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स्तन कैंसर के माउस मॉडल में ट्यूमर microenvironment में दवा प्रतिक्रियाओं की इमेजिंग जीते

Published: March 24, 2013 doi: 10.3791/50088
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2
1Watson School of Biological Sciences, 2Cold Spring Harbor Laboratory, 3Departments of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital

Summary

हम इमेजिंग विरोधी कैंसर उपचार के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए एक विधि का वर्णन

Abstract

ट्यूमर microenvironment ट्यूमर दीक्षा, प्रगति, मेटास्टेसिस, और विरोधी कैंसर उपचार के लिए जवाब में एक निर्णायक भूमिका निभाता है. तीन आयामी सह संस्कृति प्रणालियों अक्सर दवा प्रतिक्रियाओं में उनकी भूमिका सहित ट्यूमर stroma बातचीत, बयान करना करने के लिए किया जाता है. हालांकि, कि बातचीत बरकरार microenvironment में vivo में होने की कई पूरी तरह से इन विट्रो सेटिंग में इन में नहीं दोहराया जा सकता है. इस प्रकार, वास्तविक समय में इन प्रक्रियाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रियाओं को समझने और कैंसर की कोशिकाओं के बीच बातचीत और stroma कि इन प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं की पहचान में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. यहाँ हम रहते हैं, anesthetized चूहों की कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए सीधे दवा वितरण, कैंसर कोशिका प्रतिक्रियाओं और स्तन कैंसर मॉडल में प्रणालीगत थेरेपी के प्रशासन के बाद ट्यूमर stroma बातचीत में परिवर्तन का पालन करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. हम labeli के लिए प्रक्रियाओं का वर्णनएनजी विभिन्न ट्यूमर घटकों, चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं के अवलोकन के लिए पशुओं के उपचार और इमेजिंग के लिए ट्यूमर ऊतकों को उजागर 40 घंटे तक के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया. इस प्रोटोकॉल से प्राप्त परिणामों के समय चूक फिल्मों, जिसमें दवा घुसपैठ, कैंसर कोशिका मृत्यु और stromal सेल प्रवास जैसे प्रक्रियाओं छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता हैं.

Introduction

कैंसर की कोशिकाओं और stromal घटक (दोनों सेलुलर और गैर सेलुलर) है कि ट्यूमर 1 विकास के लिए एक उपयुक्त वातावरण को बनाए रखने में सहायता: ठोस ट्यूमर दो प्रमुख डिब्बों के शामिल हैं. इन stromal घटक के कैंसर के स्तन 2-5 की उन सहित कई प्रकार के विकास, प्रगति और मेटास्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. stromal परिवेश भी चिकित्सकीय प्रतिक्रियाओं 2,4,5 को प्रभावित करती है. इस प्रकार, का निर्धारण कैसे कैंसर की कोशिकाओं को बरकरार microenvironment के संदर्भ में पारंपरिक और उपन्यास उपचार के लिए जवाब कैंसर जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने और मौजूदा चिकित्सीय रणनीतियों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, परिभाषित कैसे कैंसर कोशिका stroma बातचीत को बदलने के लिए चिकित्सा के प्रशासन के बाद ट्यूमर के डूबने के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

Organotypic सह संवर्धन प्रणाली ट्यूमर stroma बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोगी किया गया है इन विट्रो में बरकरार ट्यूमर संवहनी समारोह और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती करने के लिए सम्मान के साथ विशेष रूप से, microenvironment नहीं पुनरावृत्ति कर सकते हैं. दरअसल, कैंसर उपचार है कि इन विट्रो में मनाया जाता है सेल प्रतिक्रिया अक्सर में काफी vivo में मनाया, जहां microenvironment 5 बरकरार है उन लोगों से अलग कर रहे हैं. इस प्रकार, चिकित्सकीय प्रतिक्रिया पर ट्यूमर stroma बातचीत और उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए vivo मॉडल में बेहतर चिकित्सकीय प्रासंगिक तंत्र 7 को प्रतिबिंबित कर सकते हैं.

vivo में विरोधी कैंसर चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के प्राथमिक साधन के ट्यूमर के आकार और इलाज पशुओं या मरीजों से प्राप्त ऊतकों के histological मूल्यांकन के मापन के माध्यम से किया गया है. हालांकि, माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से में पिछले दो दशकों में प्रगति के अंतर और intracellular प्रक्रियाओं के दृश्य सक्षम हैरहते हैं, anesthetized जानवरों में उच्च संकल्प (intravital इमेजिंग) 8. ये intravital माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों spatially और अस्थायी सेलुलर और उप सेलुलर संकल्प 8,9 में ट्यूमर stroma बातचीत के vivo गतिशीलता में विदारक के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सिद्ध कर दिया है.

प्रक्रियाओं है कि intravital इमेजिंग द्वारा सुलझाया विरोधी ट्यूमर टी सेल 10,11 cytotoxicity, टी कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं 12 के बीच बातचीत, कोलेजन संरचना और चिकित्सीय उपचार 13, बृहतभक्षककोशिका निर्भर कैंसर सेल intravasation और मेटास्टेसिस के बाद संगठन में परिवर्तन की गतिशीलता 14, और संवहनी पारगम्यता 15.

Intravital इमेजिंग के लिए तीन प्रमुख आवश्यकताओं हैं. इन ऊतकों की उचित तैयारी और जोखिम इमेजिंग, हित के ऊतक घटकों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए, और एक जोड़ी माइक्रोस्कोपी कैमराछवियों 16 प्राप्त करने के सक्षम ystem. सबसे आम इन आवश्यकताओं का पता करने के लिए प्रयोग किया जाता रणनीतियों में शामिल हैं. 2) ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से) 1 heterotopic (जैसे, कान या आँख कक्षीय के टीका) की तैयारी, स्थायी इमेजिंग खिड़कियां, या exteriorized तैयारियाँ (जैसे, पृष्ठीय त्वचा प्रालंब): फ्लोरोसेंट injectables ऊतक घटक लेबल करने के लिए, और) 3 multiphoton या confocal माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के साथ बनती photomultiplier ट्यूब या आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरों, क्रमशः 9. हम एक शल्य चिकित्सा तैयार त्वचा प्रालंब anesthetized जानवरों है कि फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से एन्कोडिंग transgenes व्यक्त इमेजिंग के लिए वंक्षण स्तन ग्रंथि का पर्दाफाश मॉडल का उपयोग करें. छवियाँ 12 से 40 घंटे का उपयोग करते हुए एक तेज (ICCD) सीसीडी कैमरा चार लेजर कताई डिस्क confocal खुर्दबीन 17 प्रणाली के साथ जोड़ा की एक अवधि में प्राप्त कर रहे हैं. इस तरीके में इमेजिंग vivo दवा वितरण, मंच पर निर्भर चर्चा के रूप में हमें इस तरह की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई हैemotherapeutic प्रतिक्रियाओं, कीमोथेरपी प्रेरित कोशिका मृत्यु, और माइलॉयड सेल 5 व्यवहार के प्रकार.

हम विरोधी कैंसर चिकित्सा और स्तन कैंसर के माउस मॉडल में ट्यूमर stroma बातचीत कैंसर कोशिका प्रतिक्रियाओं का intravital इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए व्यवहार और दोनों कैंसर की कोशिकाओं और stromal घटकों के की मौत के ट्रांसजेनिक और इंजेक्शन फ्लोरोसेंट लेबल की एक विस्तृत विविधता के साथ अप करने के लिए एक एकल इमेजिंग सत्र में 40 घंटे के लिए अवधि के लिए दोनों ट्रांसजेनिक और प्रत्यारोपण मॉडल में ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

सभी वर्णित प्रक्रियाओं स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पूर्व अनुमोदन सहित हड्डीवाला जानवरों के इस्तेमाल के लिए और दिशा निर्देशों और नियमों के साथ अनुसार किया जाना चाहिए.

1. माउस स्तन ट्यूमर इमेजिंग (ट्रांसजेनिक या orthotopic) के लिए पैदा

  1. इमेजिंग अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए स्तन ट्यूमर उत्पन्न (जैसे माउस स्तन ट्यूमर वायरस लंबे टर्मिनल दोहराने [MMTV] polyoma बीच टी प्रतिजन [PyMT] या चूहा (1) प्रमोटर संचालित बड़े टी प्रतिजन C3 SV40 (टैग) [C3 ( 1) टैग]) मॉडल या orthotopic प्रत्यारोपण मॉडल (syngeneic, allogeneic, या xenogeneic).
  2. ट्रांसजेनिक रिपोर्टर (जैसे ACTB ECFP) लाइनों या प्राथमिक कैंसर की कोशिकाओं को या सेल (जैसे पारगमन) प्रत्यारोपण द्वारा बाद लाइनों के पूर्व vivo हेरफेर का उपयोग के साथ अनुवांशिक इंजीनियर मॉडल पार करके कैंसर की कोशिकाओं लेबल. Orthotopic प्रत्यारोपण, के लिए एक नमूना प्रोटोकॉल के लिए18 ee.

2. ट्यूमर microenvironment या उप सेलुलर अवयव के Visualizing अवयव

  1. ट्यूमर ट्रांसजेनिक लेबलों का उपयोग घटकों Visualizing. ट्रांसजेनिक रिपोर्टर (जैसे c-एफएमएस EGFP माइलॉयड कोशिकाओं नाभिक के लिए या ACTB H2B-EGFP के लिए) चूहों या प्रतिरोपित, लेबल ऊतकों के प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस तरह के चूहों का उपयोग के साथ अनुवांशिक इंजीनियर ट्यूमर मॉडल crossbreed. यह चिकित्सा या परमाणु कोशिका मृत्यु के साथ जुड़े परिवर्तन करने के लिए जवाब में कैंसर कोशिका stromal सेल बातचीत के दृश्य में सक्षम बनाता है, क्रमशः.
  2. Visualizing microenvironment injectables का उपयोग कर. एजेंटों की एक विस्तृत विविधता (जैसे fluorescently लेबल एंटीबॉडी या रासायनिक रंगों) ट्यूमर के विभिन्न घटकों के लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. डाई आधा जीवन और प्रतिक्रिया एक ट्रैकिंग में दिलचस्पी है पर निर्भर करता है, इंजेक्शन इमेजिंग के शुरू करने के लिए पहले प्रशासित कर सकते हैं या इमेजिंग सत्र के दौरान या तो (iv.) नसों के द्वारा या int(आईपी, चित्रा 1) raperitoneally.

3. सूक्ष्मदर्शी और इमेजिंग सॉफ्टवेयर

  1. माइक्रोस्कोप. खुर्दबीन सिस्टम और सॉफ्टवेयर की एक किस्म के चूहों के रहते इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया सिस्टम confocal या multiphoton सूक्ष्मदर्शी हैं. ICCD कैमरा (XR मेगा 10EX S-30, स्टैनफोर्ड फोटोनिक्स, पालो आल्टो, सीए) के साथ एक सूक्ष्म lensed कताई डिस्क confocal खुर्दबीन (Solamere टेक्नोलॉजीज, साल्ट लेक सिटी, केन्द्र शासित प्रदेशों) का उपयोग करें.
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर. हम खुले स्रोत सॉफ्टवेयर μManager (घाटी लैब, कैलिफोर्निया, सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय [UCSF]) का उपयोग करें.
  3. छवि विश्लेषण. हम छवि विश्लेषण के लिए (Bitplane) Imaris, Volocity (PerkinElmer), और ImageJ (स्वास्थ्य [] NIH राष्ट्रीय संस्थान) का उपयोग करें.

4. इमेजिंग (पूर्व) के लिए पशु का उपचार

  1. वंक्षण स्तन ट्यूमर इमेजिंग हमारी प्रोटोकॉल का उपयोग कर जब लंबे समय तक व्यास कैलीपर measur द्वारा लगभग 8 मिमी या उससे कम के उपाय करने के लिए इष्टतम हैंement.
  2. इमेजिंग एक छोटा सा अणु अवरोध करनेवाला, चिकित्सीय प्रतिरक्षी या chemotherapeutic दवा के साथ पशुओं का इलाज के लिए उपचार के लिए या पहले इमेजिंग के दौरान के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक शुरू करते हैं. उदाहरण के लिए, दवा परिस्त्राव और वितरण की इमेजिंग प्रशासन की आवश्यकता के बाद इमेजिंग (1 सिनेमा और 2) शुरू किया गया है, जबकि सेल chemotherapeutic दवा डॉक्सोरूबिसिन द्वारा प्रेरित मौत की इमेजिंग सर्वश्रेष्ठ इमेजिंग 24 घंटे शुरू करने से कब्जा कर लिया है या बाद में नशीली दवाओं के उपचार के बाद (3 सिनेमा और) 4.

5. इमेजिंग के दौरान पशु के हाइड्रेशन और रक्त osmolarity को बनाए रखने के लिए नमक की तैयार

  1. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में 1x पीबीएस के लगभग 1 मिलीलीटर ड्रा. Propidium आयोडाइड (पीआई, Invitrogen, 1 मिलीग्राम / एमएल, पतला 01:15) यह समाधान है कि इमेजिंग सत्र के दौरान समय - समय पर प्रशासित किया जाएगा (आईपी) के लिए जोड़ा जा सकता है. यह कि पारगम्य कोशिका झिल्ली है मृत या मर कोशिकाओं के नाभिक की इमेजिंग के लिए अनुमति देगा. PI एक बहुत ही कम एचएएलच vasculature में जीवन और इसलिए चाहिए इमेजिंग सत्र के दौरान फिर से प्रशासित किया.
  2. इस सिरिंज एक पंख जलसेक सेट (23 गेज, ¾ इंच सुई, 12 इंच टयूबिंग) संलग्न और खारा समाधान रास्ते की एक बूंद तक टयूबिंग के माध्यम से समाधान धक्का टयूबिंग की अंत में सुई की नोक.
  3. जलसेक सेट, और यह उपयुक्त नमकीन घोल के साथ फिर से भरना से सिरिंज निकालें.
  4. संचार सेट सिरिंज देते, देखभाल करने के लिए लाइन में बुलबुले परिचय नहीं.

6. Isoflurane संज्ञाहरण सिस्टम की तैयारी

  1. छिटकानेवाला पानी जोड़ें और यह जगह में पेंच. इस जानवर को दिया गैसों गीला, फेफड़ों की जलन को रोकने और लंबी अवधि के संज्ञाहरण के तहत जानवरों के अस्तित्व को लम्बा.
  2. शीर्ष पंक्ति isoflurane टैंक भरें. चेतावनी: isoflurane एक शक्तिशाली चतनाशून्य करनेवाली औषधि भी है कि अनुसंधानकर्ता को प्रभावित कर सकते हैं. उपयुक्त वैक्यूम सिस्टम ख चाहिएजगह में ई करने के लिए सुनिश्चित करें कि अधिक गैसों को क्षेत्र से हटाया जाता है.
  3. दोनों ऑक्सीजन टैंक और नाइट्रोजन टैंक पर मुड़ें और प्रवाह को समायोजित. नाइट्रोजन चारों ओर एल / मिनट 1.0 पर हो सकता है, जबकि ऑक्सीजन 0.2 एल / मिनट (~ 21%) के आसपास होना चाहिए.
  4. निर्वात (घर) पर मुड़ें. वैक्यूम 1.2 एल / मिनट के बारे में होना चाहिए.
  5. इस बात की पुष्टि करें कि संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष लाइन खुला है, और सर्जरी के क्षेत्र में लाइनों और माइक्रोस्कोप बंद हो जाती हैं.
  6. इस बात की पुष्टि करें कि लाटेकस श्वास संज्ञाहरण प्रणाली से जुड़ी बैग फुलाया जाता है. यदि बैग नहीं फुलाना है, यह जगह.
  7. नाक शंकु खुर्दबीन मंच और शल्य चिकित्सा मंच संज्ञाहरण देने की प्रत्येक पर रबर डायाफ्राम की जाँच करें. यदि रबर पतली करने के लिए शुरू कर रहा है, यह जगह.

7. सर्जिकल उपकरण और शल्य चिकित्सा मंच की तैयारी

  1. एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ पर मुड़ें और यह> 200 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच
  2. साबुन और पानी में धो सर्जिकल उपकरण(एक संदंश की जोड़ी अधिमानतः दांत के साथ [] और जानवर की त्वचा के माध्यम से काटने के लिए कैंची, संदंश की एक जोड़ी [अधिमानतः दाँतेदार] और ट्यूमर के आगे प्रदर्शन के लिए कैंची).
  3. कम से कम 30 सेकंड के लिए शल्य चिकित्सा उपकरण गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ (वैकल्पिक रूप से, सर्जिकल उपकरण अग्रिम में autoclaved जा सकता है) का उपयोग जीवाणुरहित.
  4. सर्जिकल उपकरण बंद शांत करते हुए निष्फल उपकरण contaminating से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. एक स्टायरोफोम शिपिंग कूलर ढक्कन ले लीजिए. यह अपने शल्य चिकित्सा मंच होगा.
  6. स्टायरोफोम ढक्कन (इसे कवर करने के लिए पर्याप्त) के शीर्ष पर एक प्रयोगशाला मूसलधार बारिश का एक टुकड़ा रखें.
  7. प्रत्यय प्रयोगशाला टेप के साथ प्रयोगशाला मूसलधार बारिश (1 एक संज्ञाहरण प्रणाली के लिए लाइन के साथ एक नाक शंकु स्टायरोफोम ढक्कन में टेप के माध्यम से नाक शंकु के दोनों तरफ सुई "टेप यहाँ सबसे अच्छा काम करता है) एक 18 जी x1 साढ़े सम्मिलित करें." रखने के लिए नाक शंकु जगह में सुरक्षित है.
  8. एक तरफ Betadine, बाँझ धुंध, दो 70% isopropanol पोंछे, माइक्रोस्कोप सेटप्रयोगशाला टेप के टुकड़े स्लाइड, Krazy गोंद, और 4 (½ "चौड़ाई).

8. माइक्रोस्कोप की तैयारी

  1. माइक्रोस्कोप, कैमरा, और माइक्रोस्कोप से चल रहे कंप्यूटर पर मुड़ें.
  2. हीटिंग कंबल पर मुड़ें.
  3. यदि एक औंधा माइक्रोस्कोप के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, एक मंच पर कस्टम बनाया डालने इमेजिंग वंक्षण स्तन ग्रंथियों के स्थान पर इसी बंदरगाहों के साथ डिजाइन किया जाना चाहिए. साफ चरण के साथ अच्छी तरह से साबुन और पानी और सूखी डाल. प्रयोगशाला (½ "सबसे अच्छा काम करता है) टेप का उपयोग इमेजिंग बंदरगाहों पर कवर कांच (# मोटाई 1.5) सुरक्षित और 70% isopropanol साथ पूरी सतह को साफ बाँझ धुंध के साथ मंच को कवर करने के लिए प्रदूषण के खिलाफ की रक्षा. मंच में चरण डालने रखें और यह शुष्क हवा करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. प्रयोगशाला टेप के 4 से 6 टुकड़े (1 "चौड़ाई) फाड़ो, लंबाई में लगभग 6 इंच और उन्हें माइक्रोस्कोप के किनारे देते टेप के इन टुकड़ों को नाक शंकु देने जानवर को संज्ञाहरण की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एकघ यह जगह में जकड़ना.
  5. फाड़ो टेप के दो टुकड़े (आधा इंच चौड़ाई) है कि लंबाई में एक इंच के बारे में हैं. ये तितली माउस और खुर्दबीन स्लाइड के लिए जगह में ट्यूमर का पर्दाफाश किया पीबीएस पहुंचाने सुई रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

9. इमेजिंग के लिए वंक्षण स्तन ग्रंथि उजागर

  1. 21% और वाहक गैस के रूप में शेष नाइट्रोजन ऑक्सीजन (के बारे में 1.0 एल / मिनट में प्रवाह की दर) के साथ 4% isoflurane का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में पशु anesthetize. यह 2-4 मिनट लेना चाहिए.
  2. शल्य चिकित्सा मंच के लिए माउस स्थानांतरण एक बार यह गहरी और धीरे से साँस ले रहा है, उदर को सामना करना पड़ रहा सतह के साथ. शल्य चिकित्सा मंच संज्ञाहरण लाइन खोलें और फिर संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष लाइन बंद करने के लिए, इस क्रम में संज्ञाहरण प्रणाली में बहुत अधिक दबाव से बचने के. Isoflurane के 4% से 2.5% से इस समय एकाग्रता में कमी.
  3. पेडल पलटा वापसी की जाँच करने के लिए पुष्टि करते हैं कि जानवर पर्याप्त anesthetized एक लुटेरा चुटकी प्रदर्शन द्वारा शल्य प्रक्रिया के लिए. पशु पर्याप्त रूप से anesthetized है अगर यह (जैसे चिकोटी या इसकी पूंछ कर्ल) लुटेरा चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता. यदि पशु लुटेरा चुटकी प्रतिक्रिया नहीं करता, isoflurane के एकाग्रता बढ़ाने.
  4. प्रयोगशाला टेप के साथ शल्य चिकित्सा मंच (साढ़े "टेप इस के लिए सबसे अच्छा काम करता है) के लिए माउस के अंगों को सुरक्षित.
  5. (वैकल्पिक) एक बार पशु शल्य मंच के लिए सुरक्षित है, बाल उदर एक इलेक्ट्रॉनिक शेवर का उपयोग सतह से हटाया जा सकता है. यदि रासायनिक बालों को हटाने की पसंद है, इस सर्जरी से पहले 24-48 घंटा प्रदर्शन किया जाना चाहिए. सर्जरी से पहले बालों को हटाने इमेजिंग साइट के प्रदूषण को रोकने में मदद करता है, के रूप में आवारा बाल मजबूत और तीव्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकते हैं.
  6. 70% isopropanol पोंछे और Betadine के साथ जानवर के उदर सतह कीटाणुरहित.
  7. बाँझ कैंची और संदंश (दाँत के साथ) की पहली जोड़ी का उपयोग करते हुए, एक चमड़े के नीचे उदर midline चीराकि ~ 3 मिमी मूत्रमार्ग ऊपर से जिफाएडा प्रक्रिया चलाता है. ख्याल रखना puncturing से बचने या peritoneum के माध्यम से कटौती.
  8. बाँझ कैंची और संदंश के 2 जोड़ी का उपयोग (दाँतेदार), धीरे त्वचा अलग, peritoneal गुहा से वंक्षण स्तन ग्रंथि के साथ संलग्न है.
  9. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड ले लो और यह त्वचा प्रालंब के खिलाफ पिछले चरण में उत्पन्न स्थिति. स्थिति इस तरह से है कि ट्यूमर का थोक फ्लैट बैठने के एक बार माउस मंच पर रखा गया है, जाएगा और यह हिंद अंग की गतिशीलता के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है में स्लाइड.
  10. एक बार खुर्दबीन स्लाइड ठीक से तैनात किया गया है, superglue (जैसे, Krazy गोंद) का उपयोग कर त्वचा की बाहरी सतह स्लाइड देते हैं.

10. स्टेज पर माउस पोजिशनिंग

  1. शल्य चिकित्सा मंच के लिए जानवर के अंग प्रयोगशाला टेप निकालें.
  2. मंच खुर्दबीन संज्ञाहरण लाइन खोलें और anesthe बंदSIA इस क्रम में शल्य चिकित्सा मंच के लिए लाइन.
  3. जल्दी मंच खुर्दबीन पशु हस्तांतरण.
  4. एक बार जानवर स्थिति, स्थानांतरित कर दिया है और सुरक्षित संज्ञाहरण लाइन और नाक शंकु जैसे प्रयोगशाला टेप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि माउस anesthetized रहता है और एक आरामदायक स्थिति में है.
  5. ट्यूमर बेनकाब इतना है कि यह शीर्ष पर और एक कवर कांच से ढके खुर्दबीन मंच में इमेजिंग बंदरगाहों के केंद्र में तैनात है.
  6. Eyepieces का उपयोग करना, सत्यापित करें कि ट्यूमर सही ढंग से तैनात है और धीरे खुर्दबीन स्लाइड नीचे टेप. स्लाइड शिथिल सुरक्षित किया जाना चाहिए ताकि रक्त प्रवाह के ऊतकों को बाधित नहीं है. नीचे खुर्दबीन स्लाइड टेप इमेजिंग पशु साँस लेने के द्वारा शुरू की कलाकृतियों को कम करने में मदद करता है.
  7. पंख जलसेक एक एक मिलीलीटर सिरिंज युक्त बाँझ 1x पीबीएस या खारा (वैकल्पिक) PI के रूप में एक डाई युक्त # 5 के तहत तैयार करने के लिए संलग्न सेट के साथ निबाह intraperitoneal लाइन डालें. इंज100 μl जब आईपी के साथ पशु ect. लाइन में डाला जाता है. इमेजिंग सत्र के अंत तक इस समय बिंदु से, खारा के 50 μl के साथ 1 घंटे के अंतराल (या पीआई के साथ खारा की 25 μl हर 30 मिनट) पर पशु इंजेक्षन.
  8. पशु के महत्वपूर्ण संकेत पर नजर रखने के लिए, एक oximeter जांच देते हैं (उदाहरण के लिए स्टार लाइफ साइंसेज इंक द्वारा MouseOx प्रणाली) 19.
  9. कवर हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक गर्म कंबल के साथ माउस.

11. छवियों का अधिग्रहण

खुले स्रोत सॉफ्टवेयर μManager (घाटी लैब, UCSF) समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कच्चे डेटा Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane) में संकलित किया गया है, और स्वतंत्र पर्यवेक्षकों द्वारा मैन्युअल रन किया जा सकता है, या या तो Imaris या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे Volocity [PerkinElmer] या ImageJ [NIH]) में विश्लेषण किया.

12 इच्छामृत्यु.

छवि (1-4 सत्र के अंत में0 घंटा, प्रक्रिया के प्रकार पर निर्भर करता है) का विश्लेषण, पशु euthanized है.

  1. isofluorane की एकाग्रता 4% की वृद्धि हुई है.
  2. पशु 30 सेकंड तक मनाया जाता है, के बाद यह श्वास seizes और फिर मंच से हटा दिया.
  3. सरवाइकल अव्यवस्था के लिए सुनिश्चित करें कि जानवर euthanized किया गया है करने के लिए किया जाता है.

13. प्रतिनिधि परिणाम

इस पद्धति का उपयोग करके intravital इमेजिंग ट्यूमर परिस्त्राव, और दवा के वितरण के लिए दवा वितरण सहित विभिन्न प्रक्रियाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है एक बार यह ट्यूमर, सेल चिकित्सीय उपचार के बाद मौत, और सेल 5 मौत जवाब में ट्यूमर stroma बातचीत तक पहुँचता है. ट्यूमर और ट्यूमर ऊतकों में परिस्त्राव के बाद इसके वितरण के लिए एक दवा के आगमन का पालन, पशु इंजेक्ट किया जाता है जबकि छवियों का अधिग्रहण किया जा रहा है. हालांकि चर्चा के कई वर्गोंemotherapeutics कमजोर फ्लोरोसेंट (जैसे डॉक्सोरूबिसिन के रूप में) कर रहे हैं, कई नहीं. Fluorescently संयुग्मित dextrans दवा वितरण और ऊतकों में प्रसार के लिए किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है चित्रा 2 और 1 मूवी. (FITC) fluorescein आइसोथियोसाइनेट संयुग्मित 2 एमडी (Invitrogen, 1 1xPBS मिलीग्राम / एमएल) dextran iv इंजेक्शन के आगमन दिखा. माउस ACTB ECFP, एक MMTV PyMT के एक ट्यूमर में.

ट्यूमर में दवा के आगमन के बाद, और ऊतकों के माध्यम से परिस्त्राव प्रसार दोनों intravascular एक दवा और दवा 5 वितरण की एक आधा जीवन निर्धारित imaged किया जा सकता है. 2 मूवी iv इंजेक्शन extravasation और Alexa Fluor-647 संयुग्मित 10 केडी dextran (Invitrogen, 1 x पीबीएस में 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर) के वितरण से पता चलता है. c-एफएमएस EGFP, ACTB - ECFP इमेजिंग के दौरान माउस, एक C3 (1) टैग में. Imaris (Bitplane) में समय चूक फिल्मों के संकलन के बाद, intravascular आधा जीवन और दवा वितरण की मात्रा निर्धारित है. Intravascular आधा जीवन उपायप्रत्येक समय बिंदु पर ट्यूमर रक्त वाहिकाओं में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना है और समय के खिलाफ साजिश रची. दवा वितरण कुल ट्यूमर क्षेत्र है कि दवा के लिए सकारात्मक है प्रति एक प्रतिशत क्षेत्र के रूप में मात्रा निर्धारित है.

ट्यूमर के लिए दवा वितरण की कैनेटीक्स पर नज़र रखने के अलावा, यह अक्सर कैसे ट्यूमर उपचार के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. के रूप में विरोधी कैंसर उपचार के लिए कोशिका मृत्यु को उत्पन्न होने की उम्मीद कर रहे हैं, propidium आयोडाइड (पीआई) धुंधला हो जाना या संरचनात्मक परमाणु परिवर्तन दवा प्रेरित सेल 5 मृत्यु के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है चित्रा 3. एक MMTV में साइटोटोक्सिक chemotherapeutic डॉक्सोरूबिसिन ट्यूमर प्रतिक्रिया से पता चलता है माउस ग - एफएमएस EGFP, ACTB - ECFP; PyMT. ट्रिपल MMTV PyMT ट्रांसजेनिक; ACTB ECFP, पशु ग एफएमएस EGFP, ECFP लेबल स्तन कैंसर की कोशिकाओं (नीला), और EGFP लेबल माइलॉयड कोशिकाओं (हरा). इस सत्र के दौरान imaged पशु डॉक्सोरूबिसिन 18 घंटा पहले प्रशासित था इमेजिंग शुरू हुआ और PI आईपी टी भर दिया गया थावह इमेजिंग सत्र के रूप में ऊपर वर्णित है. कैंसर की कोशिकाओं (लेबलिंग ACTB - ECFP) के रूप में नीले दिखाई देते हैं, और मृत या मर कोशिकाओं लाल (पीआई धुंधला हो जाना) के रूप में दिखाई देते हैं. समय श्रृंखला यहाँ प्रस्तुत समय पर डॉक्सोरूबिसिन निर्भर कोशिका मृत्यु का प्रेरण से पता चलता है. ट्यूमर में कोशिका मृत्यु का प्रेरण यों, विश्लेषण के एक ही प्रकार के दवा वितरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जहां मात्रात्मक उत्पादन कुल ट्यूमर क्षेत्र है कि PI के लिए सकारात्मक है प्रति प्रतिशत क्षेत्र है.

उच्च वृद्धि पर इमेजिंग कोशिका मृत्यु के प्रकार के बारे में जानकारी है कि कैंसर की कोशिकाओं को 5 से गुजरना प्रदान कर सकते हैं. 3 मूवी डॉक्सोरूबिसिन साथ प्रणालीगत थेरेपी के जवाब में परमाणु apoptotic कोशिका मृत्यु का विशिष्ट परिवर्तन ट्रैक एक इमेजिंग प्रयोग के परिणाम से पता चलता है. नाभिक कल्पना, इस सत्र के दौरान imaged जानवर के बजाय ग एफएमएस EGFP संवाददाता रिपोर्टर ACTB H2B-EGFP बंदरगाहों तो, कैंसर कोशिकाओं के नाभिक हरे रंग में चिह्नित कर रहे हैं. यह MMTV PyMT, ACTB ECFP, पशु ACTB H2B-EGFP adm थाinistered डॉक्सोरूबिसिन (8/1 किलो मिलीग्राम x पीबीएस) आईपी 24 घंटा पहले फिल्म के शुरू और 1 x पीबीएस के प्रति घंटा PI (Invitrogen, 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान 1:15 पतला) युक्त इंजेक्शन प्राप्त. कैंसर कोशिकाओं के नाभिक में संरचनात्मक परिवर्तन एक apoptotic कोशिकाओं है कि परिगलन (PI पॉजिटिव कोशिकाओं है कि परमाणु morphology में बहुत कम परिवर्तन प्रदर्शित) आया है अगले सेल में मनाया जा सकता है. Apoptotic कोशिकाओं के नाभिक अंततः PI धुंधला हो जाना के तेज (नहीं दिखाया गया है) के कारण लाल हो जाता है. परिगलित और apoptotic घटनाओं की संख्या प्रत्येक समय PI धनात्मकता और परमाणु आकारिकी पर आधारित बिंदु के लिए मैन्युअल मात्रा निर्धारित है.

कीमोथेरेपी प्रेरित कैंसर कोशिका मृत्यु अक्सर 2,4,5 ट्यूमर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिक्रियाशील भर्ती में परिणाम चित्रा 4 डॉक्सोरूबिसिन साथ तीव्र इलाज के लिए इस stromal प्रतिक्रिया का एक उदाहरण दिखाता है. MMTV PyMT, ACTB ECFP; c-एफएमएस EGFP पशु यहाँ imaged (8/1 x पीबीएस में किलो मिलीग्राम) आईपी डॉक्सोरूबिसिन प्रशासित आईपी प्राप्त करने के लिए. कोशिका मृत्यु की कल्पना करने के लिए प्रयोग की अवधि के लिए. बार संकेत दिया डॉक्सोरूबिसिन उपचार के बाद घंटे की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं, और 100 सुक्ष्ममापी पैमाने बार का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रयोग में, माइलॉयड कोशिकाओं कोशिका मृत्यु के क्षेत्रों में घुसपैठ के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत दिया. डॉक्सोरूबिसिन प्रशासन, दवा वितरण और कीमोथेरेपी के ट्यूमर प्रतिक्रिया का निर्धारण किया जाता है, जहां मात्रात्मक उत्पादन EGFP के लिए सकारात्मक है कुल ट्यूमर क्षेत्र है कि प्रति प्रतिशत क्षेत्र है के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषण के एक ही प्रकार के बाद ट्यूमर में माइलॉयड सेल घुसपैठ यों.

रसायन चिकित्सा करने के लिए समग्र stromal प्रतिक्रिया visualizing के अलावा, विशेष stromal प्रतिक्रियाओं को भी देखे जा 5 कर सकते हैं. 4 मूवी एक पड़ोसी सेल द्वारा परिगलित सेल सामग्री के phagocytosis से पता चलता है. लाल परमाणु सामग्री किया जा रहा है एक larg के साथ एक सेल के द्वारा किया जाता है देखा जा सकता हैई बरकरार हरी नाभिक, जो मैक्रोफेज की विशिष्ट है. MMTV PyMT, ACTB ECFP; ACTB - H2B-EGFP इस सत्र के दौरान imaged जानवर डॉक्सोरूबिसिन (8/1 x पीबीएस में किलो मिलीग्राम) आईपी दिलाई. 24 घंटा फिल्म के शुरू करने के लिए पहले. पशु 1 x पीबीएस युक्त PI (Invitrogen, 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान 1:15 पतला) के प्रति घंटा इंजेक्शन प्राप्त किया. नाभिक (लेबलिंग-EGFP ACTB) हरी के रूप में दिखाई देते हैं, लेकिन लाल बारी के रूप में सेल परिगलन से गुजरना.

चित्रा 1
चित्रा 1. विभिन्न ट्यूमर ट्रांसजेनिक और इंजेक्शन लेबल का उपयोग घटकों के नमूना लेबलिंग यह एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक MMTV PyMT है. ACTB ECFP, ग एफएमएस EGFP पशु जो कैंसर की कोशिकाओं ECFP और माइलॉयड कोशिकाओं की अभिव्यक्ति के माध्यम से नीले रंग में चिह्नित कर रहे हैं में चिह्नित कर रहे हैं EGFP की एक मज्जाभ विशेष प्रमोटर से अभिव्यक्ति के माध्यम से हरी. पशु propidium आयोडाइड के साथ इंजेक्ट किया गया था (पीआई, लाल, ~ 1x पीबीएस में 0.07 मिलीग्राम / मिलीलीटर) के दौरानइमेजिंग सत्र कोशिका मृत्यु कल्पना करने के लिए. PI डीएनए लेबल लेकिन केवल मृत या मर कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली को पार. पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 2
चित्रा 2. ट्यूमर में नशीली दवाओं के extravasation वितरण और इस दोहरे ट्रांसजेनिक MMTV - PyMT पशु ACTB ECFP जो कैंसर की कोशिकाओं को नीले रंग में ECFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से चिह्नित कर रहे हैं FITC संयुग्मित 2 एमडी dextran (हरा) के साथ इमेजिंग सत्र के दौरान इंजेक्ट किया गया था कैसे कल्पना दवाओं चतुर्थ इंजेक्शन (नीला) के बाद ट्यूमर तक पहुँचने. इमेजिंग के बाद शुरू किया गया था समय संकेत दिया है. पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा 3. कैंसर सेल प्रणालीगत थेरेपी के लिए एक प्रतिक्रिया. MMTV PyMT, ACTB ECFP; c-एफएमएस EGFP पशु chemotherapeutic के साथ इलाजइमेजिंग पहले दवा डॉक्सोरूबिसिन, और पीआई के साथ इंजेक्शन (लाल, ~ 1x पीबीएस में 0.07 मिलीग्राम / मिलीलीटर) कोशिका मृत्यु लेबल. इस छवि श्रृंखला समय पर पीआई धुंधला हो जाना (के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत), कोशिका मृत्यु निम्नलिखित डॉक्सोरूबिसिन उपचार की प्रेरण का प्रतिनिधित्व के संचय से पता चलता है. डॉक्सोरूबिसिन उपचार के बाद समय समय संकेत दिया है. छवियाँ एक z ढेर युक्त z-अक्ष में तीन छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों हैं. पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4
चित्रा 4. ; ACTB - ECFP माइलॉयड सेल में एक MMTV PyMT कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रिया ग - एफएमएस EGFP ट्रिपल ट्रांसजेनिक डॉक्सोरूबिसिन इमेजिंग 20 घंटा पहले प्रशासित माउस पशु प्रति घंटा आईपी प्राप्त किया. गड़बड़ी की इंजेक्शन (लाल, ~ 0.07 मिलीग्राम / मिलीलीटर 1x पीबीएस में) मृत कोशिकाओं लेबल. इस छवि श्रृंखला doxorubi के बाद समय पर EGFP सकारात्मक माइलॉयड कोशिकाओं (के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत) के संचय से पता चलता हैcin उपचार. इस प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4,5 chemotherapies के कई वर्गों के लिए चिकित्सकीय प्रतिक्रिया बाधित करने के लिए दिखाया गया है. डॉक्सोरूबिसिन उपचार के बाद समय समय संकेत दिया है. छवियाँ एक z ढेर युक्त z-अक्ष में तीन छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों हैं. पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी.

1 फिल्म. पशु ACTB ECFP जो कैंसर की कोशिकाओं को नीले रंग में ECFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से चिह्नित कर रहे हैं, एक ट्यूमर में दवा वितरण यह एक डबल ट्रांसजेनिक MMTV PyMT है. जानवर एक 2 एमडी FITC - संयुग्मित dextran (हरा) के साथ इमेजिंग सत्र के दौरान इंजेक्शन कल्पना कैसे दवाओं चतुर्थ इंजेक्शन के बाद ट्यूमर में पहुँच गया था. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

2 मूवी. ट्यूमर ऊतक में औषध घुसपैठ एक तीन ट्रांसजेनिक (1) C3-टैग, ACTB ECFP, ग एफएमएस EGFP पशु जिसमें कैंसर की कोशिकाओं को ला रहे हैं.ECFP और माइलॉयड EGFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से हरे रंग में लेबल कोशिकाओं की अभिव्यक्ति के माध्यम से नीले रंग में beled एक Alexa Fluor 647-संयुग्मित 10 केडी dextran (लाल) के साथ iv इंजेक्ट किया गया था. देखने के क्षेत्र dextran साथ इंजेक्शन के तुरंत बाद दिखाया गया है. dextran लेबल शुरू vasculature, ट्यूमर ऊतक में तेजी extravasates, और अंत में मैक्रोफेज द्वारा लिया जाता है. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी 3. ; ACTB - ECFP, कीमोथेरपी प्रेरित कोशिका मृत्यु के बाद परमाणु परिवर्तन इस ट्रिपल MMTV PyMT ट्रांसजेनिक H2B-EGFP जानवर की इमेजिंग डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन के साथ किया गया था पूर्व इमेजिंग. परमाणु आकारिकी, (हरा) के रूप में एक संलयन H2B EGFP प्रोटीन की अभिव्यक्ति से ट्रैक, कीमोथेरपी प्रेरित परमाणु संरचनात्मक apoptosis की विशिष्ट परिवर्तन के रूप में ऊपरी दाएँ कोने में सेल के लिए देखा के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. पशु receआधा प्रति घंटा आईपी ived. इमेजिंग सत्र की अवधि के लिए मर चुका है और कोशिकाओं को मरने के लेबल के लिए PI (लाल) के इंजेक्शन. समय संकेत दिया डॉक्सोरूबिसिन उपचार चौबीस घंटे के बाद का समय है. छवियाँ एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य लेंस (40x, 1.1 एनए, पानी लेंस) का उपयोग कर हासिल किया गया. स्केल बार = 15 सुक्ष्ममापी फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी 4. परमाणु परिवर्तन और कीमोथेरपी प्रेरित कोशिका मृत्यु के बाद मृत सेल सामग्री के तेज इमेजिंग इस ट्रिपल MMTV PyMT ट्रांसजेनिक; ACTB ECFP, पशु H2B-EGFP डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन के साथ किया गया था पूर्व इमेजिंग. परमाणु आकारिकी, (हरा) के रूप में एक संलयन H2B EGFP प्रोटीन की अभिव्यक्ति से ट्रैक, कीमोथेरपी प्रेरित परमाणु संरचनात्मक परिवर्तन के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. आधा प्रति घंटा जानवर आईपी प्राप्त किया. इमेजिंग सत्र की अवधि के लिए मर चुका है और कोशिकाओं को मरने के लेबल के लिए PI (लाल) के इंजेक्शन. छवियाँ हासिल किया गयाएक उच्च बढ़ाई उद्देश्य लेंस (40 x 1.1 NA, पानी लेंस) का उपयोग. PI और परमाणु और GFP संकेत के morphology हानि में परिवर्तन के साथ लेबलिंग करने से पहले प्रमुख संरचनात्मक परिवर्तन की कमी कोशिका मृत्यु परिगलन तरह से की सूचक है. मृत सामग्री किया जा रहा है एक सेल द्वारा एक बड़े नाभिक, जो मैक्रोफेज की विशिष्ट है के साथ लिया देखा जाता है. समय संकेत दिया डॉक्सोरूबिसिन उपचार चौबीस घंटे के बाद का समय है. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

vivo में प्रणालीगत उपचार के लिए ट्यूमर की प्रतिक्रिया में नाटकीय रूप से इन विट्रो में कैंसर कोशिकाओं के उन लोगों के लिए अलग अलग हो सकता है, के रूप में microenvironment दोनों तीव्र प्रतिक्रिया और 5 पलटा को प्रभावित कर सकते हैं. Vivo chemoresistance रास्ते में सबसे बड़ी explicating करने के लिए बाधाओं में से एक कैंसर की कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच बातचीत की जटिलता है. विशेष रूप से, क्योंकि ठोस ट्यूमर कैंसर और stromal कोशिकाओं, कोशिका मृत्यु कि विरोधी कैंसर के इलाज के दौरान होता है के रूप में एक घटक के perturbations, के बीच एक संतुलन विकसित किया है, ऊतक संगठन पर नाटकीय प्रभाव में परिणाम कर सकते हैं.

intravital इमेजिंग तकनीक यहाँ प्रदान की विरोधी कैंसर दवाओं के साथ इलाज के दौरान रहते हैं, anesthetized चूहों के ट्यूमर के भीतर कैंसर कोशिका stroma बातचीत के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. हम कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, जो एक रिश्तेदार सीमित प्रवेश गहराई (17 देखने के (उदाहरण के लिए एक लेबल या कोशिका मृत्यु का जनसंख्या प्रेरण की घुसपैठ के कारण), सेल गतिशीलता, injectables का वितरण (संवहनी रिसाव को ट्रैक करने के लिए करने के लिए उदाहरण के लिए), और सह शामिल पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है फ्लोरोसेंट 5,12,17,20 संकेतों का स्थानीयकरण.

हम नियमित रूप से 6 घंटे से अधिक के लिए छवि चूहों और 18 से अधिक घंटे के लिए भी प्रदर्शन इमेजिंग. यह इन लंबे समय अवधि के लिए संज्ञाहरण के तहत लगातार चूहों को बनाए रखने की आवश्यकता है. उचित संज्ञाहरण के साथ, हमारे पशुओं की 90% से अधिक 6 घंटे जीवित है, और 80% के बारे में 18 घंटे से अधिक जीवित रहते हैं. कैसे प्रदर्शन करने के लिए लंबी अवधि के संज्ञाहरण विवरण 19 पहले प्रकाशित किया गया है. हमारे अनुभव में, पांच कारक महत्वपूर्ण हैं: हाइपोथर्मिया से परहेज है, निर्जलीकरण से परहेज, शारीरिक रक्त में ऑक्सीजन संतृप्ति स्तर को बनाए रखने, यूisoflurane के लिए humidified वाहक गैस गाते हैं, और संज्ञाहरण के निम्नतम स्तर है जिस पर वे दर्द के लक्षण नहीं दिखा पशुओं को रखने के. शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए, हम एक गर्म कंबल के तहत चूहों को रखने के लिए (38 ° C). निर्जलीकरण से बचने के लिए, हम पूरे इमेजिंग प्रक्रिया में खारा आईपी की छोटी मात्रा इंजेक्षन. शारीरिक रक्त में ऑक्सीजन संतृप्ति स्तर को बनाए रखने के लिए, हम वाहक गैस (बल्कि आमतौर पर इस्तेमाल किया तुलना में 100%) में 21% ऑक्सीजन के साथ शुरू करते हैं. एक प्रयोग में घंटे - यह हमें एक माउस अगर लिए साँस ऑक्सीजन का स्तर बढ़ाने के लिए सक्षम बनाता है रक्त में ऑक्सीजन संतृप्ति में एक कमी को दर्शाता है. हमारे अनुभव में, ऐसे समय (जैसे 30-40%) में साँस ऑक्सीजन के स्तर में वृद्धि लगभग हमेशा अतिरिक्त इमेजिंग के घंटे के लिए अनुमति देता है पशु स्थिर होगा. संज्ञाहरण के इष्टतम स्तर सबसे 1-1.5% isoflurane और 60-65/min और 400-450/min की पल्स दर की सांस दरों में परिणाम के साथ प्राप्त चूहों के लिए है. हमारे इमेजिंग प्रयोगों में, हम मुख्य रूप से ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग(MMTV - PyMT और C3 [1] - टैग) जिसमें ट्यूमर multifocal हैं, कई एक्स, वाई पदों पर एक एकल इमेजिंग सत्र के दौरान समानांतर में ट्यूमर प्रगति के विभिन्न चरणों में कई घावों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. इस मंच पर निर्भर चिकित्सकीय प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के उद्देश्य से किए गए प्रयोगों के लिए सम्मान के साथ माउस माउस भिन्नता के बारे में चिंताओं को कम हो जाती है, और इमेजिंग के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम कर देता है.

मॉडल MMTV PyMT (और अन्य सहज कैंसर मॉडल) प्रगतिशील histopathological चरणों कि intravital इमेजिंग के दौरान पहचाना जा सकता है के माध्यम से जाना हालांकि ट्यूमर घावों कि intravital इमेजिंग के दौरान किया जा सकता है का रोग मचान से अलग है, और कम विस्तृत है, की तुलना में histological वर्गों 5,17. इसके विपरीत, प्रत्यारोपण मॉडल देर चरण ट्यूमर सबसे अच्छा प्रतिबिंबित करते हैं, के रूप में कैंसर की कोशिकाओं को आमतौर पर उन्नत ट्यूमर से अलग कर रहे हैं. इस तरह के मॉडल इस प्रकार अधिक ट्यूमर stroma का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी हैंदेर चरण ट्यूमर के विभिन्न चरणों के बीच इन संबंधों में मतभेद से बातचीत.

हम कैसे छवि परमाणु संरचनात्मक परिवर्तन कि सेल थेरेपी से प्रेरित मौत के बाद होने के उदाहरण दिखाते हैं. विरोधी कैंसर उपचार के अभाव में, बजाय इस लेबल रणनीति में सीटू छवि कोशिका विभाजन के लिए इस्तेमाल किया जा, elucidating, उदाहरण के लिए, कैसे सेल प्रसार और निद्रा microenvironment प्रभावित है. भविष्य में, mitochondrial घटकों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग apoptotic कोशिका मृत्यु के दौरान होने छवि mitochondrial परिवर्तन संभव बना सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम भी छवि सेल प्रतिरक्षा कैंसर उपचार के बाद सेल बातचीत करने के लिए कैसे, लेकिन अन्य microenvironmental घटक भी कल्पना और imaged किया जा सकता है के उदाहरण दिखाया गया है. मौजूदा stromal घटकों के लिए ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों fibroblasts के लिए उन लोगों में शामिल हैं (जैसे., 17 FSP1-EGFP, 21 αSMA - आरएफपी, COL1A1 ईजी21 एफ पी) या vasculature की कोशिकाओं (Tie2 GFP जैसे 22, 23 VEGF-GFP).

Intravital इमेजिंग दृश्य वास्तविक समय के लिए बातचीत और प्रक्रियाओं है कि vivo निम्नलिखित कीमोथेरपी प्रशासन में होने की अनुमति देता है. प्रौद्योगिकी वर्तमान में उपलब्ध के साथ, हम समझ कैसे माइलॉयड कोशिकाओं चिकित्सकीय प्रतिक्रिया को प्रभावित करने में प्रमुख प्रगति की है, तथापि, क्योंकि ट्यूमर microenvironment इतनी जटिल है, प्रमुख प्रगति अभी भी करने के लिए पर्यावरण की मध्यस्थता दवा प्रतिरोध अंतर्निहित प्रक्रियाओं में mechanistically तल्लीन करना शुरू की जरूरत है. सबसे महत्वपूर्ण अभी भी अपेक्षित प्रगति के एक विशेष सेल आबादी के लिए बेहतर मार्करों की पहचान है. बेहतर मार्करों के महत्व को अच्छी तरह से दो सबसे प्रमुख स्तन ट्यूमर microenvironment, fibroblasts और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के stromal सेल घटकों के साथ सचित्र है. α चिकनी पेशी actin (αSMA) अक्सर की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता हैfibroblasts, लेकिन प्रोटीन भी संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और myoepithelial कोशिकाओं 24 द्वारा व्यक्त की है. इस प्रकार, हालांकि αSMA GFP संवाददाता चूहों मौजूद हैं, विशेष सेल प्रकार का निर्धारण एक intravital इमेजिंग प्रयोग के दौरान निम्नलिखित चुनौती दे रहा है. इसी तरह, EGFP के रूप में एक ही फ्लोरोसेंट मार्कर प्रमोटर ग एफएमएस के तहत व्यक्त अक्सर प्रतिरक्षा कोशिकाओं 12,17 के कई subpopulations की पहचान करेगा. इस प्रकार, हालांकि एक आदर्श के लिए एक एकल मार्कर का उपयोग करने के लिए एक विशेष सेल प्रकार की पहचान करना चाहते हैं अंतर्निहित जीव विज्ञान की जटिलता इस दृष्टिकोण का उपयोग करने में एक बड़ी चुनौती बन गया है.

इस समस्या का आंशिक समाधान करने के लिए इंजेक्शन लेबल का उपयोग करने के लिए आगे ही फ्लोरोसेंट संवाददाता व्यक्त कक्षों की subpopulations अंतर है. उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट dextrans मैक्रोफेज द्वारा लिया जाता है और बृहतभक्षककोशिका subpopulations है कि ग एफएमएस EGFP और Fsp1-EGFP ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों में चिह्नित कर रहे हैं लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 17 पत्रकार ने लेबल कोशिकाओं की आबादी GR1 पॉजिटिव जैसे) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

ट्यूमर प्रतिक्रिया कैलिपर माप है जो कैसे या क्यों ट्यूमर प्रशासित, चिकित्सीय, या histological श्रृंखला अलग अलग समय बिंदुओं कि बड़े साथियों के जानवरों की आवश्यकता पर काटा ऊतकों से प्राप्त करने के लिए जवाब के बारे में थोड़ा यंत्रवत जानकारी प्रदान करते हैं द्वारा उत्पन्न घटता के विपरीत, हमारी तकनीक प्रत्यक्ष, quantifiable जानकारी प्रदान करता है कोशिका मृत्यु की गतिशीलता पर और छोटे साथियों में कैंसर की कोशिकाओं के साथ stromal कोशिकाओं की बातचीत पर. इस प्रकार, यहाँ की सूचना प्रक्रिया का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह वास्तविक समय में एक अक्षुण्ण ट्यूमर microenvironment के संदर्भ में दवा प्रतिक्रियाओं पर गतिशील जानकारी प्रदान करता है. इस तरह की सूचना के अंतर्निहित प्रक्रियाओं है कि चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं 5 ड्राइव में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं </> समर्थन.

Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा है. सभी पशु प्रयोगों IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ अनुसार में आयोजित की गई.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए जे Cappellani और जे Qiu धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (CA141451 U01), स्टार कैंसर कंसोर्टियम, इलाज के लिए सुसान जी Komen, लांग आईलैंड 2 दिन स्तन कैंसर, स्तन कैंसर के खिलाफ Manhasset महिला मुझे गठबंधन लड़ो वॉक, और एक से निधियों द्वारा समर्थित किया गया के लिए अमेरिका ESNESN, Congressionally निर्देशित स्तन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम से के पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप भी वाटसन बायोलॉजिकल साइंसेज के स्कूल से लेस्ली सी. त्वरित और विलियम Randolph Hearst फाउंडेशन फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है. HAA नॉर्वे के अनुसंधान परिषद (160698/V40 और +१५१८८२), और दक्षिण क्षेत्रीय स्वास्थ्य अधिकारियों (2,007,060) से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
MMTV-PyMT mice Jackson Laboratory 2374
C3(1)-Tag mice Jackson Laboratory 13591
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 3773
ACTB-H2B-EGFP mice Jackson Laboratory 5418
1 x PBS Made in-house
2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated Invitrogen D-7137 Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS
10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated Invitrogen D-22914 Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS
Doxorubicin hydrochloride Sigma-Aldrich 44583 Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS
Isothesia (Isoflurane) Butler Animal Health Supply 029450 250 ml
Propidium iodide Invitrogen P3566 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS
Nitrogen
Oxygen
Equipment
18G x 1½" regular bevel needle BD 305196
μManager Vale Lab, UCSF www.micro-manager.org Open-source software
Alcohol swab BD 326895 70% isopropyl alcohol swabs
Anesthesia system Molecular Imaging Products, Co.
Cover glass Corning 2940-245 No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes
Curity gauze sponges (sterile) Kendall 6939
Glass microscope slides Corning 2948-75x25 Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Heated blanket Gaymar Industries
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec
Imaris Bitplane www.bitplane.com
Krazy Glue Elmer’s Products KG484
Laboratory tape ( ½")
Laboratory tape (1")
Lid to a Styrofoam shipping cooler This will be used as the surgical platform
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Microscope Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation Custom fabricated, with two circular imaging ports
MouseOx oximeter, software, and sensors STARR Life Sciences www.starrlifesciences.com
Nalgene Super Versi-Dry lab soakers Thermo Scientific 74218-00 Cut into fourths for lining surgical platform
Nebulizer Salter Labs 8901 Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues
Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) BD 309659
Surflo winged infusion set Terumo SV-23BLK 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing
Betadine Spray Purdue Pharma BASP3H

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References

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Nakasone, E. S., Askautrud, H. A.,… More

Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (73), e50088, doi:10.3791/50088 (2013).

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