Summary
Nous décrivons une méthode d'imagerie de la réponse à un traitement anticancéreux
Abstract
Le micro-environnement tumoral joue un rôle essentiel dans l'initiation de la tumeur, la progression des métastases, et la réponse aux thérapies anti-cancéreuses. En trois dimensions des systèmes de co-culture sont souvent utilisés pour expliquer la tumeur du stroma interactions, y compris leur rôle dans la réponse aux médicaments. Cependant, la plupart des interactions qui se produisent in vivo dans le microenvironnement intacte ne peut pas être complètement repris dans ceux-ci dans les paramètres in vitro. Ainsi, la visualisation directe de ces processus en temps réel est devenu un outil important dans la compréhension des réponses tumorales aux traitements et à identifier les interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma qui peuvent influencer ces réponses. Ici, nous fournissons une méthode pour utiliser la microscopie confocale à disque rotatif en direct, des souris anesthésiées d'observer directement distribution de médicaments, les réponses des cellules cancéreuses et les changements dans les tumeurs du stroma-interactions après l'administration d'une thérapie systémique dans des modèles de cancer du sein. Nous décrivons les procédures de labeling composants tumoraux différents, le traitement des animaux pour l'observation de réponses thérapeutiques et la procédure chirurgicale pour exposer les tissus tumoraux pour l'imagerie jusqu'à 40 heures. Les résultats obtenus par ce protocole sont time-lapse films, dans lequel les processus tels que l'infiltration de drogue, la mort des cellules cancéreuses et la migration des cellules stromales peuvent être évaluées en utilisant un logiciel d'analyse d'image.
Introduction
Les tumeurs solides sont constituées de deux compartiments principaux: les cellules cancéreuses et les constituants du stroma (cellulaires et non cellulaires) qui aident à maintenir un environnement approprié pour la croissance tumorale 1. Ces constituants stromales jouent un rôle essentiel dans le développement, la progression et les métastases de nombreux types de cancers, y compris ceux de l'2-5 du sein. Le milieu stromal influence également les réponses thérapeutiques 2,4,5. Ainsi, pour déterminer comment les cellules cancéreuses répondent pas aux thérapies conventionnelles et nouvelles dans le cadre du micro-environnement intact est important pour approfondir notre compréhension de la biologie du cancer et l'amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles. En outre, la définition de la façon dont le cancer des cellules du stroma interactions changer à la suite de l'administration de la thérapie est essentielle pour la compréhension de la biologie de récidive de la tumeur.
Organotypiques systèmes de co-culture ont été utiles pour l'étude des interactions stroma tumoral
Les moyens primaires de l'étude des réponses à la thérapie anticancéreuse in vivo ont été par des mesures de taille de la tumeur et l'évaluation histologique des tissus provenant d'animaux traités ou des patients. Cependant, les progrès de la microscopie et rapporteurs fluorescents au cours des deux dernières décennies ont permis la visualisation des processus inter-et intracellulaireà haute résolution dans les vivants, les animaux anesthésiés (intravitale imagerie) 8. Ces technologies de microscopie intravitale se sont avérés particulièrement précieux pour disséquer spatialement et temporellement dans la dynamique de l'in vivo de tumeurs du stroma-interactions à résolution cellulaire et sub-cellulaire 8,9.
Les processus qui ont été démêlé par imagerie intravitale comprennent une cytotoxicité anti-tumorale des cellules T 10,11, les interactions entre les cellules T et les cellules myéloïdes 12, la dynamique des changements dans la composition du collagène et de l'organisation suite à un traitement thérapeutique 13, macrophages dépendant intravasation cellules cancéreuses et les métastases 14, 15 et la perméabilité vasculaire.
Il ya trois exigences majeures pour l'imagerie intravitale. Il s'agit notamment de la préparation appropriée et l'exposition des tissus pour l'imagerie, le marquage fluorescent des composants du tissu d'intérêt, et une paire de microscopie caméra système capable d'acquérir des images 16. Les stratégies les plus couramment utilisées pour répondre à ces exigences comprennent: 1) les préparations hétérotopiques (par exemple, l'inoculation de l'orbitale oreille ou l'œil), l'imagerie permanente fenêtres, ou des préparations extériorisés (par exemple, lambeau de peau dorsale), 2) transgéniques fluorescents et des journalistes.. injectables fluorescentes pour étiqueter les composants tissulaires et 3) systèmes de microscopie confocale multiphotonique ou jumelé avec des tubes photomultiplicateurs ou Charge-Coupled Device (CCD), respectivement 9. Nous utilisons un modèle de peau chirurgicalement préparé rabat pour exposer la glande mammaire inguinale pour l'imagerie chez les animaux anesthésiés qui expriment des transgènes codant rapporteurs fluorescents. Les images sont obtenues sur une période de 12 à 40 heures en utilisant un CCD intensifié (ICCD) couplé à une caméra quatre-système de disque laser microscope confocal filage 17. Imagerie de cette manière nous a permis d'étudier des processus tels que la distribution de médicaments in vivo, le stade dépendant chemotherapeutic réponses, le type de mort cellulaire induite par la chimiothérapie, et le comportement des cellules myéloïdes 5.
Nous fournissons un protocole pour l'imagerie intravitale des réponses des cellules cancéreuses à la thérapie anticancéreuse et du stroma tumoral interactions dans les modèles murins de cancer du sein. Ce protocole peut être utilisé pour suivre les comportements et la mort des cellules cancéreuses deux et les composants du stroma avec une grande variété de transgéniques et injectables marqueurs fluorescents dans les deux modèles transgéniques et la transplantation pour des périodes allant jusqu'à 40 heures en une seule séance d'imagerie.
Protocol
Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de la protection des animaux et du Comité institutionnel locale utilisation.
1. Génération tumeurs mammaires de souris pour l'imagerie (transgénique ou orthotopique)
- Générer des tumeurs mammaires pour l'imagerie utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées (par exemple la souris virus de tumeur mammaire longue répétition terminale [MMTV]-polyome milieu antigène T [PyMT] ou le rat (1) C3 promoteur de l'antigène grand T de conduit (Tag) de SV40 [C3 ( 1)-Tag] Les modèles) ou des modèles de transplantation orthotopique (syngéniques, allogéniques ou xénogéniques).
- Étiquette cellules cancéreuses par le croisement des modèles transgéniques avec des lignes rapporteurs transgéniques (par exemple ACTB-ECFP) ou l'utilisation de manipulation ex vivo de cellules cancéreuses primaires ou de lignées cellulaires (transduction, par exemple) suivie d'une greffe. Pour un exemple de protocole pour la transplantation orthotopique, see 18.
2. Composants Visualisation du microenvironnement tumoral ou sous-cellulaires Composants
- Visualisation composantes tumorales en utilisant des étiquettes transgéniques. Un croisement génétiquement modèles de tumeurs chez les souris transgéniques (par exemple journaliste c-fms-EGFP pour les cellules myéloïdes ou ACTB-H2B-EGFP pour les noyaux) ou utiliser la souris comme bénéficiaires de tissus transplantés, étiquetés. Cela permet la visualisation des interactions cellulaires du cancer de cellules stromales-en réponse à une thérapie ou des modifications nucléaires associés à la mort cellulaire, respectivement.
- Visualisation du microenvironnement l'utilisation des injectables. Une grande variété d'agents (par exemple des anticorps marqués par fluorescence ou des colorants chimiques) peut être utilisé pour étiqueter différentes composantes de la tumeur. En fonction de la demi-vie du colorant et la réponse est intéressé par une poursuite, la injectable peut être administrée avant le début de l'imagerie ou au cours de la session de formation d'image par voie intraveineuse (iv.) Ou intraperitoneally (ip., figure 1).
3. Microscopes et logiciels d'imagerie
- Microscope. Une variété de systèmes et de logiciels de microscope peut être utilisé pour l'imagerie des souris vivantes. Les systèmes les plus couramment utilisés sont microscopie confocale multiphotonique ou. Nous utilisons un microscope à lentille micro-disque de rotation confocale (Technologies Solamere, Salt Lake City, UT) avec une caméra ICCD (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
- Logiciel d'imagerie. Nous utilisons le μManager logiciel open source (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
- L'analyse d'image. Nous utilisons Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), et ImageJ (Institut National de la Santé [NIH]) pour l'analyse d'image.
4. (Pré)-traitement des animaux destinés à l'imagerie
- Inguinales tumeurs mammaires sont optimales pour l'imagerie en utilisant notre protocole lorsque le plus grand diamètre mesure environ 8 mm ou moins, selon étrier de mesureement.
- Pour animaux d'imagerie traités avec un inhibiteur de petite molécule, un anticorps thérapeutique ou un médicament chimiothérapeutique, commencer le traitement avant ou pendant l'imagerie comme requis pour l'expérimentation. Par exemple, l'imagerie de l'extravasation de médicaments et de distribution nécessite une administration après l'imagerie a été initié (Films 1 et 2), tandis que l'imagerie de la mort cellulaire induite par la doxorubicine médicament chimiothérapeutique est le mieux saisi par imagerie à partir de 24 heures ou plus après le traitement médicamenteux (3 Films et 4).
5. Préparation de la Saline pour maintenir l'hydratation et osmolarité du sang de l'animal au cours d'imagerie
- Dessinez environ 1 ml de PBS 1x dans une seringue de 1 ml. L'iodure de propidium (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, 1:15 dilué) peut être ajouté à cette solution qui sera périodiquement administrés (ip.) Au cours de la séance d'imagerie. Cela permettra à l'imagerie des noyaux de cellules mortes ou mourantes qui ont les membranes cellulaires perméables. PI a une très courte half-vie dans le système vasculaire et doit donc être ré-administré tout au long de la séance d'imagerie.
- Attacher un dispositif de perfusion à ailes (23 gauge, ¾ pouces aiguille, 12 tubes pouces) de cette seringue et pousser la solution à travers le tube jusqu'à ce qu'une goutte de solution saline sort la pointe de l'aiguille à l'extrémité de la tubulure.
- Retirez la seringue de l'ensemble de perfusion, et le remplir avec la solution saline appropriée.
- Re-fixer la seringue à l'ensemble de perfusion, en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne.
6. Préparation du système d'anesthésie isoflurane
- Ajouter de l'eau dans le nébuliseur et le visser en place. Ce sera humidifier les gaz livrés à l'animal, ce qui empêche l'irritation des poumons et de prolonger la survie des animaux en vertu long terme anesthésie.
- Remplir le réservoir de l'isoflurane sur la première ligne. ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique puissant qui peut également affecter le chercheur. Systèmes d'aspiration appropriés, devraient be en place pour faire en sorte que les gaz en excès sont éliminés de la zone.
- Allumez le réservoir d'oxygène et les réservoirs d'azote et régler le débit. L'azote devrait être d'environ 1,0 L / min, tandis que l'oxygène devrait être d'environ 0,2 L / min (~ 21%).
- Allumez le vide (en interne). Le vide doit être d'environ 1,2 L / min.
- Confirmer que la ligne de l'anesthésie à la chambre d'admission est ouverte, et les lignes de la région de la chirurgie et de la microscopie sont fermés.
- Confirmer que le sac de respiration latex attaché au système d'anesthésie est gonflé. Si le sac ne se gonfle pas, le remplacer.
- Vérifier la membrane de caoutchouc sur chacune des ogives délivrant l'anesthésie à la platine du microscope chirurgical et la plate-forme. Si le caoutchouc commence à mince, le remplacer.
7. Préparation des outils chirurgicaux et chirurgicaux plate-forme
- Mettez un stérilisateur à chaud de perles et le laisser atteindre> 200 ° C.
- Laver les outils chirurgicaux au savon et à l'eau(Une paire de forceps [de préférence avec des dents] et ciseaux pour couper à travers la peau de l'animal, une paire de forceps [de préférence dentelée] et ciseaux pour l'exposition de plus de la tumeur).
- Stériliser les instruments chirurgicaux pendant au moins 30 secondes en utilisant le stérilisateur à billes à chaud (à défaut, les outils chirurgicaux peuvent être autoclavés à l'avance).
- Laissez les outils chirurgicaux se rafraîchir tout en veillant à éviter de contaminer les outils stérilisés.
- Recueillir le couvercle pour une glacière en styromousse expédition. Ce sera votre plateforme chirurgicale.
- Placez un morceau d'un trempage de laboratoire sur le dessus du couvercle en polystyrène (assez pour couvrir).
- Apposer un cône de nez avec une ligne au système d'anesthésie pour le maturateur laboratoire avec du ruban de laboratoire (1 "bande fonctionne mieux ici). Insérer une 18 G x1 ½" aiguille à travers la bande dans le couvercle en polystyrène de chaque côté du cône de nez à garder le cône de nez fixé en place.
- Mettez de côté la bétadine, gaze stérile, deux tampons d'isopropanol 70%, un microscopepièces coulissantes, Krazy Glue, et 4 de ruban de laboratoire (½ "largeur).
8. Préparation du microscope
- Allumez le microscope, la caméra et l'ordinateur exécutant le microscope.
- Allumez la couverture chauffante.
- Si un microscope inversé est utilisé, un insert étape sur mesure devraient être conçus avec des ports d'imagerie correspondant à l'emplacement des ganglions inguinaux mammaires. Nettoyez la scène insérez bien avec du savon et de l'eau et sécher. Utilisez du ruban de laboratoire (½ "fonctionne le mieux) pour fixer couvercle en verre (# 1.5 épaisseur) sur les ports d'imagerie et de nettoyer toute la surface avec 70% d'isopropanol. Couvrir la scène avec une gaze stérile pour protéger contre la contamination. Placez la scène dans la scène et laissez sécher à l'air.
- Tear 4 à 6 morceaux de ruban de laboratoire (1 "largeur), à environ 6 pouces de longueur et les attacher sur le côté du microscope. Ces morceaux de ruban sera utilisé pour positionner le cône de nez anesthésie fournir à l'animal uned fixez-le en place.
- Déchirez deux morceaux de ruban (plus de largeur de ½ pouce) qui sont d'environ un pouce de longueur. Ceux-ci seront utilisés pour maintenir l'aiguille papillon prestation PBS à la souris et la lame de microscope utilisé pour exposer la tumeur en place.
9. L'exposition de la glande mammaire inguinale pour l'imagerie
- Anesthésier les animaux dans une chambre d'admission en utilisant 4% d'isoflurane avec de l'oxygène et de l'azote 21% solde (débit d'environ 1,0 l / min) en tant que gaz porteur. Cela devrait prendre 2-4 min.
- Transférer la souris pour la plate-forme chirurgicale une fois qu'il respire profondément et lentement, avec la face ventrale vers le haut. Ouvrez la ligne de l'anesthésie pour la plate-forme chirurgicale puis fermez la ligne de l'anesthésie pour la chambre d'induction, dans cet ordre pour éviter une pression trop élevée dans le système d'anesthésie. Réduire la concentration d'isoflurane de 4% à 2,5% à l'heure actuelle.
- Vérifiez le retrait pédale réflexe pour confirmer que l'animal est suffisamment anesthetized pour l'intervention chirurgicale en effectuant une pincée coussinet plantaire. L'animal est anesthésié convenablement si elle ne réagit pas (contraction par exemple, ou curl sa queue) au pincement coussinet plantaire. Si l'animal ne réagit au pincement du coussinet plantaire, augmenter la concentration de l'isoflurane.
- Fixez les membres de la souris pour la plate-forme chirurgicale avec du ruban de laboratoire (½ "ruban qui fonctionne le mieux pour cela).
- (Facultatif) Une fois que l'animal est fixé à la plate-forme chirurgicale, les cheveux peuvent être enlevés de la surface ventrale en utilisant un rasoir électronique. Si l'épilation chimique est préféré, ce doit être effectuée 24-48 heures avant la chirurgie. Enlever les poils avant la chirurgie aide à prévenir la contamination du site d'imagerie, comme les poils parasites peuvent induire de fortes réponses immunitaires et aiguë.
- Désinfecter la surface ventrale de l'animal avec 70% d'isopropanol et lingettes bétadine.
- Utilisation de la première paire de ciseaux et des pinces stériles (avec dents), faire une incision sous-cutanée ligne médiane ventralequi s'étend à partir de ~ 3 mm au-dessus de l'urètre à la pointe du sternum. Prenez soin de ne pas percer ou couper à travers le péritoine.
- Utilisation de la deuxième paire de ciseaux et des pinces stériles (dents de scie), détachez la peau, de la glande mammaire inguinale attaché, à partir de la cavité péritonéale.
- Prendre une lame de microscope en verre et le positionner contre le lambeau de peau généré à l'étape précédente. Placez la lame de manière à ce que la majeure partie de la tumeur repose à plat une fois que la souris est placé sur la scène, et il n'interfère pas avec la mobilité des membres postérieurs.
- Une fois que la lame de microscope a été correctement positionné, fixez la glissière à la surface externe de la peau à l'aide superglue (p. ex., Krazy Glue).
10. Positionner la souris sur la scène
- Retirer la bande de fixation en laboratoire les membres de l'animal à la plate-forme chirurgicale.
- Ouvrez la ligne de l'anesthésie pour la platine du microscope et fermer la anessia ligne à la plate-forme chirurgicale, dans cet ordre.
- Transférer rapidement l'animal à la platine du microscope.
- Une fois que l'animal a été transféré, la position et fixer la ligne de l'anesthésie et cône de nez correctement (par exemple en utilisant du ruban de laboratoire) afin de s'assurer que la souris reste anesthésié et se trouve dans une position confortable.
- Exposer la tumeur de sorte qu'il est positionné au-dessus et au centre de l'un des ports de verre recouvertes d'imagerie de couverture dans la platine du microscope.
- En utilisant les oculaires, vérifiez que la tumeur est correctement positionné, et doucement le ruban adhésif lame de microscope. La lame doit être fixée de manière lâche le flux sanguin vers le tissu ne soit pas obstruée. Coller en bas de la lame de microscope permet de minimiser les artefacts d'imagerie introduites par la respiration de l'animal.
- Insérez la ligne demeure intrapéritonéale avec une perfusion à ailettes montée sur une seringue de 1 ml contenant stérile ou une solution saline PBS 1x (contenant éventuellement un colorant tel que PI), établi sous le n ° 5. Inject l'animal avec 100 pi lorsque l'adresse IP. ligne est insérée. A partir de ce point dans le temps jusqu'à la fin de la séance d'imagerie, d'injecter de l'animal avec 50 ul de solution saline à des intervalles de 1 h (ou 25 pi de solution saline avec PI toutes les 30 minutes).
- Pour surveiller les signes vitaux de l'animal, fixer une sonde d'oxymètre (par exemple MouseOx système par Starr Life Sciences, Inc) 19.
- Couvrir la souris avec une couverture chauffante pour éviter l'hypothermie.
11. Acquisition d'images
Le logiciel open source de μManager (Vale Lab, UCSF) est utilisé pour acquérir des images à intervalles de temps. Les données brutes sont compilées dans Imaris (Bitplane) de logiciels, et peut être obtenu manuellement par des observateurs indépendants, ou analysés dans les deux logiciels d'analyse d'images Imaris ou autre (par exemple Volocity [PerkinElmer] ou ImageJ [NIH]).
12. L'euthanasie
À la fin de la session d'image (1-40 h, en fonction du type de processus analysé), l'animal est euthanasié.
- La concentration de l'isofluorane est portée à 4%.
- L'animal est observé jusqu'à 30 secondes après elle saisit la respiration et ensuite retiré de la scène.
- La dislocation cervicale est effectuée pour s'assurer que l'animal a été euthanasié.
13. Les résultats représentatifs
Intravitale imagerie utilisant cette méthode permet la visualisation directe des différents processus, y compris l'administration de médicaments vers les tumeurs, l'extravasation et la distribution du médicament une fois qu'il atteint la tumeur, la mort cellulaire après un traitement thérapeutique, et la tumeur du stroma-interactions en réponse à 5 la mort cellulaire. Pour observer l'arrivée d'un médicament à la tumeur et de sa distribution après extravasation dans les tissus tumoraux, l'animal est injecté lorsque des images sont en cours d'acquisition. Bien que plusieurs classes de chemotherapeutics sont faiblement fluorescent (comme la doxorubicine), beaucoup ne sont pas. Fluorescence dextranes conjugués peuvent être utilisés comme marqueurs de substitution pour l'administration de médicaments et la diffusion dans les tissus. Figure 2 et Film 1 montre l'arrivée d'un isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué à 2 MD dextrane (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) injecté par voie iv. dans une tumeur d'un MMTV-PyMT; souris ACTB-ECFP.
Après l'arrivée de la drogue dans la tumeur, l'extravasation et la diffusion à travers les tissus peuvent être visualisés à déterminer à la fois la demi-vie intravasculaire d'un médicament et de distribution des médicaments 5. Film 2 montre l'extravasation et la distribution de l'Alexa Fluor-647-conjugué dextrane 10 kD (Invitrogen, 1 mg / ml dans 1 x PBS) injecté par voie iv. en C3 (1)-Tag; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP souris lors de l'imagerie. Après la compilation de time-lapse films en Imaris (Bitplane), la distribution intravasculaire demi-vie et de drogues est quantifiée. Pour mesurer la demi-vie intravasculaire, L'intensité moyenne de fluorescence dans les vaisseaux sanguins de la tumeur à chaque point de temps est calculé en fonction du temps et de. La distribution des médicaments est quantifiée comme une zone pour cent par zone totale de la tumeur qui est positif pour la drogue.
En plus de suivre la cinétique de délivrance de médicaments vers les tumeurs, il est souvent important de déterminer comment les tumeurs répondent au traitement. Comme les traitements anticancéreux sont de nature à induire la mort cellulaire, l'iodure de propidium (PI) des taches ou des changements de structure nucléaire peut être utilisée comme un marqueur de la toxicomanie provoquée la mort cellulaire 5. Figure 3 montre la réponse tumorale à la doxorubicine chimiothérapeutique cytotoxique dans un MMTV -PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP souris. Dans ce triple transgénique MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal, ECFP cellules du cancer du sein étiquettes (bleu), et les étiquettes EGFP cellules myéloïdes (vert). L'animal acquise lors de cette session a été administré 18 heures avant la doxorubicine imagerie a commencé et PI a été livré ip tout tIl séance d'imagerie comme décrit ci-dessus. Les cellules cancéreuses (ACTB-ECFP étiquetage) apparaissent en bleu, et les cellules mortes ou mourantes apparaissent en rouge (coloration PI). Les séries chronologiques présentées ici montrent l'induction de la doxorubicine en fonction de la mort cellulaire au cours du temps. Pour quantifier l'induction de la mort cellulaire dans les tumeurs, le même type d'analyse utilisée pour déterminer la distribution des médicaments est utilisé, où la production quantitative est la zone pour cent par zone totale de la tumeur qui est positif pour le PI.
Imagerie à fort grossissement peut fournir des informations concernant le type de mort cellulaire que les cellules cancéreuses subissent 5. Movie 3 montre les résultats d'une expérience d'imagerie pour suivre les changements nucléaires typiques de la mort cellulaire par apoptose en réponse à un traitement systémique avec la doxorubicine. Pour visualiser les noyaux, l'animal acquise lors de cette session abrite le journaliste ACTB-H2B-EGFP au lieu de la journaliste c-fms-EGFP, donc les noyaux des cellules cancéreuses sont marqués en vert. Cette MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animaux ACTB-H2B-EGFP a été administered doxorubicine (8 mg / kg dans 1 x PBS) ip 24 heures avant le début du film, et ont reçu des injections horaire de 1 x PBS contenant PI (Invitrogen, 1 mg / ml, solution diluée 1:15). Les changements structurels dans les noyaux des cellules de cancer peuvent être observés dans une cellule apoptotique à côté de cellules qui ont subi une nécrose (PI cellules positives qui affichent des changements minimes dans la morphologie nucléaire). Les noyaux des cellules apoptotiques finit par devenir rouge en raison de l'absorption de la coloration PI (non représentée). Le nombre d'événements nécrotiques et apoptotiques est quantifiée manuellement pour chaque point dans le temps sur la base PI-positivité et de la morphologie nucléaire.
Induits par la chimiothérapie mort des cellules cancéreuses se traduit souvent par un recrutement réactive de cellules immunitaires dans les tumeurs 2,4,5. La figure 4 montre un exemple de cette réponse stromale au traitement aigu avec la doxorubicine. La MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animaux c-fms-EGFP imagée ici a été administré doxorubicine (8 mg / kg dans 1 x PBS) ip ip horaire PI. pour la durée de l'expérience à visualiser la mort cellulaire. Les délais indiqués représentent le nombre d'heures après le traitement doxorubicine et la barre d'échelle représente 100 um. Dans cette expérience, les cellules myéloïdes s'infiltrer dans les domaines de la mort cellulaire, comme indiqué par les flèches blanches. Pour quantifier l'infiltration de cellules myéloïdes dans les tumeurs après administration de doxorubicine, le même type d'analyse utilisée pour déterminer la distribution des médicaments et la réponse tumorale à la chimiothérapie est utilisée, où la production quantitative est la zone pour cent par zone totale de la tumeur qui est positif pour l'EGFP.
En plus de visualiser la réponse globale du stroma à la chimiothérapie, spécialisés réponses stromales peuvent également être visualisés 5. La figure 4 montre le film de matériau phagocytose de cellules nécrotiques par une cellule voisine. La matière nucléaire rouge peut être vu par l'ingestion d'une cellule avec un large noyau intact vert, ce qui est typique des macrophages. La MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animaux ACTB-H2B-EGFP acquise lors de cette session a été administré doxorubicine (8 mg / kg dans 1 x PBS) ip. 24 h avant le début du film. L'animal a reçu des injections horaire de 1 x PBS contenant du PI (Invitrogen, 1 mg / ml, solution diluée 1:15). Noyaux (ACTB-EGFP étiquetage) apparaissent en vert, mais devient rouge lorsque la cellule se nécroser.
Figure 1. Étiquetage d'échantillons de différentes composantes tumorales en utilisant des étiquettes transgéniques et injectables Il s'agit d'une triple transgénique MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal dans lequel les cellules cancéreuses sont marquées en bleu par l'expression de ECFP et des cellules myéloïdes sont étiquetés verte à travers l'expression de l'EGFP partir d'un promoteur spécifique myéloïde. L'animal a été injecté avec de l'iodure de propidium (PI, rouge, ~ 0,07 mg / ml dans du PBS 1x) lorsla séance d'imagerie pour visualiser la mort cellulaire. PI étiquettes d'ADN, mais seulement traverse les membranes cellulaires des cellules mortes ou mourantes. Barre d'échelle = 100 um.
Figure 2. Extravasation et distribution des médicaments dans les tumeurs Cette double transgénique MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP animal dans lequel les cellules cancéreuses sont marquées en bleu par l'expression de ECFP a été injecté avec conjugué au FITC dextran 2 MD (vert) au cours de la séance d'imagerie pour visualiser comment drogues atteindre des tumeurs après injection intraveineuse (bleu). Temps après l'imagerie a été initié est indiqué. Barre d'échelle = 100 um.
Figure 3. Réponse des cellules du cancer à la thérapie systémique. Une MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animaux traités avec la chimiothérapiedoxorubicine médicament avant d'imagerie, et une injection de PI (rouge, ~ 0,07 mg / ml dans du PBS 1x) pour marquer la mort cellulaire. Cette série d'images montre l'accumulation de coloration PI au fil du temps (comme indiqué par les flèches blanches), ce qui représente l'induction de la mort cellulaire doxorubicine après le traitement. Temps indiqué est le temps après le traitement doxorubicine. Les images sont des projections intensité maximale d'un z-pile contenant trois images dans l'axe z. Barre d'échelle = 100 um.
Figure 4. Réponse des cellules myéloïdes à la chimiothérapie dans un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;. Souris c-fms-EGFP triple transgénique administré doxorubicine 20 heures avant l'imagerie L'animal a reçu ip horaire. injections de PI (rouge, ~ 0,07 mg / ml dans du PBS 1x) pour marquer les cellules mortes. Cette série d'images montre l'accumulation des cellules myéloïdes EGFP-positifs (comme indiqué par les flèches blanches) au fil du temps à la suite doxorubitraitement cin. Cette réponse immunitaire réactive a été montré pour empêcher la réponse thérapeutique à plusieurs classes de chimiothérapies 4,5. Temps indiqué est le temps après le traitement doxorubicine. Les images sont des projections intensité maximale d'un z-pile contenant trois images dans l'axe z. Barre d'échelle = 100 um.
Film 1. . L'administration de médicaments dans une tumeur s'agit d'un double-transgéniques MMTV-PyMT; ACTB-ECFP animal dans lequel les cellules cancéreuses sont marquées en bleu par l'expression de ECFP. L'animal a été injecté avec une 2 MD conjugué au FITC dextran (vert) au cours de la séance d'imagerie pour visualiser comment les drogues atteindre des tumeurs après injection intraveineuse. Barre d'échelle = 100 um. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 2. Infiltration médicament dans le tissu tumoral Un triple transgénique C3 (1)-Tag;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal chez lequel les cellules cancéreuses sont laBeled en bleu par l'expression de ECFP et des cellules myéloïdes marquées en vert à travers l'expression de l'EGFP a été injecté par voie intraveineuse avec un Alexa Fluor 647-10 kD conjugué dextrane (rouge). Le champ de vision est affiché immédiatement après l'injection de dextran. Le dextrane étiquettes initialement le système vasculaire, extravasates rapidement dans le tissu tumoral, et est finalement repris par les macrophages. Barre d'échelle = 100 um. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 3. Imagerie des modifications nucléaires après la mort cellulaire induite par la chimiothérapie Cette triple transgéniques MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, H2B-EGFP animal a été injecté avec la doxorubicine avant l'imagerie. Morphologie nucléaire (vert), suivi par l'expression d'une protéine de fusion EGFP-H2B, permet une visualisation directe de la chimiothérapie nucléaires induites par des changements structurels typiques de l'apoptose comme on le voit pour la cellule dans le coin supérieur droit. Le rece animauxIVED demi-heure ip. injections de PI (rouge) pour la durée de la séance d'imagerie pour marquer les cellules mortes et mourantes. Temps indiqué est le temps après le traitement doxorubicine +24 hr. Les images ont été acquises à l'aide d'une lentille à fort grossissement objectif (40x NA 1.1, lentille d'eau). Barre d'échelle = 15 um. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 4. Imagerie des modifications nucléaires et l'adoption des documents de cellules mortes après la mort cellulaire induite par la chimiothérapie Cette triple transgénique MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, H2B-EGFP animal a été injecté avec la doxorubicine avant l'imagerie. Morphologie nucléaire (vert), suivi par l'expression d'une protéine de fusion EGFP-H2B, permet une visualisation directe de la chimiothérapie nucléaires induites par des changements structurels. L'animal a reçu une demi-heure ip. injections de PI (rouge) pour la durée de la séance d'imagerie pour marquer les cellules mortes et mourantes. Les images ont été acquisesutilisez un objectif à fort grossissement objectif (40 x, NA 1.1, lentille d'eau). L'absence de modifications majeures de la structure avant l'étiquetage avec PI et le changement de la morphologie nucléaire et la perte de signal de la GFP est une indication d'une mort cellulaire de type nécrose. La matière morte est considérée être reprise par une cellule avec un gros noyau, ce qui est typique des macrophages. Temps indiqué est le temps après le traitement doxorubicine +24 hr. Barre d'échelle = 10 um. Cliquez ici pour voir le film .
Discussion
Les réponses des tumeurs aux traitements systémiques in vivo peut être considérablement différents de ceux des cellules cancéreuses in vitro, comme le micro-environnement influence à la fois la réponse aiguë et la rechute 5. Un des plus grands obstacles à l'expliciter dans les voies de chimiorésistance in vivo est la complexité des interactions entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. En particulier, parce que les tumeurs solides ont établi un équilibre entre le cancer et les cellules stromales, des perturbations de l'une des composantes, telles que la mort cellulaire qui se produit pendant le traitement anti-cancéreux, peut entraîner des effets dramatiques sur l'organisation des tissus.
La technique d'imagerie intravitale fournie ici permet la visualisation directe des cellules cancéreuses-stroma interactions au sein des tumeurs de souris anesthésiées en direct, pendant le traitement avec des médicaments anticancéreux. Nous utilisons la microscopie confocale disque rotatif, qui a une profondeur de pénétration relativement limitée (voir 17 exemple due à l'infiltration d'une population marquée ou l'induction de la mort cellulaire), la motilité cellulaire, la distribution de produits injectables (par exemple pour suivre les fuites vasculaires), et co- localisation des signaux fluorescents 5,12,17,20.
Nous souris d'image systématiquement depuis plus de 6 heures et d'imagerie également effectué pendant plus de 18 heures. Cela nécessite de maintenir en permanence les souris sous anesthésie pour ces longues périodes de temps. Avec une anesthésie adéquate, plus de 90% de nos animaux survivent à 6 heures, et environ 80% survivent plus de 18 heures. Détails sur la façon d'effectuer une anesthésie à long terme ont déjà été publiés 19. Dans notre expérience, cinq facteurs sont essentiels: éviter l'hypothermie, évitant la déshydratation, le maintien des taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, uchanter gaz porteur humidifié pour l'isoflurane, et en gardant les animaux au plus bas niveau de l'anesthésie au cours de laquelle ils ne montrent pas de signes de douleur. Pour maintenir la température du corps, nous gardons souris sous une couverture chauffante (à 38 ° C). Pour éviter la déshydratation, on injecte de petites quantités de solution saline ip tout au long de la procédure d'imagerie. Afin de maintenir les taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, nous commençons avec 21% d'oxygène dans le gaz porteur (plutôt que le couramment utilisé à 100%). Cela nous permet d'augmenter les niveaux d'oxygène en inhalation si une souris - heures dans une expérience - montre une diminution de la saturation en oxygène du sang. D'après notre expérience, ce qui augmente les niveaux d'oxygène inhalé au moment (par exemple 30-40%) presque toujours se stabilisera l'animal permettant des heures d'imagerie complémentaire. Le niveau optimal de l'anesthésie est pour la plupart des souris obtenus avec 1-1,5% isoflurane et les résultats des taux de respiration et le pouls 60-65/min de 400-450/min. Dans nos expériences d'imagerie, nous utilisons principalement le modèle de souris transgéniques (MMTV-C3 et PyMT [1]-Tag), dans laquelle les tumeurs sont multifocales, ce qui permet l'imagerie des lésions multiples à différents stades de progression de la tumeur en parallèle à x, Y positions multiples au cours d'une session de formation d'image unique. Cela diminue préoccupations concernant la souris à la souris variation par rapport à des expériences visant à identifier dépendent du stade de réponses thérapeutiques et de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour l'imagerie.
Le modèle MMTV-PyMT (et d'autres modèles de cancer spontané) passer par les étapes progressives histopathologiques qui peuvent être reconnus lors de l'imagerie intravitale, bien que la mise en scène pathologique des lésions tumorales qui peuvent être faites lors de l'imagerie intravitale est différent, et moins détaillé que celui de coupes histologiques 5,17. En revanche, les modèles de transplantation ont tendance à refléter les tumeurs à un stade avancé de mieux, que les cellules cancéreuses sont généralement isolés de tumeurs avancées. Ces modèles sont donc plus propice à l'étude des tumeurs du stromainteractions des tumeurs à un stade avancé que les différences de ces interactions entre les différentes étapes.
Nous montrons des exemples de la façon d'images nucléaires changements structurels qui se produisent après la mort cellulaire induite par le traitement. En l'absence de traitement anti-cancéreux, cette stratégie étiquetage peut être utilisé à la place de l'image de la division cellulaire in situ, élucider, par exemple, comment la prolifération cellulaire et la dormance est influencé par le microenvironnement. À l'avenir, le marquage fluorescent des composants mitochondriaux, il peut être possible de l'image change mitochondriales qui se produisent pendant la mort cellulaire par apoptose.
Dans ce protocole, nous avons également montré des exemples de la façon d'images interactions cellulaires de cancer des cellules immunitaires après une thérapie, mais d'autres composants du micro-environnement peuvent également être visualisés et imagée. Lignes existantes reporter transgéniques pour les composants du stroma comprennent ceux des fibroblastes (p. ex., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) ou les cellules du système vasculaire (par exemple Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravitale imagerie permet de visualiser en temps réel des interactions et des processus qui se déroulent dans l'administration in vivo suivant la chimiothérapie. Avec la technologie actuellement disponible, nous avons fait de grands progrès dans la compréhension de la façon dont les cellules myéloïdes influencer la réponse thérapeutique, mais parce que le microenvironnement de la tumeur est si complexe, les progrès importants sont encore nécessaires pour commencer à creuser mécaniquement dans les processus sous-jacents à l'environnement induite par la résistance aux médicaments. L'un des progrès les plus importants restent nécessaires est l'identification des meilleurs marqueurs de populations cellulaires spécifiques. L'importance des meilleurs marqueurs est bien illustré avec deux des composantes les plus importantes de cellules stromales de la microenvironnement de la tumeur du sein, les fibroblastes et les cellules immunitaires. muscle lisse α-actine (αSMA) est fréquemment utilisé pour identifierfibroblastes, mais la protéine est également exprimée par les cellules musculaires lisses et les cellules myoépithéliales 24. Ainsi, bien que les souris journaliste αSMA-GFP existent, déterminer le type de cellule spécifique étant ci-après au cours d'une expérience d'imagerie intravitale est difficile. De même, un seul marqueur fluorescent tel que EGFP exprimée sous le promoteur de c-fms identifiera souvent multiples sous-populations de cellules immunitaires 12,17. Ainsi, bien que l'on souhaiterait idéalement utiliser un marqueur unique pour identifier un type de cellule spécifique la complexité de la biologie sous-jacente constitue un défi majeur dans l'utilisation de cette approche.
Une solution partielle à ce problème est d'utiliser des étiquettes injectables afin de mieux différencier les sous-populations de cellules exprimant le même journaliste fluorescent. Par exemple, les dextranes fluorescents sont prises par les macrophages et peuvent être utilisées pour marquer les sous-populations de macrophages qui sont marqués par le c-fms-EGFP et FSP1-EGFP souris transgéniques journaliste
Contrairement aux courbes de réponse tumorale générés par étrier de mesure, qui ne fournissent que peu d'informations sur la façon mécaniste ou pourquoi les tumeurs répondre à la thérapeutique administrée, ou d'une série histologique provenant de tissus prélevés à différents moments qui nécessitent de grandes cohortes d'animaux, notre technique permet une information directe et quantifiable sur la dynamique de la mort cellulaire et sur les interactions entre les cellules stromales de cellules cancéreuses dans de petites cohortes. Ainsi, l'avantage d'utiliser la procédure indiquée ici est qu'il fournit des informations dynamiques sur les réactions aux médicaments dans le contexte d'un microenvironnement de la tumeur intacte en temps réel. Ces informations peuvent conduire à des indications importantes sur les processus sous-jacents qui déterminent les réponses thérapeutiques 5 </ Sup>.
Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés IACUC.
Acknowledgments
Nous remercions J. et J. Cappellani Qiu pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'Institut national du cancer (U01 CA141451), le cancer du Consortium Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Marche Île Jour 2 de lutte contre le cancer du sein, de la Coalition des femmes contre la Manhasset cancer du sein ME, et un pré-doctoral du Programme de recherche sur le cancer du sein dirigé par le Congrès, États-Unis à ESNESN est également le destinataire de la rapide et Leslie C. William Randolph Hearst Bourses de la Fondation de l'École des sciences biologiques Watson. AHA a été soutenue par des fonds du Conseil norvégien de la recherche (160698/V40 et 151 882), et du Sud-Est Regional Health Authorities (2007060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
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