Summary
Les modèles expérimentaux proposés ici se concentrer sur l'étude des effets de l'exposition à l'alcool dans l'apoptose et l'application de peptide neurotrophique pendant la grossesse dans le cerveau du fœtus. Une description détaillée de l'élevage à la collecte de cerveau du fœtus est décrite. Techniques pour la détermination de l'apoptose sont également décrites en détail.
Abstract
Les modèles expérimentaux pour étudier les effets de l'exposition prénatale à l'alcool au cours de stades embryonnaires de la croissance du cerveau du fœtus sont difficiles. Cela est principalement dû à la difficulté de microdissection du cerveau du fœtus et leur sectionnement pour la détermination des cellules apoptotiques causées par l'exposition prénatale à l'alcool. Les expériences décrites ici fournir des techniques visualisées à partir des souris d'élevage à l'identification de la mort cellulaire dans les tissus du cerveau du fœtus. Cette étude a utilisé C57BL / 6 que le modèle animal pour l'étude de l'exposition d'alcoolisation fœtale et le rôle du peptide trophique contre l'apoptose induite par l'alcool. La sélection consiste en une fenêtre de matage en 2 heures pour déterminer le degré exact de l'âge embryonnaire. Un modèle d'exposition d'alcoolisation fœtale établie a été utilisée dans cette étude afin de déterminer les effets de l'exposition prénatale à l'alcool dans le cerveau du fœtus. Cela implique le libre accès à l'alcool ou nourri en régimes liquides comme la seule source de nutriments pour les souris enceintes.
Pour enquêter sur l'apoptose, le cerveau du fœtus sont d'abord ancrées dans la gélatine à l'aide d'un moule pelable afin de faciliter leur sectionnement avec un appareil vibratome. Cerveau fœtal embarqués et fixes en paraformaldéhyde sont facilement sectionné, et les sections flottantes peuvent être montés en plus des diapositives SUPERFROST pour la détermination de l'apoptose ou mort cellulaire.
TUNEL (TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale) test a été utilisée pour identifier la mort des cellules ou des cellules apoptotiques. Il est à noter que l'APoptosis et la cytotoxicité à médiation cellulaire sont caractérisés par la fragmentation de l'ADN. Ainsi, les cellules TUNEL positifs visualisés sont révélateurs de la mort des cellules ou des cellules apoptotiques.
Les modèles expérimentaux ici fournissent des informations sur l'utilisation d'un régime liquide établi pour étudier les effets de l'alcool et le rôle des peptides neurotrophiques dans le cerveau pendant la grossesse foetus. Il s'agit de reproduction et d'alimentation des souris gravides, microdissecting cerveau du fœtus, et la détermination de l'apoptose. Ensemble, ces techniques visuelles et textuelles peuvent être une source d'enquêter sur l'exposition prénatale de substances nocives dans le cerveau du fœtus.
Introduction
L'objectif des méthodes expérimentales décrites ici est d'évaluer les effets neuroprotecteurs de peptides trophiques dans un modèle d'exposition d'alcoolisation fœtale en utilisant plusieurs techniques concernant la reproduction, l'alimentation, microdissecting, et la détection de la mort cellulaire. Le travail de notre laboratoire a impliqué une diète liquide mélangé avec de l'alcool comme un modèle de consommation d'alcool modérée, ce qui pourrait être similaire à un paradigme à la consommation humaine en termes de la quantité d'alcool consommée 1-5. Nous et d'autres avons identifié trois peptides dérivés qui sont neuroprotecteur contre les effets délétères de l'exposition d'alcoolisme foetal. Les études portant sur l'exposition à l'alcool pendant les stades embryonnaires utilisant des modèles animaux peuvent conduire à l'identification des mécanismes potentiels de neuroprotection et de permettre le développement de procédures d'intervention. Cela peut fournir suffisamment d'informations sur les effets neuroprotecteurs et l'atténuation des effets délétères de l'exposition à l'alcool pendant la grossesse.
Prévention possible des effets de l'exposition prénatale à l'alcool peut impliquer le traitement des souris gravides avec des peptides qui ont été montrés pour être impliqués dans la neuroprotection in vitro et in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Parmi ces peptides, SALLRSIPA, connu sous le nom ADNF-9 ou SAL, est dérivé d'activité dépendant de facteur neurotrophique (ADNF) 7,10. Un autre peptide avec la séquence NAPVSIPQ peptide, appelé PAN, dérivé de la protéine neuroprotectrice dépendant de l'activité (ADNP) 6,11, a démontré un effet protecteur puissant contre le stress oxydatif associé à l'exposition à l'alcool 12,13. En outre, nous avons récemment identifié un nouveau peptide synthétisé, colivelin qui semble jouer un rôle clé neuroprotecteur dans le alcoolisation fœtale modèle d'exposition 2. Colivelin est composé de ADNF-9 et AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L'importance de l'utilisation de ces peptides, c'est qu'ils ont la capacité detraverser la barrière sang-cerveau pour prévenir les effets de l'apoptose induite par l'alcool et les déficits de croissance du cerveau.
Les méthodes expérimentales ont utilisé des souris C57BL / 6 pour tester les effets neuroprotecteurs contre l'apoptose induite par l'alcool. Nous avons adopté une fenêtre de 2 heures au lieu de reproduction pendant la nuit afin d'estimer avec précision le jour embryonnaire 0 (E0), car il peut être révélée par la détection d'un bouchon de sperme et un frottis vaginal 1-5. Nous avons utilisé une diète liquide avec des tubes d'alimentation, car cela est considéré comme libre accès au lieu de la livraison de l'alcool par voie gavage, ce qui peut induire un stress à des souris gravides. D'autre part, microdissection peut être difficile en raison de la douceur du tissu du cerveau du fœtus, ce qui peut être rencontrée en disséquant le cerveau du fœtus aux stades embryonnaires. Ici, nous montrons techniques visualisées pour faire face à tous les défis impliquant microdissection. En outre, depuis le sectionnement du cerveau du fœtus peut aussi être difficile, nous avons adoptéune technique qui consiste à intégrer le cerveau du fœtus en gélatine à l'aide pelable intégration des moules. Nous avons réussi à réduire le cerveau du fœtus dans les sections flottantes à 50 um d'épaisseur. Cela nous permet d'étudier des modifications de protéines contenu dans les sections du cerveau du fœtus, y compris l'identification de la mort cellulaire.
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Protocol
1. Animaux d'élevage et de traitement de peptide trophique
- Race C57BL/mice en plaçant les souris femelles (~ 6 semaines, poids moyen 20 g) dans les cages du mâle pendant 2 heures.
- Voir pour un bouchon de spermatozoïdes et / ou frottis vaginal immédiatement après.
- Si elle est positive, désigner ce point de temps que embryonnaire jour 0 (E0).
- Le E7, poids-match femelles gravides au contrôle et à des groupes de traitement (3 groupes) sont attribuées comme décrit récemment 4: 1) L'alcool (éthanol) groupe de diète liquide (ALC), 2) nourri en groupe contrôle (PF); 3) groupe de traitement peptide, qui devrait recevoir une injection intrapéritonéale (IP) de l'ADNF-9 peptide instar de l'alcool régime liquide d'exposition (ALC/ADNF-9). Les détails de la préparation de la SLA et les régimes PF et la procédure d'injections IP peuvent être trouvées dans notre récente 4 de travail.
- Mesurer alimentation quotidienne de liquide d'alcool qui peut être fourni que le libre accès comme la seule source de nutriments. Diète liquide PF attelé individuellement to un barrage ALC peut être mesurée tous les jours ainsi.
- Le volume de diète liquide consommé au cours des 24 heures précédentes peut être enregistré à partir de 30 ml gradué tubes à bouchon à vis et l'alimentation fraîchement préparée doit être fournie chaque jour à partir de E7 à E13.
2. Dissection du fœtus et microdissection cerveaux foetaux
- Le sacrifice des souris gravides sur E13 par euthanasie profondément les souris avec une procédure CO 2 suivie d'une dislocation cervicale.
- Nettoyer le site d'incision abdominale à l'éthanol 70%.
- Faire une incision abdominale à l'aide des ciseaux et des pinces stériles.
- Une fois l'abdomen est ouvert, disséquer l'utérus en le tenant avec une pince et en utilisant les autres pinces pour arracher le mésomètre loin de l'utérus. Assurez-vous de faire cette procédure lentement afin d'éviter de percer les embryons.
- Retirez les embryons de l'utérus et les transférer dans un plat de culture cellulaire (60 mm x 15 mm) contenant une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) dans de l'eau glacée.
- Disséquer le cerveau du fœtus à partir des embryons entiers sous loupe binoculaire pour microdissection.
- En utilisant des pinces ultra-fines pour microdissection, retirer la peau des embryons à la partie supérieure de la tête pour exposer le crâne.
- Une fois que le crâne est exposé clairement et visualisé sous la loupe binoculaire, microdissection, puis décoller le crâne à partir de la partie postérieure du cerveau à la moelle épinière et les zones du tronc cérébral.
- Assurez-vous de détacher la pièce de crâne par morceau d'arrière en partie antérieure de la tête.
- Une fois que le cerveau du fœtus sont exposés visuellement, procéder à leur extraction.
- Disséquer le cerveau du fœtus à partir de la base du bulbe olfactif ébauche à la base de la métencéphale.
- Postfix tout disséqué les cerveaux foetaux dans du paraformaldéhyde 4% pendant 2-3 jours. Vous pouvez également congeler les autres cerveaux foetaux de chaque barrage si vous les testez pour le Western Blot ou dosages enzymatiques.
3. Intégration Brains fœtus dans de la gélatine pour la coupe
- Préparer 10% de gélatine de catégorie A.
- Remplir un moule pelable intégration à mi-chemin et attendre que les solidifie gélatine.
- Placer le contrôle et fœtale cerveaux side-by-side traitée avant la naissance sur le dessus de la gélatine solidifiée. Cela permet de garder des conditions uniformes de détection immunologique de la mort cellulaire entre les deux groupes témoins et expérimentaux.
- Ajouter la gélatine liquide sur le dessus du cerveau du fœtus pour faire un moule complet (assurez-vous que la gélatine n'est pas trop chaud).
- Réfrigérer le moule de gélatine préparée qui détient le cerveau du fœtus pendant 15 min.
- Décollezle moule en plastique d'enrobage et ensuite transférer les pré-faites de gélatine contenant cerveau du fœtus dans du paraformaldéhyde 4% pendant deux jours.
- Lieu et partie fixe cerveau du fœtus en gélatine à l'aide vibratome machine à découpe (Leica VT 1000S) à 50 um d'épaisseur pour la coupe coronale. Cette épaisseur est testé dans nos études, car il offre de meilleures caractéristiques anatomiques. En outre, les épaisseurs de 25 um et plus peuvent également être testés avec cette technique impliquant intégrée de cerveau du fœtus en gélatine à 10%. Notez que les coupes coronales ont été coupés à l'aide vibratome au niveau de l'éminence des noyaux gris centraux du cerveau antérieur sur
- Recueillir les sections du cerveau du fœtus dans (PBS) solution saline tamponnée au phosphate.
- Montez les sections du cerveau du fœtus dans Superfrost majoré des diapositives dans l'eau.
- Sécher les sections montées pour 15 min.
- Placer les lames (monté avec les sections du cerveau du fœtus) dans PBS pour le test le lendemain de réaction TUNEL.
4. TUNEL réaction de Detection de la mort cellulaire ou apoptose
(TUNEL: TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale). Ce test vise à déterminer la mort cellulaire.
- Traiter les sections du cerveau du fœtus montés dans Superfrost plus diapositives avec la protéinase K (20 pg / ml) pendant 5 min à 37 ° C (300 pi de la protéinase K mixte dans 20 ml de PBS). Les lames sont assemblées en 5 Plend ouvert maile).
- Rincer les coupes de cerveau fœtal (montés dans les diapositives) avec PBS trois fois pendant 5 min sous orbital.
- Incuber les sections avec 3% de H 2 O 2 dans le méthanol pendant 10 min à température ambiante (3 ml 30% H 2 O 2 dans 27 ml de méthanol à 100%) (diapositives ne doivent pas être dans un shaker).
- Rincer sections avec PBS trois fois pendant 5 min dans un agitateur orbital.
- Incuber les coupes dans une solution de perméabilisation (0,1% Triton X-100 à 0,1% de citrate de sodium) pendant 2 minutes sur de la glace (4 ° C) (100 TritonX pi + 0,1 g de citrate de sodium + 99,9 ml distilléeeau d).
- Rincer sections dans PBS deux fois pendant 5 min dans un agitateur orbital.
- Zone sèche autour des sections dans les coulisses.
- Dessinez barrière sur des lames Superfrost majoré en utilisant Pen PAP. Ceci a pour but d'éviter toute fuite de la solution qui est utilisée pour traiter les articles pour la détection de cellules positives au TUNEL.
- Incuber les sections avec le mélange de réaction TUNEL (50 pl de la bouteille 1 et 450 ul de la bouteille 2) pendant 1 heure à 37 ° C, la commande sera utilisé par incubation dans une solution de la bouteille 2.
- Rincer avec du PBS trois fois 5 minutes sous Orbit shaker.
- Zone sèche autour du tissu.
- Incuber les coupes avec convertisseur-POD pendant 30 min à 37 ° C.
- Rincer les sections trois fois pendant 5 minutes avec Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M).
- Incuber les sections pour 7 min à 0,05% de tétrachlorhydrate 3'-3 '-diaminobenzidine (DAB) et 0,003% de H 2 O 2 (25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 pi 3% de H 2 0 2 + 500 DAB ul) Sous Oribtal agitateur à 4 ° C (dans la glace) et dans l'obscurité (assurez-vous d'effectuer cette procédure à nouveau 5 Plend ouvert mailer).
- Rincer les sections avec PBS trois fois 5 minutes sous orbital.
- Gardez les sections de lames dans du PBS pour pas plus de 24 heures dans du PBS, puis de les traiter pour la coloration de Nissl comme indiqué dans le protocole de la prochaine section.
Note: DAB est un cancérogène. Utiliser des gants et nettoyer tous les plats utilisés avec l'eau de Javel une fois fini avec toutes les expériences.
5. Coloration Nissl pour la préparation de coupes de cerveau fœtal pour l'observation microscopique
- Procédure de coloration Nissl doit être effectuée sous une hotte de sécurité biologique.
- Rincer les sections des diaporamas avec de l'eau déminéralisée pendant 2 min.
- Incuber les sections de l'éthanol à 70% pendant 2 min.
- Incuber les sections dans l'éthanol à 95% pendant 6 min.
- Incuber les sections de l'éthanol à 70% pendant 2 min.
- Rincer les sections déminéralisée water pendant 2 min.
- Incuber les sections de crésyl violet Stain pendant 3 min.
- Rincer les sections dans l'eau déminéralisée pendant 2 min.
- Incuber les sections de l'éthanol à 70% pendant 2 min.
- Incuber les sections dans 95% d'éthanol + 3 ml d'acide acétique glacial pendant 3 min.
- Incuber les sections dans l'éthanol à 95% pendant 2 min.
- Incuber les sections dans l'éthanol à 100% pendant 2 min trois fois.
- Incuber les sections dans le xylène pendant 10 minutes trois fois.
- Diapositives détenant les sections du cerveau du fœtus peuvent être montés à l'aide Permount et des lames de verre de glissement de couverture.
- Laisser le diapositives montées nuit avant l'observation et l'analyse microscopique.
- Observation et microphotographies au microscope peuvent être réalisées en vertu de Leica microscope droit.
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Representative Results
Les méthodes expérimentales décrites ici montrent qu'une fenêtre de sélection de 2 heures est essentielle pour estimer stade gestationnel précis. Nous avons démontré la dissection des embryons à l'âge de E13. Nous avons également démontré microdissection du cerveau fœtal à E13. La procédure comporte plusieurs étapes (AC), tel que décrit dans la figure 1. Cerveau du fœtus sont disséqués à partir de la base du bulbe olfactif de primordium à la base de la métencéphale (Figure 1). Cerveau du fœtus sont ensuite fixés dans du paraformaldéhyde 4% pour la détection immunochimique. Après fixation, les cerveaux foetaux sont noyées dans 10% de gélatine et préparés pour vibratome sectionnement tel que décrit dans la figure 2. Notez que, étape par étape intégration de cerveau du fœtus a été réalisée à faible grossissement. Cerveau fœtal intégrés peuvent être visualisés à plus fort grossissement de la figure 1. En outre, des coupes de cerveau fœtal coronale au niveau de l'éminence ganglionnaire sur le cerveau antérieur peutêtre obtenu en utilisant le vibratome et monté dans des glissières pour la détection immunohistochimique. Il s'agit du nombre de cellules TUNEL-positives (Figure 3). Nous montrons ici que l'exposition prénatale à l'alcool augmente dans les cellules TUNEL-positives dans éminence ganglionnaire (Figure 3b) induite par rapport au groupe contrôle PF (Figure 3a). ADNF-9 administration réduit de manière significative augmentation induite par l'alcool dans les cellules TUNEL-positives (Figure 3c et 3d) par rapport au groupe ALC.
Figure 1. Microdissection du cerveau fœtal à E13. Stages ac spectacle, étape par étape la procédure s à partir d'embryons de cerveau du fœtus disséqués. A) contrôle disséqué (PF) et l'alcool (ALC) exposés pendant la période prénatale des embryons. B) c) cerveau du fœtus disséqués de PF et groupes ANS.
Figure 2. Méthode pour l'intégration des cerveaux foetaux pour la coupe. Stages (ae) montrent procédures étape-par-étape de la préparation de l'intégration des cerveaux foetaux au réglage du bloc de gélatine dans l'objet pour la coupe vibratome a.) Peel-away moules intégration rempli à mi-chemin avec de la gélatine, b) à partir de cerveaux foetaux contrôle PF et groupes ALC sont placés côte-à-côte dans le moule et recouvertes de gélatine, c) de pelage moule enrobage coupé à quatre côtés, d) cerveau foetal noyées dans de la gélatine et prêt qui sera fixée dans Paraformaldéhyde e) GEmoule latin contenant cerveau du fœtus sont placés dans l'objet pour vibratome sectionnement.
Figure 3. Effets de peptide neurotrophique, ADNF-9, contre l'apoptose induite par l'alcool en utilisant un dosage TUNEL dans éminence ganglionnaire à E13 scène. L'exposition prénatale à l'alcool augmente dans la mort cellulaire induite comme indiqué par des flèches dans le groupe ALC (b) par rapport au groupe PF (a). ADNF-9 administration aux côtés de l'exposition prénatale à l'alcool a montré diminution des cellules TUNEL-positives (c). Les analyses statistiques ont démontré que ADNF-9 administration empêché alcool augmente-induite dans les cellules TUNEL-positives (d). Les valeurs sont indiquées en tant que moyen ± SEM. * P <0,05; ** p <0,01 (de test post hoc de Newman-Keul). N = 4 pour chaque groupe. Barre d'échelle = 100 um. Reproduit de la publication (4), avec la permission de ElSevier (licence # 2904310752995).
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Discussion
La méthodologie et la technologie présentée dans cette étude mettent en évidence les effets de l'exposition prénatale à l'alcool dans le cerveau du fœtus et le rôle des peptides trophiques dans la prévention de ces effets. Ceux-ci peuvent fournir des informations sur la façon d'étudier d'autres drogues ou d'autres substances chimiques toxiques dans le cerveau du fœtus au cours des différentes étapes de la grossesse.
En ce qui concerne le paradigme de reproduction, dans certains cas, la détection de la prise du sperme pourrait ne pas être observable. À ce stade, il est important de tester le frottis vaginal dans une diapositive sous observation microscopique, qui peut fournir des spermatozoïdes possible détection positive.
Il est précisé dans cette étude que l'alimentation implique le libre accès des diète liquide contenant le contrôle PF et l'alcool. Au moins 30% d'humidité et une température ne dépassant pas 22-24 ° C sont nécessaires pour surveiller la qualité de l'alimentation au cours de la 24-hr accès gratuit au 1,2 de régime. Il est également nécessaire que l'diète être préparé frais tous les jours. Les tubes d'alimentation doivent être nettoyés après chaque utilisation.
Il est difficile de microdissection du cerveau du fœtus. Ceux-ci dépendent du stade embryonnaire testé. Par exemple, le cerveau du fœtus disséqués à l'âge de E13 peuvent être difficiles à traiter par rapport au cerveau du fœtus disséqués à E18. Cela est dû au fait qu'au E18, le cerveau du fœtus sont bien développés et le crâne devient facile à retirer par rapport à E13, lorsque le crâne est encore mou et difficile à enlever. À ce stade, en disséquant le cerveau du fœtus au E13, il est important de retirer le crâne pièce par pièce comme démontré dans la vidéo fourni avec ce manuscrit.
En ce qui concerne intégration cerveau du fœtus en gélatine, nous avons constaté que c'est la meilleure technique pour obtenir des sections qui sont prêts à être utilisés pour l'analyse immunohistochimique. Afin d'avoir une meilleure coupe du cerveau du fœtus, il est important que la fixation au paraformaldéhyde 4% de labloc de gélatine contenant le cerveau du fœtus est terminée. Ainsi, cela peut prendre au moins deux jours, et le bloc de gélatine pourrait être prêt pour la coupe de la troisième journée. L'épaisseur des sections est également un facteur; 50 um d'épaisseur est généralement testés pour la détection immunochimique comme TUNEL essai 1,2,4. Toutefois, des épaisseurs de 25 um et plus peuvent également être testés.
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Disclosures
Pas de révélations à faire.
Acknowledgments
Ce projet de recherche a été soutenue par Nombre de prix R21AA017735 (YS) des Instituts national sur l'abus d'alcool et l'alcoolisme. Le contenu relève de la seule responsabilité de l'auteur et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national sur l'abus d'alcool et l'alcoolisme ou de la National Institutes of Health. L'auteur tient également à remercier Charisse Montgomery pour éditer ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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