |
| Tween-20を、モルBIOLグレード | シグマ | ＃P9416 | |
| SSC（食塩クエン酸ナトリウム）20倍ソリューション | フィッシャー | ＃BP1325 | |
| Gold退色防止試薬を延長 | インビトロジェン | ＃P36930 | |
| DAPI（4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール） | シグマ | ＃D9542 | |
| 最高のテスト1コートラバーセメント | アートやオフィス用品店 |
表1に特異的な試薬及び小型機器。
| アレクサ·フルオロフォアと相まってdUTPを使用してNT | 量 | 最終濃度 |
| 10μgのDNA | μlのX | |
| アーゼ - 0.17μg/μLの | 10μlの | |
| H 2 O | 260μlに埋める | |
| 合計 - 37℃で30分間 | 260μlを | |
| 10倍のNTバッファー | 50μlの | 1X |
| 100mMの＆であるTA; - メルカプトエタノール | 50μlの | 10μMの |
| dNTPミックス | 40μlの | 40μMの各dNTP |
| 0.1mMのdTTPを | 50μlの | 10μMの |
| 1mMのアレクサのdUTP | 12μlの | 30μMの |
| DNアーゼI（ワーキング溶液、下記の表を参照してください） | 30μlの | |
| DNA Pol Iは | 7.5μlの | 15 U / mlの |
| 合計 - 16℃で2時間 | 500μlの | |
| Cy3またはCy5で結合されたdUTPを使用してNT | 量 | 最終濃度 |
| 10μgのDNA | μlのX | |
| アーゼ - 0.17μg/μLの | 10μlの | |
| H 2 O | 300μlに埋める | |
| 合計 - 37℃で30分間 | 300μlの | |
| 10倍のNTバッファー | 50μlの | 1X |
| 100mMのβ-メルカプトエタノール | 50μlの | 10μMの |
| dNTPミックス | 50μlの | 50μMの各dNTP |
| 1mMののCy3またはCy5-dUTPを | 12μlの | 30μMの |
| DNase Iを | 〜30μlの | 〜1.2 U /μlの |
| DNA Pol Iは | 7.5μlの | 15 U / mlの |
| 合計 - 16℃で2時間 | 500μlの |
10μgのDNAについては、 表2。RNase A処理とニック翻訳。
| ソリューション | ストック | |
| アーゼ | 実用的なソリューション ：0.17μg/μLの | 新鮮で構成 |
| 10xのNTのバッファ： | 0.5Mトリス-HCl、pH 8、50 mMのMgCl 2、0.5 mg / mlのBSA | -20℃で1.5 mlチューブ |
| dNTPを混在さ： | のdATP、dCTP、およびdGTP：0.5mMのH 2 O中の各 | -20°Cで1.5 mlチューブ |
| DNアーゼI： | ストック溶液 ：20mMのトリスpH 7.5/50％glycerol/50 mMのNaClに20,000 U / mlとなるように再構成 | -20℃で0.5 mlチューブ |
| ワーキング溶液 ：DNase Iストック溶液のそれぞれの新しいバッチは、（10 U / mlで、H 2 O中の20単位/ ml、40 U / ml）を異なる希釈でテストする必要があります。 100〜1,000 bpの（参照間のDNAのスメアを与える希釈ステップ5）は実用的なソリューションとして使用する必要があります。 | 新鮮で構成 |
表3。RNase A処理とニック翻訳のためのソリューション。
| ハイブリダイゼーション緩衝液 | ソリューション | ストック | |
| 10パーセント | 50倍デンハルト溶液： | 1グラムフィコール400、1グラムポリビニルピロリドンと100 mlのH 2 0 -フィルタされた | -20℃で50mlファルコン |
| 40パーセント | 25パーセント硫酸デキストラン： | デキストラン硫酸パウダー℃で37から65で12.5x SSPE中に溶解させる | -20℃で50mlファルコン |
| 50パーセント | ホルムアミド | 4℃でボトル | |
| 1.5 mlのEppendorfsでアリコートを-20＆で保存される度、C | |||
表4。ハイブリダイゼーション緩衝液。
| 抗体 | サプライヤー | カタログ番号 | 希釈 |
| γ-H2AX - モノクローナルホスホH2A.X、クローンJBW301、マウス | ミリポア | ＃05636 | 200分の1 |
| H3K27me3、クローン、ウサギポリクローナル | ミリポア | ＃07449 | 200分の1 |
| のAlexa Fluor 555ロバ抗マウス | インビトロジェン | ＃-31570 | 500分の1 |
| のAlexa Fluor 488ヤギ抗マウス | インビトロジェン | ＃-11001 | 500分の1 |
| のAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ | インビトロジェン | ＃-11008 | 500分の1 | </ TR>
表5一次抗体および二次抗体。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上記の詳細テクニックは、リンパ球の30,31を開発中の免疫グロブリンおよびTCRA / D座のV（D）J組み換えの規制を分析するために私たちの研究室で使用されていた。我々は、この技術は、異なる細胞型では、様々な核タンパク質、核コンパートメントと遺伝子座の検出に適応させることができると確信しています。プロトコルの修正が必要になることがあり、この場合に集中する主な手順は次のとおりです。まず、透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができる。一次抗体のインキュベーションの第2の長さはまた、抗体の質と目的のタンパク質（例えば、いくつかのケースでは、インキュベーションを4℃で一晩行うことができる）の豊富さに応じて調整することができる。重要なのは、変性ステップを適応させることができ、HCl処理は、DNA FISH 20のホルムアミド3,4,34とNaOHで変性することによって置き換えられる可能性があります。また繰り返す液体窒素のED凍結融解サイクルは、DNA FISH単独で4,34のために固定化/透過処理後に細胞に適用することができる。いくつかのヒストン修飾、RNAポリメラーゼIIと補因子が正常にこの方法30,35を用いて検出されたが最後、他の核内タンパク質の免疫染色は、DNA FISHハイブリダイゼーション4の後に実行することができる。
3D画像解析は、広視野落射蛍光（デコンボリューションと相まって）と共焦点レーザー顕微鏡顕微鏡36を含む異なる種類の、の使用を含むことができます。撮像方法の選択が必要な解像度に依存しますが、蛍光団の数は、サンプルとDNAやタンパク質の信号の質の深さ。新しい高分解能顕微鏡の開発は、核と細胞プロセス37から39までの正確な可視化に完全に新しい道を開きます。 generatioためにさらに、新技術n（いいえ）反復配列を含まないカスタムメイドのプローブのエクソン40の複雑なプールに、15キロバイト特定の遺伝子座から、ゲノム領域のクリーンな検出を可能にする。これは核プロセスのダイナミクスを追跡する高分解能顕微鏡の精度と感度を向上させます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、議論とコメントのためのスザンナ·ヒューイット、特に、Skokラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康補助金総合研究所R01GM086852、RC1CA145746（JAS）によってサポートされています。 JASは白血病リンパ腫協会の学者です。 JCは、がん研究所のアーヴィング研究所フェロー。 MMは、国立科学財団助成統合大学院教育研究見習（NSF IGERT 0333389）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
