Summary
Her beskriver vi en protokoll for samtidig påvisning av histonmodifikasjonene ved immunfluorescens og DNA-sekvenser av DNA fisk etterfulgt av 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-DNA FISH).
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisering med DNA-prober på 3-dimensjonalt bevart kjerner etterfulgt av 3D konfokalmikroskopi (3D DNA FISH) representerer den mest direkte måten å visualisere plasseringen av genloci, kromosomal subregioner eller hele områder i enkeltceller. Denne typen analyse gir et innblikk i global arkitektur av kjernen så vel som virkemåten av spesifikke genomisk loci og regioner innenfor kjernefysiske plass. Immunfluorescens, på den annen side, tillater påvisning av kjernefysiske proteiner (modifiserte histoner, histone varianter og modifikatorer, transkripsjon maskiner og faktorer, kjernefysiske sub-avdelinger, etc). Den største utfordringen i å kombinere immunfluorescens og 3D DNA FISH er, på den ene side for å bevare epitopen detektert av antistoffet samt 3D arkitekturen av kjernen, og på den annen side, for å tillate inntrengning av DNA probe for å påvise genloci eller kromosom territorier 1-5. Her tilbyr vi en protokoll som kombinerer visualisering av kromatin modifikasjoner med genomisk loci i 3D bevart kjerner.
Introduction
Epigenetic mekanismer utløser etablering og arv av utviklings-og celle-type spesifikke transkripsjonelle profiler. På ett nivå innebærer dette modulering av kromatin emballasje som definerer aktive eller stille genomisk regioner. I større målestokk, global 3D organisering av genomet og kjernefysisk arkitektur også spille en rolle i kontroll av transkripsjonelle mønstre. Dermed er disseksjon av disse epigenomic funksjoner avgjørende for en full forståelse av hvordan genene reguleres 6-11.
Kombinert immunfluorescens og 3D DNA FISH gir en unik mulighet til å utfylle biokjemiske og molekylærbiologiske analyser ved å vurdere konkrete interaksjoner / foreninger av DNA-sekvenser og / eller proteiner i kjernen. Videre, mens genom-wide høy gjennomstrømning teknikker som kromatin immunoutfelling (chip-seq) eller kromosom fangst konformasjon kombinert med dyp sekvensering (4C-seq, 5C, Hi-C) gi global data på cellepopulasjoner 12, immunofluorescence / DNA FISK teknikker gjør analyser på enkelt celle-nivå.
Her beskriver vi en protokoll for samtidig påvisning av histonmodifikasjonene ved immunfluorescens og DNA-sekvenser av DNA fisk etterfulgt av 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-FISH). Fordelen med denne protokollen er den kombinerte visualisering av DNA og bevaring av proteinstrukturer. Vår erfaring på dette feltet har gitt oss mulighet til å forbedre og forenkle eksisterende protokoller. Selv om vi har brukt denne protokollen for å oppdage DNA dobbel-strandet pauser i lymfocytter gjennomgår rekombinasjon, kan denne metoden brukes på andre proteiner og andre celle-typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Probe Merking med fluoroforer: Nick Translation (~ 6 timer)
- Renhold BAC DNA (fremstilt ved maksi-prep) eller plasmider eller PCR-produkter, alle resuspendert i H 2 O, kan brukes til merking. Merk at for en robust fiskeekkoet bør prober spenner minst 10 kb.
- Inkuber DNA i RNase A i 30 minutter ved 37 ° C (alle reagenser er oppført i Tabell 1).
- Inkuber nick-translasjon reaksjonen i 2 timer ved 16 ° C (se tabell 2 og 3). Alternative metoder for direkte merking kan brukes (Eksempel: FISH Tag, Invitrogen).
- Inaktivere reaksjonen for en time ved -80 ° C eller over natten ved -20 ° C.
- Bestem sonde størrelse på en 2% agarosegel. Smøre bør være mellom 100 og 1000 bp, med de fleste på ca 300-500 bp (Merk at smøre Cy5-prober ikke er synlig). Hvis DNA ikke fordøyd nok, mer DNA Pol I ogDNase I kan tilsettes til reaksjonen og inkubert i to mer hr ved 16 ° C.
- Rens sonder på 0.025 mm filtre i to liters kanner fylt med H 2 0 for to timer i mørket.
- Legg blokkering faktorer til probene som følger: 10 ug Cot-1 DNA, 10 ug Hybloc DNA og 100 ug laksesperm for 10 ug DNA prober. Oppbevar DNA prober ved -20 ° C.
2. Probe Nedbør / Denaturering / Pre-annealing (3-4 timer)
- Mellom 0,3 ug og 1 ug av DNA-probe blir brukt pr dekkglasset. Mix prober med 0,1 volum 3M NaAc (pH 5,2) og 2,5 volumer 100% etanol, inkuberes i en time ved -80 ° C eller over natten ved -20 ° C og spinne ned på 13.000 rpm ved 4 ° C i 30 min. oppmerksom på at mengden av DNA-probe kan bli justert, avhengig av kvaliteten av DNA og kjernefysiske regionen hybridisering. Alternative metoder for direkte merking kan tillate bruk av reduserte mengder avsonde. For påvisning av flere DNA FISK signaler på ett lysbilde, kan de ulike prober bli fremskyndet sammen (bortsett fra sonder som ikke skal være pre-annealed, som repeterte sekvenser). Prober for flere forsøk utført på samme tid kan også utfelles sammen. Pellets bør lett farget i henhold til fluoroforer brukte (hvis små mengder av prober er utfelt, kan det hende at pelleten ikke være synlig).
- Tørre pellets og resuspender dem i 15 pl hybridiseringsbuffer (se Tabell 4) per dekkglass med risting (ved hjelp av en Eppendorf Thermomixer) i mørket ved 37-45 ° C (i ca 20 min).
- Denature prober for 5 min på 75-95 ° C.
- Pre-anneal prober ved 37 ° C i 30-60 min. Lengde av pre-annealing kan justeres avhengig av kompleksiteten og kvaliteten av probene.
- Påfør sonder til dekkglass for overnatting hybridisering (se avsnitt 3).
3. 3-Dimensjonale DNA FISH - First Day (~ 3 t)
- Ikke-adherente celler blir konsentrert i et lite volum av 1x PBS (~ 2x10 5 celler i 5-10 pl 1x PBS per dekkglass) og falt på midten av et poly-L-lysin belagt dekkglasset. Adherente celler bør dyrket på dekkglass i minst 24 timer (~ 70% konfluens) (dekkglass kan belegges med 0,1% gelatin). Square 18x18 til 24-24 mm dekkglass er plassert i 6-brønners plater, og hele protokollen, er to ml av hver løsning som brukes per brønn (alternativt runde 1,5 mm dekkglass kan plasseres i 12/24-well plater).
- Fix celler i 2% paraformaldehyd / 1x PBS, 7 til 7,4 pH, i 10 minutter ved RT (4% PFA bestander kan alikvoteres, lagret ved -20 ° C). Paraformaldehyd kan kjøpes i løsning (16%), eller 4% stamløsninger kan fremstilles fra pulver / priller. Paraformaldehyd pulver oppløses i 1x PBS ved> 60 ° C (pH kan økes til 8-9 for å lette oppløsningen), avkjølt ned på is, justereed til pH 7 til 7,4, filtrert, alikvoteres i falcons og lagret i flere uker ved -20 ° C.
- Etter tre skyllinger i 1x PBS, permeabilize celler i avkjølt kaldt 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS i 5 min på isen. Lengden permeabilization kan justeres avhengig celle-type NB. Hvis DNA FISH kombineres med immunfluorescens, bør farging utføres på dette stadiet (se avsnitt 4).
- Etter tre skyllinger i 1x PBS, inkuberes cellene med 0,1 ug / ul RNase A i 1x PBS i én time ved 37 ° C. Dekkglass er plassert celle-side ned på et fall på 100 ul av løsning på Parafilm eller et lysbilde i en fuktig kammer. Dekkglass blir deretter forsiktig fjernet med pinsett. Hvis noen motstand merkes, bør dekkglass bli oversvømmet med 1x PBS for å unngå skader på cellene.
- Etter tre skyllinger i 1x PBS, permeabilize celler i iset kaldt 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl i 10 minutter på is.
- Etter tre skyllinger iN 1x PBS, denaturere celler i 1,9 M HCl i 30 minutter ved RT. Alternativt, kan cellene være denaturert i 50% formamid / 2x SSC ved 75-80 ° C i minst 30 min. Merk at hybridisering lengde (og temperatur) kan optimaliseres avhengig celle-type.
- Etter tre skyllinger i iskald 1x PBS, hybridisere celler med sonder over natten ved 37 ° C i et mørkt og fuktig kammer. Dekkglass er plassert celle-side ned på et fall på 15 ul sonde på et lysbilde, og forseglet med gummi sement.
4. 3-dimensjonal Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 timer)
- For kombinert immunfluorescens / DNA fisk, bør immuno-farging utføres etter permeabilization i 0,4% Triton-X-100 (trinn 3.3).
- Inkuber celler i blokkering løsning i 30 minutter ved RT (2,5% bovint serum albumin (BSA), 10% Normal geit Serum, 0,1% Tween-20). Den blokkerende Løsningen filtreres, alikvoteres i 1,5 ml Eppendorfs og lagres for months ved -20 ° C.
- Inkuber celler med det primære antistoff reist mot protein eller histon modifisering av interesse fortynnet i blokkering løsning, for én time ved RT i et fuktig kammer. Her viser vi eksempel på et antistoff mot fosforylert serin-139 fra H2AX (γ-H2AX, Millipore; Se tabell 5 for detaljer). Dekkglass er plassert celle-side ned på et fall på 100 ul av løsning på Parafilm eller et lysbilde i en fuktig kammer. Dekkglass blir deretter forsiktig fjernet med pinsett (oversvømmet med 1x PBS hvis nødvendig). Merk at fortynning og inkubering lengde kan justeres avhengig av kvaliteten av antistoffet og celle-typer.
- Vask celler i 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS tre ganger 5 min ved RT med risting.
- Inkuber celler med passende fluorofor-konjugert sekundært antistoff fortynnet i blokkering løsning for en time ved RT i et mørkt og fuktig kammer. Her viser vi et eksempel på deteksjon med ensekundær geit anti-mus antistoff (Alexa Fluor 488 eller 555, Invitrogen, se tabell 5 for detaljer). Hapten-konjugerte sekundære antistoffer (biotin, Digoxigenin, osv.) kan også anvendes. I dette tilfellet, kan et ekstra trinn for passende deteksjon (streptavidin, anti-dig, etc) utføres enten før eller etter over-natten DNA-FISH hybridisering.
- Skyll celler i 0,1% Tween-20 / 1x PBS tre ganger 5 min ved RT med rysting i mørket.
- Post-fix celler i 2% paraformaldehyd / 1x PBS i 10 minutter ved RT i mørket.
- Fortsett DNA FISH som ovenfor fra inkubasjon i RNase A (trinn 3.4).
5. 3-dimensjonal DNA FISH / Immuno-FISH - Andre dag (~ 2 timer)
- Fjern forsiktig gummi sement, flom dekkglass med 2x SSC, fjern forsiktig med pinsett og plassere dem i brønner som inneholder vask løsning.
- Vask celler i 2x SSC i 30 minutter ved 37 ° C i mørke med risting.
- Vask celler i 2x SSC i 30 minutter ved RT i mørket med risting.
- Vask celler i 1x SSC i 30 minutter ved RT i mørket med risting Merk at i tilfelle av denaturering med formamid, bør vasker erstattes av følgende:. 3 vaskinger i 50% formamid / 2x SSC og 3 vaskinger i 2x SSC, 5 min hver, ved 37 ° C.
- Montere cellene i forlenge Gold montering medium inneholdende 1,5 ug / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) for kontrafarging av total DNA. Dekkglass er plassert celle-side ned på en dråpe på 10-15 ul montering medium på et lysbilde og forseglet med neglelakk. Lysbildene er holdt i flere måneder ved -20 ° C.
6. 3D Mikroskopi og analyse
- 3D-bilder kan bli kjøpt med forskjellige mikroskop systemer. I våre eksperimenter, er optiske deler atskilt med 0,3 mikrometer samlet på en Leica SP5 AOBS confocal system (Akusto Optisk Beam Splitter). Merk at avstanden mellom optical flyene kan justeres avhengig av typen av analyse.
- 3D-bilde stabler kan analyseres ved hjelp av ulike programvare og verktøy. Vi bruker Image J programvare for å vurdere avstandsmålinger mellom loci av interesse og til å analysere ulike typer sammenslutning av de loci av interesse med sub-nukleære avdelinger eller proteiner.
- Alle statistiske analyser er utført for å sammenligne to (eller flere) ulike biologiske betingelser med parvise vurdering (r) av betydning: sammenligning mellom ulike celletyper eller stadier, sammenlikning mellom forskjellige loci av interesse. I alle statistiske tester, P-verdier ≤ 5.00E-2 (a = 0,05) er tatt for å være signifikant (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * signifikant; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * svært viktig, P <1.00E-3 *** stor betydning).
Statistisk analyse av hele distribusjoner av avstander mellom to alleler. Vi først construct kumulative distribusjon frekvens kurver over hele området av målte avstander mellom de to alleles.To vurdere betydningen av forskjeller i fordelingen av empiriske inter-alleliske avstander vi bruker parametrisk to-utvalg Kolmogorov-Smirnov (KS) test 13,14.
Statistisk analyse av nær tilknytning (dvs. sammenkobling) av to alleler ved hjelp av en optimal avstand cut-off. Å identifisere omfanget av de fleste robuste forskjeller i avstander mellom to alleler eller loci, bruker vi en serie med to-tail Fisher eksakt test 15 sek. Nemlig at hver målt avstanden vi teste om en betingelse er betydelig overrepresentert på kortere avstander mellom de to utvalgene. Minimum i fordelingen av p-verdier indikerer omfanget av avstander som bør vurderes som en cut-off for nær tilknytning (dvs. paring) av de to alleler. Deretter to-tail Fisher eksakt test brukes to vurdere betydningen av sammenkobling av to alleler på identifiserte cut-off verdi 15. Flere tester korreksjoner blir anvendt på kontoen for det totale antall Fisher tester utført 16.
Statistisk analyse av sammenslutning av locus av interesse med sub-nukleære avdelinger eller proteiner. De to-tail Fisher-eksakte test brukes til å analysere betydningen av foreningen av locus av interesse med ulike avdelinger eller proteiner 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA og immuno-fisk brukes i Skok lab til studere endringene i kjernefysisk organisasjon knyttet til prosessen av V (D) J-rekombinasjon av antigen-reseptor loci under B og T-lymfocytt utvikling. Teknikkene beskrevet ovenfor gjør oss i stand til å i) måle avstander mellom de to endene av et locus (sammentrekning) ii) måle avstander mellom alleler eller loci (sammenkobling), iii) analysere DNA skade som oppstår i løpet av loci, iv) vurdere plasseringen av alleler og loci i forhold til kjernekraft sub-avdelinger (undertrykkende pericentromeric heterochromatin i vår studie), og v) vurdere sammenslutning av kjernefysiske proteiner på alleler og loci (sammenslutning av de fosforylert histone γ-H2AX i vår studie). Spesielt, analyserte vi rolle lokus dynamikk i reguleringen av V (D) J-rekombinasjon av immunoglobulin loci i utvikle B celler 17-30, og i regulering av avstamning engasjement mellom CD4 + og CD8 + Tceller 14. Vi også vurdert DNA skade på en av de T-celle reseptor locus, Tcra / d, i å utvikle T celler som bærer en mutant form av rekombinase proteinet RAG2 31.
Figur 1. Analyse av avstander mellom to alleler eller loci. (A) confocal seksjoner viser representative uparrede (høyre) eller sammenkoblet (venstre) alleler i enkelte kjerner. DNA FISH granskningen ble generert fra en BAC (~ 200 kb) spenner locus av interesse. Avstander mellom alleler ble målt mellom massesenteret av hver BAC signal i 3D-bilde stabler. Stiplede sirkler skissere nucleus figurer. Skala barer = 1 mikrometer. (B) kumulativ frekvens fordelingskurver viser hele spekteret av avstander mellom de to allelfiltre målt i to forskjellige biologiske forhold (villtype vs mutant). Den parametriske to-utvalg KS test ble brukt til å vurdere betydningen av forskjellene mellom de to distribusjonene. Utvalget av de fleste robuste forskjeller i inter-alleliske avstander ble vurdert ved hjelp av en serie med to-tail Fisher eksakte tester (blå prikker). De mest robuste P-verdier (høyere punkter) ble funnet med avstander rundt 1 mikrometer. Dermed cut-off for nær tilknytning (dvs. paring) av de to alleler ble satt opp på en mikrometer. (C) Kumulativ frekvens kurver som viser avstanden mellom de to alleler 0 til 1,5 mikrometer i de to forskjellige biologiske forhold. Betydningen av sammenkobling av de to alleler ble vurdert ved hjelp av to-tail Fisher eksakt test for en cut-off på en mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Analyse av plasseringen av et locus i forhold til sub-nukleære avdelinger. I våre studier analyserer vi forholdet mellom våre loci av interesse og det undertrykkende sub-kjernefysisk kupé dannet av pericentromeric heterochromatin (PCH) 32. Alleler anses som plassert på PCH når BAC signalet for locus av interesse er tilstøtende eller overlappende med γ-satellittsignal som hybridiserer til PCH (ingen piksel mellom kantene på BAC og γ-satellitt DNA fiskeekko). Confocal seksjoner representant for plasseringen av Tcra alleler i forhold til PCH: (Til toppen) ingen allel ligger på PCH, (Middle) ett allel på PCH, (Bottom) to alleler i PCH. Locus i rødt, og γ-satellitt i hvitt. Gule piler viser allelene ligger på PCH. Stiplede sirkler skissere nucleus figurer. Skala bar = 1 mikrometer.
Figur 3. Analyse av foreningen av kjernefysiske proteiner og histonmodifikasjonene på et locus. (A) I våre studier analyserer vi forholdet mellom våre loci av interesse og fosforylert form av den histone H2AX (γ-H2AX), som lese-out for DNA dobbel -strandet pauser 33. Confocal seksjoner viser eksempler på ingen γ-H2AX forening (Til toppen) eller foreningen på en Tcra allel (nederst) i individuell kjerner. Alleler ble definert som i forbindelse med γ-H2AX hvis BAC signaler og immunfluorescens foci var minst delvis overlappet (minst en piksel colocalization). Locus er vist i rødt og γ-H2AX i hvitt. Stiplede sirkler disposisjon nucleus former. Målestokk = 1 um. Det er å merke seg at colocalization analyser av BAC signalet med PCH eller γ-H2AX foci utføres manuelt ved hjelp av Image J programvare uten automatisert terskel. (B) tap av en del av-γ H2AX signal etter denaturering er en av de viktigste tekniske spørsmål reist av denne immuno-DNA FISH-protokollen. Her viser vi et eksempel på immunfluorescens før (øverst) og etter (nederst) HCl-basert denaturering behandling (formamid-behandling ga lignende resultater (ikke vist)). Selv om signalet var svakere, hovedtrekkene farging, særlig antall foci, forblir etter behandlingen. Bruke en SP5 Leica confocal, var innstillingene for 561 laser før og etter denaturering følgende: 35% strøm / smart gevinst på 730V, og 45% strøm / smart gevinst ved 750V, henholdsvis. Videre viser vi her et eksempel på en immunfluorescens flekker for en annen histone modification, H3K27me3 (Høyre paneler) viser at denne protokollen kan brukes til andre histone merker, som tidligere har blitt publisert 1,3. γ-H2AX er vist i gult og H3K27me3 i rødt. Stiplede sirkler skissere nucleus figurer. Målestokk = 2 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
| Navn på reagens / Material | Selskapet | Catalogm Antall | Kommentarer |
| H 2 O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 til C-11401 | |
| Cy3 eller Cy5 dUTP | Fisher | 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 mikrometer filter | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Laksesperm | Sigma | # D1626 | pulver som skal resuspendert ved 10 mg / ml i H 2 O |
| NaAc (natriumacetat, pH 5,2, bufferoppløsning) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dekstransulfat pulver | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-natriumfosfat-EDTA) 20x løsning | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Dekkglass | Fisher | # 12-548-B | |
| Lysbilder | Fisher | # 12-550 | |
| 6-brønners plater | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehyd, priller, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (bovint serum albumin) fraksjon V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal geit serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x løsning | Fisher | # BP1325 | |
| Forlenge Gold antifade reagens | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test ett strøk gummi sement | Kunst eller på kontoret forsyne butikkene |
Tabell 1. Spesifikke reagenser og små utstyr.
| NT med dUTP kombinert med Alexa-fluorophores | Beløp | Endelig konsentrasjon |
| 10 ug DNA | X ul | |
| RNase A - 0,17 mikrogram / ul | 10 pl | |
| H 2 O | Fyll til 260 ul | |
| TOTAL - 30 min ved 37 ° C | 260 ul | |
| 10x NT buffer | 50 ul | 1x |
| 100 mM og væreta;-mercaptoethanol | 50 ul | 10 pM |
| dNTP mix | 40 pl | 40 pM hver dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 ul | 10 pM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 ul | 30 pM |
| DNase I (fungerende løsning, se tabell nedenfor) | 30 ul | |
| DNA Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 timer ved 16 ° C | 500 ul | |
| NT med dUTP kombinert med Cy3 eller Cy5 | Beløp | Endelig konsentrasjon |
| 10 ug DNA | X ul | |
| RNase A - 0,17 mikrogram / ul | 10 pl | |
| H 2 O | Fyll til 300 ul | |
| TOTAL - 30 min ved 37 ° C | 300 ul | |
| 10x NT buffer | 50 ul | 1x |
| 100 mM β-merkaptoetanol | 50 ul | 10 pM |
| dNTP mix | 50 ul | 50 pM hver dNTP |
| 1 mM Cy3-eller Cy5-dUTP | 12 ul | 30 pM |
| DNase I | ~ 30 ul | ~ 1,2 U / ul |
| DNA Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTAL - 2 timer ved 16 ° C | 500 ul |
Tabell 2. RNase A behandling og Nick Oversettelse for 10 ug DNA.
| Løsninger | Aksjer | |
| RNase A | Arbeide løsning: 0,17 ug / ul | Gjort opp friske |
| 10x NT buffer: | 0.5M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgCl 2, 0,5 mg / ml BSA | 1,5 ml rør ved -20 ° C. |
| dNTP Mix: | dATP, dCTP, og dGTP: 0.5mm hver i H 2 O | 1,5 ml rør ved -20 ° C |
| DNase I: | Stamoppløsning: rekonstitueres ved 20.000 U / ml i 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | 0,5 ml rør ved -20 ° C |
| Arbeide løsning: Hver ny gruppe med DNase I stamløsningen bør testes på ulike fortynninger (10 U / ml, 20 U / ml og 40 U / ml i H 2 O). Fortynningen som gir en DNA smear mellom 100 og 1000 bp (setrinn 5) skal brukes som arbeidsløsningen. | Gjort opp friske |
Tabell 3. Løsninger for RNase A behandling og Nick Translation.
| Hybridiseringsbuffer | Løsninger | Aksjer | |
| 10% | 50x Denhardfs løsning: | 1 g 400 Ficoll, 1 g polyvinylpyrrolidon og 100 ml H 2 0 - Filtrert | 50 ml falcon ved -20 ° C |
| 40% | 25% dekstransulfat: | Dekstransulfat pulveret er oppløst i 12,5 x SSPE ved 37-65 ° C | 50 ml falcon ved -20 ° C |
| 50% | Formamide | Flasker ved +4 ° C | |
| Alikvoter i 1,5 ml Eppendorfs lagres ved -20 &grader, C | |||
Tabell 4. Hybridisering buffer.
| Antistoffer | Leverandør | Katalognummer | Fortynning |
| γ-H2AX - phospho H2A.X, klone JBW301, monoklonalt | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, klone, kanin polyklonalt | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-mus | Invitrogen | # A-31570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 geit anti-mus | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-kanin | Invitrogen | # A-11008 | 1/500 | </ Tr>
Tabell 5. Primære og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene beskrevet ovenfor ble brukt i vårt laboratorium for å analysere reguleringen av V (D) J-rekombinasjon av immunoglobulin og Tcra / d loci i utviklingen lymfocytter 30,31. Vi er sikre på at denne teknikken kan tilpasses for påvisning av ulike kjernefysiske proteiner, kjernefysiske avdelinger og loci, i ulike celle-typer. Modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig, og i dette tilfellet de viktigste trinnene å fokusere på er følgende. Først, kan lengden permeabilization justeres avhengig celle-type. Sekund lengden av den primære antistoff inkubering kan også justeres i henhold til kvaliteten av antistoffet og overflod av proteinet av interesse (for eksempel i noen tilfeller, kan det utføres inkubering over natten ved 4 ° C). Viktigere, kan denaturering trinnet tilpasses, og HCl behandling kan erstattes av denaturering i formamid 3,4,34 og NaOH for DNA fisk 20. Også gjentaed fryse-tine sykluser av flytende nitrogen kan påføres cellene etter fiksering / permeabilization for DNA fisk alene 4,34. Til slutt, mens flere histonmodifikasjonene, RNA polymerase II og co-faktorer har blitt oppdaget ved hjelp av denne metoden 30,35, kan immuno-farging for andre kjernefysiske proteiner utføres etter DNA FISH hybridisering 4.
3D bildeanalyse kan innebære bruk av ulike typer mikroskoper, inkludert wide-feltet epifluorescence (kombinert med dekonvolusjon) og confocal laser mikroskopi 36. Valget av avbildningsmetode vil avhenge oppløsningen kreves, antall fluoroforer, dybden av prøvene og kvaliteten av DNA-og protein-signaler. Utviklingen av nye høyoppløselige mikroskoper åpner en helt ny avenue i nøyaktig visualisering av kjernefysiske og cellulære prosesser 37-39. Videre nye teknikker for generation av skreddersydde sonder som ikke inneholder repeterende sekvens aktivere ren påvisning av genomisk regioner, fra en 15-kb bestemt locus, til komplekse bassenger av eksoner 40. Dette øker nøyaktigheten og følsomheten av høyoppløste mikroskopi i å spore dynamikken i kjernefysiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmene av Skok lab, spesielt Susannah Hewitt, for diskusjoner og kommentarer. Dette arbeidet er støttet av National Institute of Health tilskudd R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS er en Leukemi og lymfom Society forsker. JC er en Irvington Institute Fellow ved Cancer Research Institute. MM er støttet av National Science Foundation Grant Integrative Graduate Utdannings-og forskningsdepartementet Praksisplass (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
