Summary
Мы описываем метод визуализации ответ на анти-лечения рака
Abstract
Микроокружение опухоли играет ключевую роль в опухолевой инициации, прогрессии, метастазы, и ответ на противораковое лечение. Трехмерная совместного культивирования системы часто используются для экспликации опухоли стромы взаимодействия, включая их роль в препарат ответы. Тем не менее, многие из взаимодействий, которые происходят в естественных условиях в неповрежденных микроокружения не могут быть полностью воспроизведены в этих параметров в лабораторных условиях. Таким образом, прямой визуализации этих процессов в режиме реального времени стала важным инструментом для понимания опухоли ответов на лечение и выявление взаимодействия между раковыми клетками и стромой, которые могут влиять на эти ответы. Здесь мы предлагаем метод использования вращающийся диск конфокальной микроскопии живых, анестезированных мышей непосредственно наблюдать распространение наркотиков, раковой клетке реакций и изменений в опухоли стромы взаимодействия после введения системной терапии в модели рака молочной железы. Мы описываем процедуры labeliнг различных компонентов опухоли, лечение животных для наблюдения терапевтической реакции, и хирургические процедуры для экспонирования опухолевых тканей для работы с изображениями до 40 часов. Результаты, полученные из этого протокола замедленной фильмы, в которых такие процессы, как наркотик инфильтрации, смерть раковых клеток и стромальных миграции клеток можно оценить с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
Introduction
Солидные опухоли состоят из двух основных отсеков: раковых клеток и стромальных компонентов (как клеточного, так и непористые), которые помогают в поддержании благоприятных условий для роста опухоли 1. Эти стромальные компоненты играют важную роль в развитии, прогрессии и метастазированию многих видов рака, в том числе молочной железы 2-5. Стромальных среды также влияет на терапевтический ответ 2,4,5. Таким образом, определение того, как раковые клетки реагируют на традиционные и новые методы лечения в рамках нетронутыми микросреда имеет важное значение для углубления нашего понимания биологии рака и улучшение текущих терапевтических стратегий. Кроме того, в определении того, как раковые клетки стромы-взаимодействий изменится после введения терапии имеет решающее значение для понимания биологии опухолевого рецидива.
Органотипической совместного культивирования системы были полезны для изучения опухоли стромы взаимодействия
Основным средством изучения ответов на противораковой терапии в естественных условиях прошли через измерения размеров опухоли и гистологического исследования тканей, полученных от животных, получавших или пациентов. Тем не менее, достижения в области микроскопии и флуоресцентной журналистам в течение последних двух десятилетий позволили визуализации меж-и внутриклеточных процессовс высоким разрешением в живых, анестезии животных (прижизненных изображений) 8. Эти технологии прижизненной микроскопии доказано, что особенно ценно для пространственного и временного рассекает в динамике естественных условиях опухолевой стромы-взаимодействий на клеточном и субклеточном разрешение 8,9.
Процессы, которые были распутать прижизненных изображений включают противоопухолевых Т-клеточной цитотоксичности 10,11, взаимодействие между Т-клеток и клеток миелоидной 12, динамика изменений в составе коллагена и организации после терапевтического лечения 13, макрофаг-зависимого рака и метастазов intravasation 14 и сосудистую проницаемость 15.
Существуют три основных требования к прижизненной визуализации. Они включают в себя соответствующую подготовку и экспозиции тканей для работы с изображениями, флуоресцентная маркировка тканевых компонентов интересов, и парные микроскопии-камера сystem способна получения изображений 16. Наиболее распространенные стратегии, используемые для удовлетворения этих требований относятся: 1) гетеротопической препараты (например, прививки ухо или глаз орбитальный), постоянный изображения окна, или экстериоризации препараты (например, спины лоскут кожи), 2) трансгенные флуоресцентные журналистам и.. флуоресцентные инъекций для обозначения тканей компонентов и 3) многофотонное или конфокальной микроскопии систем в паре с фотоумножителя или прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры, соответственно, 9. Мы используем хирургическим подготовленную модель кожный лоскут, чтобы разоблачить паховых молочных желез для работы с изображениями в анестезии животных, которые выражают трансгенов кодирующие флуоресцентные журналистам. Изображения получены в течение 12 до 40 часов с использованием усиленного CCD (ICCD) камеры в паре с четырех-лазер вращающийся диск конфокальной микроскопии системы 17. Изображения таким образом, позволило нам изучить такие процессы, как в естественных условиях распространение наркотиков, зависит от стадии СНemotherapeutic ответы, типа, вызванной химиотерапией гибель клеток, и поведение клеток миелоидного 5.
Мы предоставляем протокол о прижизненных изображений ответы раковых клеток к противораковой терапии и опухоли стромы-взаимодействий в мышиных моделях рака молочной железы. Этот протокол может быть использован для отслеживания поведения и смерти обоих раковых клеток и стромальных компонентов с широким спектром трансгенных и инъекционные флуоресцентные метки в обоих трансгенных и трансплантации модели для периода до 40 часов за один сеанс визуализации.
Protocol
Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами для использования позвоночных животных, в том числе предварительного согласования с местными Институциональные уходу и использованию животных комитета.
1. Создание мышей опухоли молочной железы для работы с изображениями (трансгенных или Ортотопическая)
- Создание опухолей молочной железы для визуализации с использованием генетически модифицированных моделей мыши (например, опухоли молочной железы мышей вирусом длинный концевой повтор [MMTV] полиомы средний Т-антиген [PyMT] или крысы C3 (1) промоутер приводом большого Т-антигена (Tag) из SV40 [C3 ( 1)-Tag] модели) или модели ортотопической трансплантации (сингенных, аллогенных или ксеногенных).
- Этикетка раковых клеток путем скрещивания генетически модифицированных моделей с трансгенных линий репортер (например, ACTB-ECFP) или использовать бывшие манипуляции естественных первичных раковых клеток или клеточных линий (например, трансдукции) с последующей трансплантацией. Для образца протокола для ортотопической трансплантации, се 18.
2. Визуализация компонентов микроокружение опухоли или суб-клеточные компоненты
- Визуализация опухолей с использованием трансгенных компонентов этикетки. Crossbreed генетически модифицированных опухолевых моделей с трансгенными мышами репортер (например, C-FMS-EGFP для миелоидных клеток или ACTB-H2B-EGFP для ядер) или использовать такую мышь в качестве реципиентов пересаженных, обозначенные тканей. Это дает возможность визуализации раковых клеток-стромальных взаимодействий клеток в ответ на терапию или ядерных изменений, связанных с гибелью клеток, соответственно.
- Визуализация микроокружения использованием инъекций. Широкий спектр агентов (например, флуоресцентно меченых антител или химических красителей) может быть использован для обозначения различных компонентов опухоли. В зависимости от периода полураспада красителей и ответ один заинтересованы в отслеживании, инъекции можно вводить до начала или во время визуализации изображения сессии либо внутривенно (IV). Или Intraperitoneally (ф., Рисунок 1).
3. Микроскопы и обработки изображений
- Микроскоп. Различные микроскопом системы и программное обеспечение могут быть использованы для визуализации живых мышей. Наиболее часто используемые системы конфокальной и многофотонной микроскопов. Мы используем микро-линзами вращающийся диск конфокальной микроскопии (Solamere технологий, Солт-Лейк-Сити, Юта) с камерой ICCD (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Пало-Альто, Калифорния).
- Изображений программное обеспечение. Мы используем открытые μManager исходным кодом (Vale Lab, Университет Калифорнии, Сан-Франциско [UCSF]).
- Анализ изображения. Мы используем Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), и ImageJ (Национальный институт здоровья [NIH]) для анализа изображений.
4. (Pre)-лечение животных для работы с изображениями
- Паховая опухолей молочной железы являются оптимальными для визуализации с использованием нашего протокола, когда самый большой диаметр измеряется приблизительно 8 мм или менее суппорта измеренияВЫРАЖЕНИЕ.
- Для изображения животных, получавших небольшие молекулы ингибитора, терапевтические антитела или химиотерапевтического препарата, начать лечение до или во время съемки, необходимое для эксперимента. Например, визуализация экстравазации и распространения наркотиков требует администрации после съемки была начата (фильмы 1 и 2), в то время как изображение клеточной гибели, индуцированной химиотерапевтического препарата доксорубицина лучше захвачен начиная изображения 24 часа в сутки или позже, после медикаментозного лечения (фильмы 3 и 4).
5. Подготовка Saline для поддержания гидратации и осмолярности крови животных во время съемки
- Нарисуйте примерно 1 мл 1x PBS в 1 мл шприца. Пропидия йодида (PI, Invitrogen, 1 мг / мл, разбавленный 1:15) могут быть добавлены к этому решению, которое будет периодически вводили (IP). Во время визуализации сессии. Это позволит визуализации ядер мертвые или умирающие клетки, которые имеют мембраны клетки. PI имеет очень короткий HalF-жизни в сосудистой системе и поэтому должны быть повторно вводить по всему изображений сессии.
- Прикрепить крылатых инфузионный набор (23 калибр, ¾ дюйма иглы, 12-дюймовый трубопровод) на этот шприц и нажмите раствора через трубки до капли солевого раствора выходит кончик иглы на конце трубки.
- Удалите шприц от вливания, и пополнить его с соответствующим физиологическим раствором.
- Соберите шприц для вливания, заботясь, чтобы не вводить пузырьков в линии.
6. Подготовка Isoflurane системы Анестезия
- Добавить воду в распылитель и закрепите ее на месте. Это будет увлажнять газами доставлен в животных, предотвращая раздражение легких и продлить выживаемость животных при длительной анестезии.
- Заполнить бак изофлурана в верхней строке. ВНИМАНИЕ: Isoflurane является мощным анестетиком, что также может влиять на исследователя. Соответствующие вакуумные системы должны бе место, чтобы убедиться, что избыток газы удаляются из области.
- Включите оба танка кислорода и азота, танков и отрегулировать поток. Азота должна быть на уровне около 1,0 л / мин, в то время как кислород должно быть около 0,2 л / мин (~ 21%).
- Включите (в доме) вакуума. Вакуума должно быть около 1,2 л / мин.
- Убедитесь, что анестезия линии индукции камеры открыта, и линии на операцию области и микроскоп закрыты.
- Убедитесь, что мешок латекс дыхание прикреплены к анестезии системе завышены. Если сумка не срабатывает, замените его.
- Проверьте резиновую диафрагму на каждом из носа конусы доставки анестезии на сцене микроскоп и хирургические платформы. Если резиновая начинают тонкий, замените его.
7. Подготовка хирургические инструменты и хирургической платформы
- Включите горячий шарик стерилизатор и пусть она достигает> 200 ° C.
- Вымойте хирургических инструментов мылом и водой(Одна пара щипцов [предпочтительно с зубами] и ножницы для резки через кожу животного, одна пара щипцов [предпочтительно зубчатые] и ножницы для дальнейшего воздействия на опухоль).
- Стерилизация хирургических инструментов, по крайней мере 30 секунд с использованием горячего шарика стерилизатор (альтернативно, хирургические инструменты можно автоклавировать заранее).
- Пусть хирургические инструменты остыть, а убедившись, чтобы избежать загрязнения стерилизованные инструменты.
- Соберите крышку, чтобы кулера доставка пенопласта. Это будет ваш хирургической платформы.
- Поместите кусок лаборатории проливной дождь на верхней части крышки пенополистирола (достаточно, чтобы покрыть его).
- Прикрепите носовой конус с линии на анестезию системы в лаборатории проливной дождь с лентой лаборатории (1 "Лента работает лучше всего здесь). Вставьте 18 G x1 ½" иглу через ленту в крышку пенополистирола по обе стороны носовой конус держать носового конуса закреплены на месте.
- Отложите бетадин, стерильная марля, два 70% изопропиловый спирт салфетки, микроскопслайдов, Krazy Glue, 4 куска ленты лаборатории (½ "ширина).
8. Подготовка микроскопа
- Включите микроскопа, камеры, и компьютер под управлением микроскопа.
- Включите отопление одеяло.
- Если инвертированный микроскоп будет использоваться, заказные этапе вставки должны быть разработаны с изображениями порты соответствующего расположения паховых молочных желез. Очистите сцену вставить с мылом и водой и сухим. Используйте лаборатории ленты (½ "работает лучше), чтобы закрепить крышку стекла (# 1.5 толщины) по визуализации портов и очистить всю поверхность с 70% изопропанола. Крышка сцене с стерильной марли для защиты от загрязнения. Поместите этапе вставки в стадии и дайте ему высохнуть на воздухе.
- Оторвите от 4 до 6 штук лаборатории ленты (1 "ширина), примерно 6 дюймов в длину и прикрепить их к стороне микроскопа. Эти куски ленты будут использоваться для размещения носового конуса доставки анестезию для животныхг закрепить ее на месте.
- Tear еще два куска ленты (½ дюйма шириной), которые составляют около дюйма в длину. Они будут использоваться держать бабочку иглой доставки PBS для мыши и стекло микроскопа используется для предоставления опухоль на месте.
9. Разоблачение паховой молочной железы для работы с изображениями
- Anesthetize животных в индукционной камере с использованием 4% изофлурана с 21% кислорода и баланс азота (расход около 1,0 л / мин) в качестве газа-носителя. Это займет 2-4 мин.
- Передача мыши к хирургическому платформы, когда он будет дышать глубоко и медленно, с вентральной поверхности вверх. Откройте анестезии линии к хирургическому платформу, а затем закрыть анестезии линии индукции камеры, в таком порядке, чтобы избежать слишком высокое давление в анестезию системы. Снижение концентрации изофлурана с 4% до 2,5% в настоящее время.
- Проверьте педаль вывод рефлекс, чтобы подтвердить, что животное достаточно Anesthetized для хирургической процедуры, выполняя разбойник крайнем случае. Животное адекватно наркозом, если он не реагирует (например, подергивание или завить хвост) на подушечку лапы крайнем случае. Если животное не реагирует на подушечку лапы крайнем случае, увеличение концентрации изофлурана.
- Закрепить конечности мыши к хирургическому платформы с лентой лаборатории (½ "Лента работает лучше всего для этого).
- (Необязательно) После того как животное крепится к хирургическому платформе, волосы могут быть удалены из брюшной поверхности с помощью электронного прибора. Если удаление волос химическим предпочтительнее, это должно быть выполнено 24-48 часов до операции. Удаление волос до операции помогает предотвратить загрязнение изображений сайте, как беспризорные волосы могут вызвать сильный и острый иммунный ответ.
- Лечить вентральной поверхности животного с 70% изопропиловый спирт салфетки и бетадин.
- С помощью первой пары стерильные ножницы и пинцет (с зубьями), сделать подкожную вентральной срединной линии разреза, который работает от ~ 3 мм выше уретры мечевидного отростка. Будьте осторожны, чтобы избежать проколов или резке через брюшину.
- С помощью второй пары стерильные ножницы и щипцы (зубчатые), аккуратно отделите кожу, с паховыми молочной железы связаны, из брюшной полости.
- Возьмите предметное стекло микроскопа и поместите его против кожного лоскута созданных в предыдущем шаге. Поместите слайд таким образом, что основная часть опухоли будет сидеть плоские раз мышь находится на сцене, и это не мешает подвижности задних конечностей.
- Как только стекло микроскопа были в правильном положении, приложить слайда к внешней поверхности кожи с помощью суперклея (например,., Krazy Glue).
10. Позиционирование мыши в рабочей области
- Снимите защитную ленту лаборатории конечности животного к хирургическому платформы.
- Откройте анестезии линии столик микроскопа и закройте анестезиисии строки в хирургическом платформы, в этом порядке.
- Быстро передать животное столик микроскопа.
- После того, как животное было передано, положение и закрепить линию анестезии и носовой конус должным образом (с использованием, например ленту лаборатории), чтобы гарантировать, что мышь остается наркоза и находится в удобном положении.
- Предоставление доступа к опухоли, так что он расположен на вершине и в центре одного из покровного стекла покрытые изображениями порты в микроскоп.
- Используя окуляры, убедиться, что опухоль правильном положении, и осторожно ленты вниз стекло микроскопа. Презентация должна быть обеспечена так свободно приток крови к тканям ничто не мешает. Taping вниз стекло микроскопа помогает свести к минимуму артефакты изображения введен дыхания животного.
- Вставьте пребывающего внутрибрюшинного соответствии с крылатым вливания прикреплены к 1-мл шприц, содержащий стерильные 1x PBS или физиологического раствора (необязательно содержащие красителей, таких как PI), подготовленный под № 5. InjECT животное с 100 мкл, когда IP. Линия установлена. С этого момента времени до конца сессии изображений, вводят животным с 50 мкл физиологического раствора с интервалом в 1 ч (или 25 мкл физиологического раствора с PI каждые 30 минут).
- Для мониторинга жизненно важных функций животного, приложите зонд оксиметр (например, MouseOx системы Starr Life Sciences, Inc) 19.
- Крышка мыши с отоплением одеяло, чтобы предотвратить переохлаждение.
11. Приобретение изображения
С открытым исходным кодом μManager (Vale Lab, UCSF) используется для получения замедленной изображений. Исходных данных составляется в Imaris (Bitplane) программного обеспечения, и может быть набрано вручную с помощью независимых наблюдателей, или проанализированы в любой Imaris или другого программного обеспечения для анализа изображений (например, Volocity [PerkinElmer] или ImageJ [NIH]).
12. Эвтаназия
В конце изображение сессии (1-40 часов, в зависимости от типа анализируемого процесса), животное усыпляют.
- Концентрация isofluorane увеличивается до 4%.
- Животное наблюдалось до 30 сек после того, как захватывает дыхание и затем удаляется со сцены.
- Смещения шейных позвонков осуществляется для того, чтобы животные были умерщвлены.
13. Представитель Результаты
Прижизненные изображения с помощью этого метода позволяет прямой визуализации различных процессов, в том числе для доставки лекарств в опухоль, кровоизлияние и распространение наркотиков как только он достигает опухоли, гибель клеток после терапевтического лечения, а также опухоли стромы взаимодействия в ответ на гибель клеток 5. Для наблюдения за прибытием препарата на опухоль и ее распределение после экстравазации в опухолевой ткани, животное вводится в то время как изображения приобретаются. Несмотря на несколько классов чemotherapeutics слабо флуоресцентные (например, доксорубицин), многие не являются. Флуоресцентно сопряженных декстраны могут быть использованы в качестве суррогатных маркеров для доставки лекарств и диффузия в тканях. Рис. 2 и Movie 1 показано прибытие флуоресцеин-изотиоцианат (FITC)-сопряженными 2 MD декстрана (Invitrogen, 1 мг / мл 1xPBS) вводят IV. в опухоли MMTV-PyMT; ACTB-ECFP мыши.
После прибытия препарата в опухоль, кровоизлияние и диффузии через ткани может быть отображена определить как внутрисосудистое полураспада наркотиков и распространение 5. Фильм 2 показывает экстравазации и распределения Alexa Fluor-647-сопряженными 10 кДа декстрана (Invitrogen, 1 мг / мл в 1 х PBS) вводили IV. в C3 (1)-тегов; ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP мыши во время съемки. После составления покадровой фильмы в Imaris (Bitplane), внутрисосудистое распределение полураспада препарата и количественно. Для измерения внутрисосудистого полураспада, Средняя интенсивность флуоресценции в опухоль кровеносных сосудов в каждый момент времени рассчитывается и зависимости от времени. Распространение наркотиков количественно в процентах площади в общей площади опухоли, что является положительным для наркотиков.
В дополнение к отслеживанию кинетики доставки лекарств в опухоль, часто важно определить, как опухоли реагируют на терапию. В качестве противоракового лечения, как ожидается, вызывают гибель клеток, пропидия йодида (PI) окрашивание или структурных изменений, ядерной может быть использован в качестве маркера лекарственно-индуцированной гибели клеток 5. Рисунке 3 показана ответа опухоли на цитотоксической химиотерапии доксорубицином в MMTV -PyMT; ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP мыши. В этой тройной трансгенных MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP животных, ECFP этикетки клеток рака молочной железы (синий), и EGFP этикетки миелоидных клеток (зеленый). Животное отображаемого в ходе этой сессии вводили доксорубицин 18 часов до начала изображений и PI был доставлен ИС во всем тОн изображения сессии, как описано выше. Раковые клетки (ACTB-ECFP маркировки) отображаются в виде синих и мертвые или умирающие клетки выглядят как красные (PI окрашивание). Временные ряды, представленные здесь показывают индукции доксорубицин-зависимой гибели клеток с течением времени. Для количественной оценки индукции гибели клеток в опухоли, и тот же тип анализа, используемых для определения распространения наркотиков используются, где количественный выход процента площади в общей площади опухоли, что является положительным для PI.
Изображения при большом увеличении может предоставить информацию о типах гибели клеток, что раковые клетки претерпевают 5. Фильм 3 показаны результаты визуализации эксперимент, чтобы отслеживать ядерные изменения, характерные для апоптоза клеток в ответ на системной терапии с доксорубицином. Для визуализации ядер, животное отображаемого в ходе этой сессии таит в себе ACTB-H2B-EGFP репортер вместо C-FMS-EGFP репортер, так что ядра раковых клеток помечены зеленым цветом. Это MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP животное было адмinistered доксорубицин (8 мг / кг в 1 х PBS) IP 24 часов до начала фильма, и получил почасовую инъекций 1 х PBS, содержащим PI (Invitrogen, 1 мг / мл раствора разбавляют 1:15). Структурные изменения в ядрах раковых клеток можно наблюдать в апоптозе клетки рядом с клетками, которые прошли некроз (PI-позитивные клетки, которые показывают минимальные изменения в морфологии ядра). Ядра апоптоза клеток в конечном итоге становится красной из-за поглощения окрашиванием PI (не показано). Количество некротических и апоптоза количественно вручную для каждого момента времени на основе PI-положительных и ядерной морфологии.
Химиотерапии рака, вызванного гибелью клеток часто приводит к реактивной набор иммунных клеток в опухолях 2,4,5. Рисунок 4 показывает пример этого стромальных ответ на острый лечение доксорубицином. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP животных отображаемого здесь вводили доксорубицин (8 мг / кг в 1 х PBS) IP IP. в течение всего срока эксперимента для визуализации гибели клеток. Время, указанное представляют количество часов после доксорубицина лечения, а также шкалы составляет 100 мкм. В этом эксперименте миелоидных клеток проникают в области клеточной гибели, как указано белыми стрелками. Для количественной оценки миелоидной инфильтрации в опухоли после доксорубицина администрации, тот же тип анализа, используемых для определения распределения лекарственных средств и реакции опухоли к химиотерапии используется, где количественный выход процента площади в общей площади опухоли, что является положительным для EGFP.
В дополнение к визуализации общей стромальных ответ на химиотерапию, специализированные стромальных ответы также могут быть визуализированы 5. Фильм 4 показывает фагоцитоз некротический материал клетки соседние клетки. Красные ядерного материала можно увидеть время попадает в организм клетки с крупэлектронной нетронутым зеленым ядром, которое характерно для макрофагов. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP животных отображаемого в ходе этой сессии вводили доксорубицин (8 мг / кг в 1 х PBS) IP. 24 часа до начала фильма. Животное получало почасовой инъекций 1 х PBS, содержащим PI (Invitrogen, 1 мг / мл раствора разбавляют 1:15). Ядрами (ACTB-EGFP маркировки) выглядят как зеленые, но становятся красными, как клетки подвергаются некрозу.
Рисунок 1. Примеры маркировки различных опухолей с использованием трансгенных компонентов и инъекционные этикетках Это тройной трансгенных MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP животных, в которых раковые клетки помечены синим через выражение ECFP и миелоидной клетки помечены в зеленого через выражение EGFP от миелоидного-промотора. Животных вводили йодид пропидия (PI, красный, ~ 0,07 мг / мл в 1x PBS) в течениевизуализации сессии для визуализации гибели клеток. PI метки ДНК, но только пересекает клеточных мембран мертвые или умирающие клетки. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 2. Экстравазации наркотическими средствами и их распределение в опухоли этого дважды трансгенных MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP животных, в которых раковые клетки помечены синим через выражение ECFP вводили FITC-конъюгированные 2 MD декстрана (зеленый) во время визуализации сессии представить себе, как препараты достигают опухоли после внутривенного введения (синий). Время после съемки было начато указано. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 3. Рак клеточный ответ на системной терапии. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP животных обрабатывали химиотерапевтическимпрепарат доксорубицин до визуализации и вводят PI (красный, ~ 0,07 мг / мл в 1x PBS) для обозначения гибели клеток. Это изображение показывает серию накопления PI окрашивания в течение долгого времени (как указано белыми стрелками), представляющий индукции гибели клеток после лечения доксорубицином. Время указано время после доксорубицина лечения. Изображения максимальной интенсивности проекции Z-Stack, содержащий три изображения в Z-оси. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 4. Миелоидного клеточный ответ на химиотерапию в MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;. C-FMS-EGFP тройной трансгенных мышей вводили доксорубицин 20 часов до изображений животных получил почасовую IP. инъекций PI (красный, ~ 0,07 мг / мл в 1x PBS) для обозначения мертвых клеток. Это изображение показывает серию накопления EGFP-положительных клеток миелоидной (как указано белыми стрелками) с течением времени после doxorubiCIN лечения. Этот реактивный иммунный ответ было показано, что препятствием терапевтический ответ на несколько классов химиотерапии 4,5. Время указано время после доксорубицина лечения. Изображения максимальной интенсивности проекции Z-Stack, содержащий три изображения в Z-оси. Шкала бар = 100 мкм.
Фильм 1. . Доставки лекарств в опухоль Это двойные трансгенные MMTV-PyMT; ACTB-ECFP животных, в которых раковые клетки помечены синим через выражение ECFP. Животных вводили 2 MD FITC-конъюгированные декстрана (зеленый) во время визуализации сессии представить себе, как наркотики достигают опухоли после внутривенной инъекции. Шкала бар = 100 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм 2. Наркотиков проникновение в ткани опухоли тройной трансгенных C3 (1)-тегов;. ACTB-ECFP, C-FMS-EGFP животных, в которых раковые клетки ла-белед в синем через выражение ECFP и миелоидной клетки помечены зеленым через выражение EGFP вводили IV с Alexa Fluor 647-сопряженными 10 кДа декстрана (красный). Поле зрения показан сразу после введения декстрана. Декстран первоначально называет сосуды, быстро extravasates в опухолевой ткани, и, наконец, рассмотрен макрофагов. Шкала бар = 100 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм 3. Изображениями ядерных изменений после вызванной химиотерапией гибели клеток Эта тройка трансгенных MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP животных вводили доксорубицин до визуализации. Ядерная морфология (зеленый), как отслеживать выражение H2B-EGFP гибридный белок, позволяет прямой визуализации, вызванной химиотерапией ядерные структурные изменения, характерные для апоптоза, как видно на ячейку в верхнем правом углу. Животное Received полчаса IP. инъекций PI (красный) на время сессии изображений для обозначения мертвых и умирающих клеток. Время указано время после лечения доксорубицином +24 час. Изображения были получены с использованием высоких объектива увеличение (40x, NA 1.1, вода линзы). Шкала бар = 15 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм 4. Изображениями ядерных изменений и поглощению мертвого клеточного материала после химиотерапии-индуцированной гибелью клеток Эта тройка трансгенных MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP животным вводили доксорубицин до визуализации. Ядерная морфология (зеленый), как отслеживать выражение H2B-EGFP гибридный белок, позволяет прямой визуализации, вызванной химиотерапией ядерные структурные изменения. Животное получало полчаса IP. инъекций PI (красный) на время сессии изображений для обозначения мертвых и умирающих клеток. Изображения были полученыиспользованием высоких объектива увеличением (40 х, NA 1.1, вода линзы). Отсутствие серьезных структурных изменений до маркировки с PI и изменения в ядерной морфологии и потери сигнала GFP свидетельствует о некрозе, как гибель клеток. Мертвого материала видно, рассматриваемых клетки с крупным ядром, которое является типичным макрофагов. Время указано время после лечения доксорубицином +24 час. Шкала бар = 10 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Discussion
Ответ опухоли на системной терапии в естественных условиях могут быть значительно отличаются от тех раковых клеток в пробирке, как микросреда влияет как на острую реакцию и рецидивы 5. Одна из самых больших препятствий на пути экспликации в пути естественных химиорезистентность является сложность взаимодействия между раковыми клетками и их микроокружения. В частности, из-за солидных опухолей разработали баланс между раком и стромальных клеток, возмущения одного из компонентов, таких, как гибель клеток, которое происходит во время борьбы с раком лечения, может привести к драматическим воздействие на ткани организации.
Прижизненный метод визуализации, представленная здесь позволяет прямой визуализации раковых клеток стромы-взаимодействий внутри опухоли живое, анестезированных мышей во время лечения противораковым препаратам. Мы используем вращающийся диск конфокальной микроскопии, который имеет относительную небольшую глубину проникновения (см. 17 (например, вследствие проникновения помечены населения или индукции клеточной смерти), подвижность клеток, распространение инъекции (например, для отслеживания сосудистой утечки), и со- Локализация флуоресцентные сигналы 5,12,17,20.
Мы регулярно изображений мышей в течение 6 часов, а также выполняется визуализация в течение 18 часов. Это требует поддержания непрерывного мышей под наркозом для этих длительных периодов времени. При правильной анестезии, более 90% наших животных выживать 6 часов, а около 80% живут более 18 часов. Подробнее о том, как выполнить долгосрочные анестезии были опубликованы ранее 19. По нашему опыту, пять факторов являются критическими: избегать переохлаждения, избегать обезвоживания, поддержания физиологического уровня кислорода в крови насыщения, ипеть увлажненного газа-носителя для изофлурана и содержания животных на самом низком уровне анестезии, при которой они не показывают признаков боли. Для поддержания температуры тела, мы продолжаем мышей под одеяло с подогревом (при 38 ° C). Чтобы избежать обезвоживания, мы вводим небольшие объемы солевых IP в течение всей процедуры обработки изображений. Для поддержания физиологического уровня кислорода в крови насыщения, мы начнем с 21% кислорода в газе-носителе (вместо обычно используется 100%). Это позволяет увеличить вдыхаемого кислорода уровней, если мышь - часов в эксперименте - показывает снижение насыщения крови кислородом. По нашему опыту, повышение уровня кислорода ингаляционным в такое время (например, до 30-40%) почти всегда будет стабилизировать животных позволяет в течение нескольких часов дополнительных изображений. Оптимальный уровень анестезии для большинства мышей достигается с 1-1.5% изофлурана и в результате дыхания темпы 60-65/min и частоты пульса из 400-450/min. В наших экспериментах с изображениями, мы в первую очередь использовать трансгенных мышахс (MMTV-PyMT и C3 [1]-Tag), в котором мультифокальные опухоли, что позволяет для работы с изображениями нескольких поражений на разных стадиях опухолевой прогрессии параллельно в нескольких х, у позиций в течение одной сессии изображения. Это уменьшает озабоченность по поводу мыши к мыши вариации по экспериментов, направленных на выявление стадии зависит от терапевтической реакции, и уменьшает количество животных, необходимых для работы с изображениями.
MMTV-PyMT модели (и других моделей спонтанной рак) проходят через прогрессивную гистопатологические этапов, которые могут быть признаны во время съемки прижизненной, хотя патологические постановка опухолевого поражения, которое может быть сделано во время прижизненного изображения отличается от, и менее подробные, чем у гистологических срезов 5,17. В отличие от трансплантации модели, как правило, отражают конце опухолей стадии лучше, так как раковые клетки, как правило, изолированы от опухолей на поздних стадиях. Такие модели, таким образом, более склонны к изучению опухоли стромывзаимодействий конце опухолей стадии, чем различия в этих взаимодействиях между разными этапами.
Мы покажем примеры того, как изображение ядерные структурные изменения, которые происходят после гибели клеток индуцированной терапии. В отсутствие анти-лечение рака, эта маркировка стратегия может быть использована вместо того, чтобы изображение деление клеток на месте, выясняя, например, как клеточную пролиферацию и покоя находится под влиянием микроокружения. В будущем, флуоресцентная маркировка митохондриального компонента может сделать это возможным изображение митохондриальных изменений, которые происходят во время апоптоза клеток.
В этом протоколе, мы также показали примеры того, как изображение раковых клеток, иммунных клеток взаимодействия после лечения, но и другие компоненты микросреды также могут быть визуализированы и образ. Существующие трансгенных линий репортер стромальные компоненты включают в себя тех, для фибробластов (например,., FSP1-EGFP 17, αSMA RFP-21, COL1A1-EGFP 21) или клеток сосудистой (например, Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Прижизненные изображения позволяет в режиме реального времени визуализации взаимодействий и процессов, которые происходят в естественных условиях после введения химиотерапии. С технологией в настоящее время, мы добились значительного прогресса в понимании того, как миелоидных клеток влияют терапевтический эффект, однако, поскольку микроокружение опухоли настолько сложен, основные достижения по-прежнему необходимо, чтобы начать копаться механистически в процессах, лежащих в основе экологически опосредованные лекарственной устойчивостью. Одним из наиболее важных достижений по-прежнему требуется является определение лучшего маркеров для конкретных популяций клеток. Важность лучше маркеры хорошо иллюстрируется с двумя из самых известных стромальных компонентов клетки микроокружения опухоли молочной железы, фибробласты и клетки иммунной системы. α-актин гладких мышц (αSMA) часто используются для идентификациифибробластов, но белок выражается также гладкомышечных клеток сосудов и клеток миоэпителиальных 24. Таким образом, хотя αSMA-GFP мышей репортер существует, определение конкретных типов клеток бытие во время следующих прижизненных изображений эксперимент является сложной задачей. Кроме того, одним флуоресцентных маркеров, таких как EGFP выражается в C-FMS промоутер часто идентификации нескольких субпопуляций клеток иммунной 12,17. Таким образом, хотя можно было бы идеально, как использовать один маркер для определения конкретного типа клеток сложности основных биология представляет собой серьезную проблему при использовании данного подхода.
Один частичного решения этой проблемы является использование инъекционных метки для дальнейшей дифференциации субпопуляций клеток, экспрессирующих флуоресцентные же репортер. Например, люминесцентные декстраны будут взяты макрофагов и может быть использован для обозначения макрофагов субпопуляции, которые помечены C-FMS-EGFP и Fsp1-EGFP трансгенных мышей Репортер
В отличие от опухоли кривые отклика порожденных суппорта измерений, которые предоставляют мало информации о механистической, как и почему опухоли реагировать на введении терапевтических или гистологического серии, полученные из тканей собраны в различные моменты времени, которые требуют больших когорт животных, наша техника обеспечивает прямой количественной оценке информации на динамику гибели клеток и взаимодействия стромальных клеток с раковыми клетками в небольших группах. Таким образом, преимущество использования процедуры сообщили здесь в том, что она обеспечивает динамическую информацию о наркотиках ответы в контексте нетронутыми микроокружения опухоли в режиме реального времени. Такая информация может привести к важным понимание глубинных процессов, которые управляют терапевтический ответ 5 </ SUP>.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденным IACUC протоколов.
Acknowledgments
Мы благодарим J. Cappellani и Дж. Цю технической поддержки. Эта работа была поддержана за счет средств Национального Института Рака (U01 CA141451), Старр рака консорциума, Сьюзен Г. Комен для Лечения, Long Island 2 дня Walk для борьбы рака молочной железы, коалиция Manhasset Женщины против рака груди ко мне, и предварительно докторские стипендии с Конгрессом Режиссер груди Программа исследований рака, США ESNESN также является получателем Leslie C. Быстрый и Уильям Рэндольф Херст Фонд стипендий из школы Уотсон биологических наук. HAA была поддержана средств из Исследовательского Совета Норвегии (160698/V40 и 151 882), и Юго-Восточной региональных органов здравоохранения (2007060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
