Summary
我们描述了一种方法，成像响应于抗肿瘤治疗的
Abstract
肿瘤微环境中起着举足轻重的作用，在肿瘤的发生，发展，转移和抗癌疗法的反应。三维共培养系统经常被用来阐明肿瘤 - 基质的相互作用，包括它们的作用，药物的反应。然而，许多完整的微环境中发生在体内的相互作用不能被完全复制在这些体外设置。因此，直接可视化这些进程在实时了解肿瘤反应疗法和识别肿瘤细胞之间的相互作用和基质，可以影响这些反应已成为一个重要的工具。在这里，我们提供了一种方法，使用旋转盘的活，麻醉小鼠的共聚焦显微镜直接观察药物分布，癌症细胞的反应和在给药后的全身性治疗乳腺癌模型中的肿瘤 - 基质相互作用的变化。我们为labeli描述程序ng的不同肿瘤组件，用于观察治疗反应治疗的动物，和用于暴露长达40小时的用于成像的肿瘤组织的外科手术。此协议从所获得的结果的时间推移的电影，在其中可以使用图像分析软件评价药物浸润，肿瘤细胞死亡和基质细胞迁移等过程。
Introduction
实体肿瘤包括两大隔间：癌细胞和基质成分（蜂窝和非蜂窝）协助维持一个适当的环境为肿瘤的生长1。这些间质的的的选民中发挥着重要的的角色，，在的开发，“的进展，和”转移中的许多类型的癌症，其中包括那些的的乳房2-5的的的中 。的的间质的环境也地影响对治疗的反应2,4,5。因此，确定癌细胞如何响应常规和新疗法的原封未动的微环境的上下文内，重要的是我们进一步认识癌症生物学和改善目前的治疗策略。此外的是，对于理解的生物学的肿瘤复发的，定义了如何癌症的细胞-间质的相互作用的会，随着投药的治疗而改变是至关重要的的的的。
器官型的的合作培养系统已被有用的，用于研究肿瘤 - 基质的的相互作用的
研究到在体内的抗肿瘤治疗的响应的主要手段，已被通过来自处理过的动物或患者，的的派生的组织的的肿瘤的大小和的组织学评估的测量的。 ，则即使，在显微镜和荧光记者，中的的进步不会明显缩小超过的过去的的两个几十年来已经启用了的的间-和细胞内的的流程的可视化，在高分辨率下在活的的，麻醉后的的的动物（的活体成像）8 JOURNAL。这些的活体显微镜技术已被证明到是尤其是宝贵的的用于在空间上上和时间上地解剖所述在体内动力学的肿瘤-基质的蜂窝式的和子-蜂窝式的的的决议的的相互作用在8,9的 。
由的活体成像的揭开了的被的生产工艺进行过包括的的抗-肿瘤的T细胞的的细胞毒作用10,11，T细胞的系和髓系的的服务小区12的之间的相互作用，的动态变化的“在胶原蛋白的的组成和”组织以下食疗的治疗13日 ，巨噬细胞-而引发相关癌症的细胞的的血管内的和转移“的变化14日 ，和血管通透性的15。
有是三个主要的的的的为的活体成像的要求。这些措施包括的组织中的适当的准备和曝光为成像，的的的组织的组件的的兴趣时在荧光灯的标签中，和一个已配对的显微术-摄影相机S变体系能够采集图像16。的用于，以解决这些的要求的的最常见的的战略包括：1）异位准备工作（ 例如 ，。，的耳朵或眼睛简直轨道的的接种的），永久的的成像的窗户，的或形象化的的准备工作（ 例如 ，。，背鳍的皮肤瓣）; 2）转基因荧光记者，的，并荧光血管注射剂到组织成分贴上标签;，和3）与的光电倍增管或押记偶联型的移动设备（CCD）相机，分别为9配对的多光子或共聚焦显微镜系统。 ，我们使用一个外科手术准备的的的皮肤的皮瓣模型，以暴露的腹股沟的的乳腺腺为表达的编码荧光记者，的转殖基因的的的麻醉动物的，的成像技术在。的画像顷得到的过了一段中的12小时到第40小时，使用一个增强型CCD（ICCD）的摄像头与一个四-激光纺丝磁盘共聚焦显微镜观察系统17配对。在以这种方式中的影像学已经允许我们，以研究这样的的的的进程，，作为在的体内的药物分布，阶段-依赖的的的CH中emotherapeutic的的反应，的化疗-诱导的细胞死亡，系和髓系的细胞的行为5开始的类型。
我们提供了一个的的活体的成像的癌症细胞的反应，的，以的的抗-癌的疗法和在乳房癌症的小鼠模型中的中的肿瘤 - 基质的的相互作用施治，的的协议，用于。此协议可以用于来跟踪的两种癌症细胞和间质组件的行为和死亡的与内容广泛且具有的各种各样的转基因的和可注射的的的荧光标记在转基因和器官移植两种模型中为期限最长可达到第40小时在一个单一的的成像届会议的。
Protocol
所述的所有程序，必须按照指引及法规的脊椎动物，包括由当地机构动物管理和使用委员会的事先批准使用。
1。生成小鼠乳腺肿瘤成像（转基因或原位）
- 利用遗传工程小鼠模型的乳腺肿瘤的成像（ 如小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列[MMTV]多瘤病毒中T抗原[PyMT]或大鼠C3（1）启动子驱动的SV40大T抗原（TAG）[C3（ 1）标签]型号）或（同系，同种异体或异种原位移植模型）。
- 出版商癌细胞越过遗传工程与转基因记者线（ 例如 ACTB-ECFP）或使用体外操纵的原代肿瘤细胞或细胞系（ 如转导）后跟移植模型。对于一个样本协议原位肝移植，SEE 18。
2。肿瘤微环境或亚细胞成分的可视化组件
- 可视化肿瘤成分，利用转基因标签。杂交，基因工程肿瘤模型的转基因报告小鼠（ 如c-FMS-EGFP原子核髓系细胞或ACTB-H2B-EGFP），或使用这些小鼠接受移植，标记的组织。这使得响应于与细胞死亡有关的治疗或核的变化可视化的癌症细胞的基质细胞的相互作用，分别。
- 可视化使用注射剂的微环境。可以使用各种各样的剂（ 例如荧光标记的抗体或化学染料）标记的肿瘤的各种组件。根据不同的染料和响应一个感兴趣，跟踪的半衰期，可以给药的注射剂成像开始之前或摄像会话期间，无论是静脉内（ⅳ）或intraperitoneally（腹腔， 图1）。
3。显微镜及成像软件
- 显微镜。可以使用各种各样的显微镜系统和软件，用于成像的活小鼠。最常用的系统是共焦或者多光子显微镜。我们使用了微透镜的旋转盘共聚焦显微镜（Solamere技术，盐湖城，UT）与ICCD相机（XR-MEGA-10EX S-30，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，斯坦福大学光电）。
- 成像软件。我们使用的开放的源软件μManager的（谷实验室，加州大学，旧金山加州大学旧金山分校）。
- 图像分析。我们使用Imaris（位面），Volocity（PerkinElmer）中，ImageJ的图像分析（国立的健康[美国国立卫生研究院）。
4。 （预）处理动物的成像
- 腹股沟乳腺肿瘤是最佳的成像使用我们的协议时，最长的直径尺寸大约为8毫米或更小的游标卡尺测量键相。
- 对于成像的小分子抑制剂，治疗性抗体或化疗药物治疗的动物，开始治疗之前或期间，成像所需的实验。例如，成像药物外渗和分布的需要给药后成像已经被启动（电影1和2），而最好是捕获由化疗药物阿霉素的细胞死亡的诱导的成像开始成像24小时或购买药物治疗后（电影3和4）。
5。维护的水化和血液渗透压的动物在成像过程中的盐水制备
- 平局约1毫升的1x PBS成1ml注射器。碘化丙啶（PI，Invitrogen公司，1毫克/毫升，经稀释的1:15）可以被添加到该溶液中，将定期给药（ 的ip。）的摄像会话期间。这将允许死亡或濒临死亡的细胞，具有渗透细胞膜的核成像。 PI有一个很短的HAL的f-生活在脉管系统中，因此必须被重新管理的整个成像会话。
- 附上一个飞过的输液器（23号，¾英寸的针，12英寸的管子）此注射器推，直到退出生理盐水溶液一滴的溶液通过管针尖结束时的油管。
- 取下注射器从输液器，它与适当的盐溶液和笔芯。
- 重新连接的注射器，输液器，小心不要产生气泡成线。
6。制备异氟醚麻醉系统
- 加水雾化器和其拧紧到位。这将交付给动物的气体加湿，防止肺部的刺激和延长生存的动物在长期的麻醉。
- 填写异氟醚罐顶行。注意：异氟醚是一种强效麻醉剂，也可以影响的研究。适当的真空系统应e的地方，以确保多余的气体从该地区撤走。
- 打开氧气罐和氮气罐和调节流量。应该是在大约1.0升/分钟的氮气，而应在约0.2升/分钟（〜21％）的氧。
- 打开真空（内部）。应为约1.2升/分钟的真空。
- 确认，麻醉线感应室是打开的，被关闭的行手术区域和显微镜。
- 确认附着到麻醉系统的乳胶呼吸袋膨胀。如果不充气袋，取代它。
- 检查每个鼻锥的显微镜载物台和手术平台提供麻醉的橡胶膜片。如果开始薄的橡胶，取代它。
7。外科手术工具的准备及手术平台
- 打开一个热珠灭菌器，让它达到> 200℃。
- 在肥皂和水洗净的外科手术工具（1对钳子[[优选与齿和剪刀的切割通过皮肤的动物，1对钳子[优选锯齿]和剪刀的进一步曝光的肿瘤）。
- 消毒为至少30秒，使用热珠灭菌器（可替代地，外科手术工具可以预先高压灭菌）的外科手术工具。
- 我们的外科手术工具冷静下来，同时确保消毒工具，以避免污染。
- 收集一个的聚苯乙烯泡沫塑料运输冷却器盖。这将是您的手术平台。
- 放置一块实验室裂化反应室的顶部的聚苯乙烯泡沫塑料盖（足以覆盖）。
- 加盖一个鼻锥与一个线麻醉系统的实验室透雨实验室胶带1“磁带的工作最好在这里。插入一个18ĝX1½”针通过磁带到的发泡胶盖鼻锥两侧，以保持鼻锥体固定到位。
- 抛开优碘，消毒纱布，70％的异丙醇擦拭，显微镜幻灯片，KRAZY胶，和4个实验室带（½“宽度）。
8。制备显微镜
- 打开显微镜，摄像头，并在计算机上运行的显微镜。
- 打开电热毯。
- 如果是要使用倒置显微镜，应当设计为具有成像端口对应的位置的腹股沟乳腺量身定制的阶段插入。以及用肥皂和水，干燥清洁的阶段插入。使用实验室磁带（½“效果最好），以确保在摄像口的盖玻璃（＃1.5厚度）和清洁整个表面用70％的异丙醇。用无菌纱布覆盖的阶段，以防止污染。放置的阶段的阶段插入并允许它在空气中干燥。
- 撕裂实验室胶带4〜6片（1“宽），约6英寸长，将它们附加到显微镜的侧。这些件的磁带将用于定位的鼻锥提供麻醉动物ð固定到位。
- 撕两件带（½英寸宽），大约一英寸的长度。这些将被用来提供PBS鼠标和使用的显微镜载片上的肿瘤暴露在保持蝴蝶针。
9。公开的腹股沟乳腺成像
- 使用21％的氧气和氮气平衡气体作为载气（在约1.0升/分钟的流率）4％异氟烷麻醉动物的感应室。这应该需要2-4分钟。
- 一次深呼吸，慢慢地，腹面朝上，将鼠标的手术平台。打开麻醉行的手术平台，然后关闭线的感应室的麻醉，为了避免过高的压力在麻醉系统。此时从4％至2.5％的异氟醚的浓度降低。
- 检查踏板撤退反射，以确认动物有足够的麻醉thetized执行脚垫捏的外科手术。动物是充分麻醉，如果它不反应（ 如抽搐或卷曲它的尾巴）的足垫压紧。如果动物没有反应过来的脚垫捏，异氟醚的浓度增加。
- 四肢固定的鼠标实验室磁带（½“磁带最适合本）的手术平台。
- （可选）一旦被固定到该动物的手术平台，头发可以除去从使用电子剃须刀腹面。如果化学脱毛是首选，应进行手术前24-48小时。手术前去除毛发有助于的成象部位，以防止污染，杂散毛发可以强烈的和急性免疫应答的诱导。
- 70％的异丙醇擦拭巾和优碘消毒腹面的动物。
- 使用第一个对无菌剪刀和镊子（带齿），使皮下腹正中切口〜3毫米以上的尿道从运行至剑突过程。小心避免通过腹膜打孔或切割。
- 使用无菌剪刀和镊子的第二对（锯齿），轻轻地分离的皮肤，与腹股沟乳腺附着，从腹膜腔。
- 玻璃显微镜幻灯片，并将其定位对皮瓣在上一步中产生的。以这样的方式滑动，肿瘤的大部分将坐在平坦一旦鼠标被放置在舞台上，并与后肢的流动性，它不会干扰的位置。
- 一旦已正确地定位在显微镜载玻片，将滑动的皮肤使用强力胶（ 例如 ，疯狂之胶）的外表面。
10。将鼠标定位在舞台上
- 删除的实验室胶带固定在四肢的动物的手术平台。
- 打开显微镜载物台和关闭的麻醉医师麻醉线新航线到手术的平台，在该顺序。
- 动物的显微镜载物台，可以快速传输。
- 一旦动物已被转移，位置和保护的麻醉线和鼻锥正常（使用例如实验室的磁带），以确保鼠标停留麻醉，是在一个舒适的位置。
- 显露肿瘤，以便它被定位在顶部和在中心盖玻璃覆盖的摄像在显微镜载物台上的端口之一。
- 使用的目镜，检查，肿瘤的正确位置，轻轻带下来的显微镜幻灯片。幻灯片固定松散，所以不妨碍组织的血流量。大坪显微镜幻灯片帮助，以尽量减少动物的呼吸所介绍的成像伪影。
- 插入翅输液集连接到含有无菌的1×PBS或生理盐水（任选含有的染料如PI）＃5下制备一个1-ml注射器的留置腹腔符合。注射剂用100微升时，IP等动物的。插入线。来自这个时间点，直到摄像会话结束，用50μl的生理盐水注入动物在1小时的时间间隔（或25微升生理盐水与PI每30分钟）。
- 要监控动物的生命体征，血氧饱和度探头连接（， 例如 MouseOx系统由Starr生命科学公司）19。
- 量的鼠标用加热毯，以防止体温过低。
11。采集的图像
开源的的软件μManager（谷实验室，加州大学旧金山分校）用于获取时间的推移图像。 Imaris软件（位面）的原始数据编制的，并可以拿下手动由独立的观察员，或在任一的Imaris或其他图像分析软件进行分析（ 如 Volocity [ImageJ的珀金埃尔默]或[美国国立卫生研究院）。
12，“安乐死”
的图像会话结束时（1-40小时，取决于类型的过程分析），动物安乐死。
- 异氟烷的浓度提高到4％。
- 动物观察，直到30秒后，抓住呼吸，然后从舞台移除。
- 颈脱位法进行，以确保该动物已安乐死。
13。代表性的成果
使用这种方法允许活体成像的直接可视化的各种处理，包括药物递送的药物的肿瘤，外渗和分布的，一旦它到达肿瘤，治疗处理后的细胞死亡，并响应于细胞死亡5肿瘤-基质的相互作用。观察动物注射的药物外渗到肿瘤组织的肿瘤，其分布的到来，当图像被收购。虽然几个班的通道emotherapeutics弱荧光（如阿霉素），许多人都没有。荧光共轭葡聚糖可以用作药物传递和扩散到组织的替代标记物， 图2和电影1显示的荧光素异硫氰酸酯（FITC） -共轭2 MD葡聚糖（Invitrogen公司，1毫克/毫升1xPBS） 静脉注射的到来。成的一个MMTV-PyMT; ACTB ECFP鼠标的肿瘤。
外渗和扩散通过组织的药物进入肿瘤的到来之后，可以进行成像，以确定血管内的半衰期的药物和药物分布5。电影2显示静脉注射外渗和分布的Alexa Fluor-647-共轭10 kD的葡聚糖（Invitrogen公司，在1×PBS中的1毫克/毫升）。成C3（1）-标签ACTB-ECFP;-fms的-EGFP鼠标成像期间。编译完成后的时间推移电影在Imaris（位面），血管内的半衰期和分发药物进行量化。要测量血管内的半衰期计算，在肿瘤血管在每个时间点的平均荧光强度，对时间作图。药物分布的百分比量化的面积计算总的肿瘤区域，是积极的药物。
除了跟踪动力学的药物输送到肿瘤，它常常是重要的是要确定肿瘤的治疗。作为抗癌疗法预期，诱导细胞死亡，碘化丙啶（PI）染色或结构的核的变化可以被用作一个标记药物诱导的细胞死亡的5， 图3示出一个MMTV阿霉素的细胞毒性的化疗的肿瘤反应-PyMT ACTB-ECFP，C-FMS-EGFP鼠标。在这三重转基因MMTV-PyMT; ACTB-ECFP C-FMS-EGFP动物，ECFP标签的乳腺癌细胞（蓝色），和EGFP标签髓样细胞（绿色）。在本届会议期间拍摄到的动物给予阿霉素18小时前成像的开始，PI被送到知识产权吨他成像会话如上所述。癌细胞（ACTB ECFP标签）显示为蓝色，死亡或濒临死亡的细胞显示为红色（PI染色）。这里提出的时间序列示出了随着时间的推移的阿霉素依赖性细胞死亡的诱导。为了量化在肿瘤中的细胞死亡诱导，相同类型的分析用于确定分发药物的使用，其中的定量输出是每总的肿瘤区域，是正的，对PI的面积百分比。
在高放大倍率成像可以提供有关类型的细胞死亡，癌症细胞进行5。电影3示出了一个成像实验，在响应于与阿霉素全身治疗跟踪细胞核的变化，典型的细胞凋亡的结果。为了可视化晶核，动物在此会话期间成像窝藏ACTB-H2B-EGFP记者取代的c-fms的EGFP报告，所以肿瘤细胞的细胞核中被标记为绿色。这MMTV-PyMT; ACTB ECFP ACTB-H2B-EGFP的动物是ADMinistered多柔比星（8毫克/公斤在1×PBS）中的ip 24小时前开始的电影，并获得含有PI（Invitrogen公司，1毫克/毫升溶液稀释1点十五分）每小时注射1×PBS。肿瘤细胞的细胞核中的结构变化，可以观察到旁边经历坏死（PI阳性细胞核形态显示最小的变化）的细胞中的细胞凋亡。凋亡细胞的核团最终由于PI染色的吸收（图中未示出）变成红色。手工坏死和凋亡事件的数量进行量化，每个时间点的基础上PI阳性和核形态。
化疗诱导的肿瘤细胞死亡经常导致成肿瘤2,4,5招募的免疫细胞的反应性。 图4示出了一个例子，在此基质的响应与阿霉素治疗急性。这里的MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;-fms的-EGFP的动物成像给予多柔比星（8毫克/公斤1×PBS中） 的ip 的ip。可视化细胞死亡的实验的持续时间。时间代表阿霉素治疗后的数个小时，比例尺为100μm。在这个实验中，髓样细胞渗入细胞死亡的领域，如白色箭头所示。为了量化成肿瘤，用于确定药物的分布和肿瘤对化疗的反应，其中的量化输出的百分比面积每总EGFP阳性的肿瘤区域，用于相同类型的分析阿霉素给药后骨髓细胞浸润。
除了 可视化的整体基质对化疗的反应，专门的基质的反应也可以被可视化5。电影4示出了相邻小区的吞噬坏死细胞材料。可以看出，通过细胞摄取与LARG加上红色的核材料Ë完整的绿核，这是典型的巨噬细胞。的MMTV-PyMT; ACTB ECFP ACTB-H2B-EGFP动物成像在本届会议期间给予阿霉素（8毫克/公斤，1×PBS）的IP。 24小时的电影的开始之前。该动物获得每小时注射1×PBS含PI（Invitrogen公司，1毫克/毫升溶液稀释1时十五分）。核（ACTB-EGFP标记）显示为绿色，，但变红，细胞发生坏死。
图1。样本标记使用转基因和可注射的标签不同的肿瘤成分，这是一个三转基因MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ECFP和髓样细胞的表达在癌细胞中被标记为蓝色通过C-fms的-EGFP的动物中被标记为通过髓系特异性启动子表达EGFP绿色。该动物用碘化丙啶（PI，红色，在1x PBS〜0.07毫克/毫升）注射期间成像会议，可视化细胞死亡。 PI标签的DNA，但只有穿过细胞膜死亡或濒临死亡的细胞。比例尺= 100微米。
图2。在肿瘤药物外渗和分布。这双基因MMTV-PyMT;的ACTB - ECFP动物中，癌细胞表达ECFP有蓝色标签，通过注射FITC标记的葡聚糖（绿色）2 MD的成像会议期间可视化如何药物达到肿瘤静脉注射后（蓝色）。成像后开始显示时间。比例尺= 100微米。
图3。癌症细胞的反应，以全身治疗。 治疗和化疗的MMTV-PyMT; ACTB ECFP，C-FMS-EGFP动物药物阿霉素在成像之前，并注入与PI（红色，在1x PBS〜0.07毫克/毫升）标记的细胞死亡。此图片系列显示随着时间的推移，PI染色（白箭头），诱导细胞死亡后，阿霉素治疗的积累。时间显示是阿霉素治疗后的时间。画像是一个z-堆栈包含三个图像中的z轴的最大强度的预测。比例尺= 100微米。
图4。髓系细胞对化疗的MMTV-PyMT的ACTB-ECFP C-FMS-EGFP的三重转基因小鼠管理多柔比星20小时前，成像的动物，每小时的IP。注射PI（红色，〜0.07毫克/毫升在1x PBS）来标记死细胞。此图像序列显示后随着时间的推移doxorubi EGFP阳性的骨髓细胞（如白色箭头指示的）的积累CIN治疗。这种反应性的免疫反应已被证明阻碍治疗响应于几类化疗4,5。时间显示是阿霉素治疗后的时间。画像是一个z-堆栈包含三个图像中的z轴的最大强度的预测。比例尺= 100微米。
动画1。成肿瘤的药物输送，这是一个双转基因MMTV-PyMT; ACTB-ECFP动物癌细胞中被标记为蓝色通过表达ECFP。动物被注射了2 MD FITC标记的葡聚糖（绿色）的成像会议期间可视化静脉注射后药物到达肿瘤。比例尺= 100微米。 点击这里观看电影 。
电影2。三重转基因C3（1）标签; ACTB ECFP C-FMS-EGFP动物癌细胞是La 药物渗透到肿瘤组织。贝莱德ECFP和标记为绿色的髓样细胞，通过EGFP表达的表达通过在蓝色的静脉注射用的Alexa Fluor 647 -共轭10 kD的葡聚糖（红色）。的视场示出注射后立即用葡聚糖。葡聚糖最初标记的血管，迅速extravasates进入肿瘤组织，并最终采取了由巨噬细胞。比例尺= 100微米。 点击这里观看电影 。
电影3。成像核后化疗诱导的细胞死亡。这三重转基因MMTV-PyMT; ACTB-ECFP H2B-EGFP动物注射阿霉素成像。核形态（绿色），H2B-EGFP融合蛋白的表达，通过跟踪，可以直接可视化的化疗引起的核结构的变化，典型的细胞凋亡中的单元格右上角。动物RECEived IP半小时。注射PI（红色）的成像会话的持续时间，死亡和垂死的细胞标记。时间显示是阿霉素治疗后24小时的时间。画像购入使用的高倍率的物镜（40倍，NA 1.1，水透镜）。比例尺= 15微米。 点击这里观看电影 。
电影4。成像材料化疗诱导的细胞死亡后的死细胞的细胞核的变化及吸收。这三重转基因MMTV-PyMT; ACTB-ECFP H2B-EGFP动物注射阿霉素成像。核形态（绿色），H2B-EGFP融合蛋白的表达，通过跟踪，可以直接可视化的化疗引起的核结构的变化。动物接受半小时的IP。注射PI（红色）的成像会话的持续时间，死亡和垂死的细胞标记。图像被收购使用的高倍率物镜（40×，NA 1.1，水透镜）。重大的结构变化与PI和核的形态变化和损失的GFP信号标记之前的缺乏是指示坏死样细胞死亡。死的材料被认为是采取了由一个细胞的细胞核大，这是典型的巨噬细胞。时间显示是阿霉素治疗后24小时的时间。比例尺为10μm。 点击这里观看电影 。
Discussion
肿瘤在体内的全身治疗的反应，可以显着不同的，因为在体外癌细胞的微环境影响的急性反应和复发5。诉说在体内的耐药途径的最大障碍之一是肿瘤细胞和微环境之间的相互作用的复杂性。特别是，因为已经开发固体肿瘤癌症和基质细胞，扰动的一种成分，如抗肿瘤治疗的过程中发生的细胞死亡之间的平衡，可以导致对组织的组织的戏剧性的效果。
活体成像技术提供了允许直接在现场，麻醉小鼠的肿瘤的肿瘤细胞 - 基质相互作用的可视化与抗癌药物在治疗过程中。我们使用旋转盘共聚焦显微镜，它有一个相对有限的穿透深度（见17 例如，由于标记人口或诱导细胞死亡的渗透），细胞运动，注射剂的分布（ 例如，跟踪血管渗漏），和合作本地化的荧光信号5,12,17,20。
我们经常在图像小鼠超过6小时，超过18小时，并进行成像。这需要保持不断在麻醉状态下的小鼠，这些长的时间周期。通过适当的麻醉，超过90％的动物生存6个小时，约80％存活超过18小时。有关如何进行长期的麻醉先前已公布的19。在我们的经验中，有五个因素是至关重要的：避免低温，避免脱水，保持的生理血液中氧饱和度水平，U唱加湿，异氟醚的载气，并保持动物在麻醉的最低水平，在它们不显示疼痛的迹象。为了保持体温，我们养老鼠在加热毯（38°C）。为了避免脱水，在整个成像过程中，我们注入少量的生理盐水IP。保持生理血液的氧饱和度水平，我们开始与载气中的（而不是常用的100％）的21％的氧气。这使我们吸入的氧含量增加，如果鼠标 - 小时为一个实验 - 显示血氧饱和度下降。根据我们的经验，增加吸入氧气水平的时间（如30-40％）几乎总是稳定的动物，让几个小时的额外的影像。麻醉的最佳水平，为大多数小鼠与1-1.5％异氟烷在60-65/min和脉冲率400-450/min的呼吸率和结果取得。在我们的成像实验中，我们主要使用转基因小鼠模型（MMTV-PyMT和C3 [1]-标签），其中肿瘤是多焦点，允许在不同的阶段的肿瘤进展的单个成像会话期间在多个的x，y位置的平行的多个病灶成像。这减小关切鼠标鼠标相对于实验旨在识别阶段依赖性的治疗反应的变化，并减少所需的成像的动物的数目。
通过渐进的病理组织学阶段，可以在活体成像识别的MMTV-PyMT模型的（和其他自发肿瘤模型）去，虽然可以做的活体成像过程中的肿瘤性病变的病理分期是不同的，不太详细，比组织切片5,17。相比之下，移植的模型往往反映晚期肿瘤最好的，因为晚期肿瘤的癌细胞通常是孤立的。因此，这种模型更适合于研究肿瘤间质晚期肿瘤的相互作用在不同阶段之间的相互作用大于分歧。
我们的例子形象核结构所发生的变化后诱导细胞死亡的治疗。在抗癌治疗的情况下，该标记策略，而不是可能可用于在原位的图像细胞分裂，阐明，例如，细胞的增殖和休眠如何的影响的微环境。在未来，线粒体成分的荧光标记可能有可能图像线粒体细胞凋亡的细胞死亡过程中所发生的变化。
在这个协议中，我们还如何图像治疗后癌细胞的免疫细胞间的相互作用，但其他微环境的组成部分，也可以是可视化和成像的例子。现有的转基因记者基质成分包括那些为成纤维细胞（ 如 ，FSP1-EGFP 17，21αSMA-RFP，COL1A1-EGFP 21）或细胞的脉管（ 如 Tie2的-GFP 22; VEGF-GFP的23）。
活体成像允许发生在体内以下化疗给药的相互作用和过程的实时可视化。目前的技术，我们已经取得了重大的进展，在了解髓细胞如何影响治疗的反应;然而，由于肿瘤微环境是如此复杂，重大的进步仍然需要开始钻研机械地环境介导的耐药性的过程。仍然需要的最重要的进步之一是更好的标记物的识别，特定细胞群。更好的标记物的重要性，是很好的说明有两个最突出的乳房肿瘤微环境，成纤维细胞和免疫细胞的基质细胞组件。 α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）是经常被用来识别成纤维细胞，但该蛋白也表达的血管平滑肌细胞和肌上皮细胞24。因此，尽管存在αSMA-GFP记者小鼠，在活体成像实验确定特定的细胞类型，以下是具有挑战性的。同样，一个单一的荧光标记物，如EGFP表达的c-FMS子下，往往会识别多种免疫细胞亚群的12,17。因此，虽然理想情况下，人会喜欢使用一个单独的标记来识别特定的细胞类型使用这种方法的基本生物学的复杂性构成了重大挑战。
对这个问题的部分解决方案之一是使用注射型标签，以进一步区别细胞亚群的表达相同的荧光报道。例如，荧光葡聚糖由巨噬细胞，并可以用来标记所标记的c-fms的-EGFP和FSP1-EGFP转基因报告小鼠的巨噬细胞的亚群
不同的游标卡尺测量，它提供的小机械信息如何或为何肿瘤给药治疗，或组织学系列在不同的时间点，需要大样本的动物组织中收获来自肿瘤生成的响应曲线，我们的技术提供了直接的，可量化的信息上的动态的细胞死亡，并在小同伙的基质细胞与癌细胞上的相互作用。因此，这里报告的使用过程的优点是它提供了对药物的反应的上下文中，一个完整的肿瘤微环境中的实时的动态信息。这些信息可以到底层的进程，推动对治疗的反应导致了重要的见解</ SUP>。
Disclosures
作者有没有利益冲突的披露。按照IACUC批准的协议，所有的动物进行了实验。
Acknowledgments
我们感谢J. Cappellani和J.邱的技术支持。这项工作是支持的资金由美国国家癌症研究所（U01 CA141451），斯塔尔癌症协会，苏珊科曼为治愈，长岛第2天城抗击乳腺癌，曼哈塞特妇女的抗乳腺癌联盟ME，和从国会导演的乳腺癌研究计划的博士后奖学金，，美国ESNESN是收件人的Leslie C.快速和威廉·伦道夫·赫斯特基金会奖学金从沃森生物科学学院。 HAA得到了资金从研究理事会挪威（160698/V40 151882），和东南地区卫生局（2007060）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
