Summary
En ribosomalt RNA (rRNA) utarmning protokoll utvecklades för att berika budbärar-RNA (mRNA) för RNA-punkter i mygga tarmen metatranscriptome. Exempel specifika rRNA sonder, som används för att avlägsna rRNA via subtraktion, skapades från mygga och dess mikrober gut. Utförande av protokollet kan resultera i avlägsnande av ungefär 90-99% av rRNA.
Abstract
Mygga tarmen rymmer dynamiska mikrobiella samhällen i olika stadier av insektens livscykel. Karakterisering av den genetiska kapacitet och funktionalitet i tarmen samhället kommer att ge inblick i effekterna av tarmfloran på mygga livet egenskaper. Metagenomic RNA-Seq har blivit ett viktigt verktyg för att analysera transcriptomes från olika mikrober som finns i en mikrobiell gemenskap. Budbärar-RNA innefattar vanligen endast 1-3% av totalt RNA, medan rRNA utgör cirka 90%. Det är en utmaning att berika budbärar-RNA från en metagenomic mikrobiell RNA-prov eftersom de flesta prokaryota mRNA saknar stabila poly (A) svans. Detta förhindrar oligo-d (T) isolering medierad mRNA. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar prov härlett rRNA fånga prober för att avlägsna rRNA från en metagenomic total RNA-prov. Till att börja med är både mygga och mikrobiella små och stora subenhet fragment rRNA amplifieras från en metagenomic gemenskap DNA-prov. Därefter kommunikapens specifika biotinylerade antisens ribosomalt RNA-prober syntetiseras in vitro med användning av T7 RNA-polymeras. De biotinylerade rRNA prober hybridiserades till totalt RNA. Hybriderna fångas av streptavidin-belagda pärlor och avlägsnas från totalt RNA. Detta subtraktion-baserat protokoll avlägsnar effektivt både mygg och mikrobiell rRNA från hela RNA-prov. MRNA berikade provet bearbetas vidare för RNA förstärkning och RNA-sekvens.
Introduction
Nästa generations sekvensering teknik har kraftigt framåt metagenomik studie genom att bedöma Artsammansättning och genetisk funktionalitet i en mikrobiell samling. RNA-sekvensering (RNA-Seq) 1 kan kringgå kultur-baserade metoder för att undersöka mikrobiella metatranscriptomes i olika sammanhang 2-5. Ett stort hinder för mikrobiell RNA-seq är svårigheten att berika mRNA, som prokaryota mRNA inte stabilt polyadenyleras. Därför är oligo-d (T)-medierad budbärare anrikning inte tillämplig. Avlägsnande av riklig rRNA är ett alternativt tillvägagångssätt för att berika mRNA. Kommersiella rRNA utarmning kit, såsom Microexpress Bakteriell mRNA Anrikning sats (Ambion), RiboMinus Transkriptomanalys Isolation Kit (Bakterier) (Life Technologies), och mRNA-ONLY Prokaryot mRNA Isolation Kit (Epicentre) som företrädesvis bryter ned rRNA med ett exonukleas, har använts för avlägsnande rRNA 6-8. Men den infångningsprober i Microexpresseller RiboMinus är bra för att ta bort kända rRNA från typiska grampositiva och gramnegativa bakterier (se tillverkarens specifikationer), men mindre kompatibel med rRNA från okända mikrober. Följaktligen kan avlägsnandet vara mindre effektiva för metagenomic prover 8-10. Dessutom var mRNA överflöd trohet ifrågasättas när exonukleasbehandling tillämpades 11. Sammantaget var subtraktion-baserade rRNA utarmning mindre partisk och mer effektiva i mRNA-anrikning i metagenomic inställningar 10-13.
Mygga tarmen rymmer en dynamisk mikrobiell gemenskap 14. Vi är intresserade av att karakterisera funktionen av mygga tarmen microbiome med RNA-Seq. I en RNA-prov isolerat från mygga inälvor, både mygga och mikrobiella RNA är närvarande. Här beskriver vi ett modifierat protokoll som ska användas samhället specifika rRNA sonder att effektivt bryter mygga och mikrobiell rRNA genom subtraktiv hybridisering. Den resulterande mRNAberikade prover är lämpliga för RNA-sekvens. Den totala arbetsflödet visas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tillvägagångssätt
1. Mygga Uppfödning
- Bakre mygga Anopheles gambiae G3 stam i en insectary vid 27,5 ° C med 80% luftfuktighet och 12:12 HR-cykeln av ljus / mörker.
- Feed larver med marken kattmat med öljäst på förhållandet 1:1.
- Feed vuxna myggor på möss blod vid dag 3 efter uppkomst för äggproduktion.
2. Mygga Gut Dissektion
- Autoklav dissekering verktyg (diabilder och pincett).
- Samla 50 myggor med en sug och placera dem på CO 2 flöde säng (Ultimate Flypad). Skölj en mygga prov sekventiellt i tre petriskålar innehållande 70% etanol för att rengöra mygga kroppsytan.
- Placera provet på en glasskiva under stereomikroskopi. Ta bort tarmen.
- Samla 50 tarmar per förutsättning för metagenomic DNA-isolering. Samla 50 tarmar per förutsättning för metagenomic RNA-isolering. 3. Metagenomic DNA Isolering
- Placera 50 mygga tarmar i 300 ul TE. Homogenisera dem under 1 min med användning av Bio-Gen PRO200 homogenisator (PRO Scientific Inc., USA) vid varvtal 2.000 rpm på is.
- Tillsätt 2 pl av Ready-Lyse lysozymlösning och 1 pl RNas A till cellsuspensionen. Blanda genom att vortexa och inkubera vid 37 ° C under 30 minuter.
- Lägg 300 pl Meta-lyseringslösning (2X) och 1 pl proteinas K till röret. Omskakas. Kortfattat puls-centrifugera röret för att säkerställa att all lösning är i botten av röret, och inkubera vid 65 ° C under 15 minuter, kyl till rumstemperatur, placera sedan på is under 3-5 minuter.
- Tillsätt 350 | il av MPC proteinutfällning Reagens till röret och omskakas kraftigt i 10 sek.
- Pellet than debris genom centrifugering under 10 min vid 12.000 xg vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett rent 2-ml provrör, och kassera pelleten.
- Lägg 570 pl isopropanol till supernatanten. Blanda genom att vända röret flera gånger.
- Pelletera DNA: t genom centrifugering under 10 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C. Avlägsna isopropanolen utan att rubba DNA-pelleten.
- Lägg 500 pl 75% etanol för att tvätta pelleten. Centrifugera i 5 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C. Avlägsna etanolen utan att störa DNA-pelleten. Lufttorka pelleten vid rumstemperatur under 2 minuter. OBS: Dra inte torr DNA pelleten.
- Återsuspendera DNA-pelleten i 50 pl TE-buffert.
- Bekräfta storleken av det isolerade DNA: t genom jämförelse med den Fosmid kontroll-DNA (40 kb, 100 ng / ^ il) i kitet, genom gelelektrofores på en 1% agarosgel.
- Sätt 50 mygga tarmar i en 2-ml rör med 500 pl TriPure Isolering reagens. Homogenisera under 1 minut vid hastighet 2.000 rpm på is med användning av en homogenisator. Låt sitta vid RT under 5 min för att tillåta dissociation av nukleoprotein komplex.
- Tillsätt 100 | il kloroform och vortexblanda i 12 sekunder, och låt stå vid RT under 2 minuter.
- Centrifugera vid 10.000 xg under 10 minuter. Ta försiktigt ut tuben utan att störa separerade faser.
- Överför vattenfasen till ett nytt rör, tillsätt 250 ul isopropanol, blanda väl och sätta vid -20 ° C i 20 minuter.
- Centrifugera vid 12.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att fälla ut RNA.
- Kasta bort vätskefasen utan lossnar pellet. Tvätta pelleten med 750 pl 75% etanol.
- Pipettera av supernatanten utan att störa pelleten. ENir torka röret under 2 min.
- Resuspendera RNA med 30 pl nukleasfritt vatten.
- Behandla det totala RNA med DNas vid 37 ° C under 20 minuter, och sedan inaktivera DNas genom inkubering vid 75 ° C under 15 minuter. Fällning RNA med etanol och återsuspendera-RNA i 30 pl nukleasfritt vatten.
- Bestäm mängden totalt RNA med hjälp av en NanoDrop.
- PCR-amplifiering av ribosomala RNA-genfragment
Detta steg skapar prov-specifika rRNA pooler, som kommer att användas som mallar för in vitro-transkription för att producera antisense ribosomala RNA (arRNA) prober som är komplementära till rRNA i den totala RNA-prov.- Design och syntetisera primeruppsättningar för rRNA fragment PCR (tabell 1).
- Kör PCR i 50il reaktion med användning av Taq DNA-polymeras (Qiagen) med 50 ng DNA-templat, 1 x PCR-buffert, 1,5 mM Mg 2 Cl, 0,2 pM primrar med 35 cykler av denaturering vid 94 ° C under 10 sekunder, annealing 15 sek vid 40 ° C under bakteriell 23S amplikon, och 50 ° C för de övriga amplikoner, och sträcker sig vid 72 ° C under 1 min (slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 minuter).
- Se PCR-produkter på 1% agarosgel.
- Rena PCR-produkter med hjälp av QIAquick PCR-reningskit med eluering i 50 pl elueringsbuffert. Kvantifiera koncentrationen med NanoDrop.
- In vitro-transkription av biotin-märkta anti-sense rRNA prober (arRNA). Obs: I detta steg är exempel specifika sönder från olika rRNA amplikoner syntetiseras med MEGAscript T7 kit.
- Inrätta en 20 pl reaktion för varje prov specifik rRNA amplikon genom att blanda nedanstående ingredienser (tabell 2). Inkubera över natten vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 pl DNas I (ingår i satsen) till reaktionsblandningen och inkubera vid 37 ° C under 20 minuter för att avlägsna DNA-schablonen.
- Tillsätt 100 | il 100% etanol till reaktionen, centrifugen vid 12.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att fälla ut syntetiserat arRNA. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 750 ul 75% etanol. Resuspendera RNA-sonder i 50 ul nukleas fritt vatten.
- Kvantifiera RNA-koncentrationen med hjälp av en NanoDrop. Förvara prober vid -80 ° C.
- Inrätta en 20 pl reaktion för varje prov specifik rRNA amplikon genom att blanda nedanstående ingredienser (tabell 2). Inkubera över natten vid 37 ° C.
- rRNA subtraktion med biotinylerad arRNA. Obs: Detta steg använder biotinylerade arRNA att hybridisera till rRNA i den totala RNA-prov. RRNA-hybrider arRNA fångas av streptavidin-belagda magnetiska pärlor. Förfarandet är baserat på protokollet som beskrivs i referens 13 med mindre modifiering.
- Reagens
- Bered 0,1 N NaOH, 20X natrium kloride-citrat (SSC) och 1 X SSC med 20% formamid.
- Hybridisering
- Blanda 1 ig totalt RNA med bakteriella 16S och 23S prober (0,75 pg vardera), 18S mygga och 28S prober (0,75 pg vardera), 1 ul RNas-inhibitor, 2,5 | il 20X SSC-buffert, 10 | il 100% formamid i en 200 pl PCR-rör , tillsätt nukleasfritt vatten till 50 pl.
- Placera reaktionsröret i en termocykler och inkubera vid 70 ° C under 5 minuter att öppna sekundär struktur och ramp ned till 25 ° C med användning av 5 ° C steg under vardera 1 min ° C för att tillåta hybridisering av rRNA och arRNA prober.
- Avlägsnande av rRNA
- Överför 300 pl streptavidinbelagda pärlor i en 1,7 ml rör. Placera röret på en magnetisk separation rack immobilisera pärlorna. Avlägsna supernatanten. Återsuspendera pärlorna i 300 pl 0,1 N NaOH och kmX väl. Placera röret tillbaka till den magnetiska kuggstången och pipettera bort supernatanten. Återsuspendera pärlorna i 300 pl 1 x SSC, blanda väl, immobilisera pärlorna och pipettera bort supernatanten. Upprepa tvätten med 300 pl 1 x SSC en gång.
- Gör 3 portioner av pärlor, 100 pl vardera i 1,7 ml rör. Placera röret på den magnetiska rack, och avlägsna supernatanten genom pipettering. Obs: alikvoter av pärlorna används för 3 rundor att fånga biotinylerade rRNA-arRNA hybrider.
- Tillsätt 50 pl 1X SSC med 20% formamid i 50 pl hybridiseringsreaktionen. Överför reaktionsblandningen till den första vulsten alikvoten röret och blanda väl. Inkubera vid RT under 10 min för att tillåta de biotinylerade sond-rRNA-hybrider att fångas upp av streptavidinpärloma. Snärta röret var 2 minuter för att blanda under inkuberingen.
- Placera röret på den magnetiska rack immobilisera pärlorna, överföra supernatanten till den andra aliqUOT av pärlor, blanda väl och inkubera enligt ovan. Genomför den tredje fånga genom att överföra supernatanten i det tredje röret av pärlor. Blanda och inkubera.
- Överför icke-rRNA supernatanten till ett nytt rör och uppförande rening med RNeasy MinElute kit att ta bort formamid följa tillverkarens bruksanvisning.
- Kontrollera rRNA utarmning effektiviteten genom att använda en Agilent-RNA 6000 kit Pico chip på en Bioanalyzer (Figur 4).
- Reagens
Obs: Metagenomic DNA isoleras med hjälp av Meta-G-Nome DNA Isolation Kit (Epicentre Biotechnologies) med modifieringen som beskrivs nedan.
4. Totalt RNA-isolering
Notera: Rengör arbetsområdetmed RNaseZap att minimera RNas kontamination. Metagenomic RNA isolerades från mygga tarmen prover med hjälp av reagens TriPure Isolering (Roche) med en mindre modifiering.
5. Ribosomalt RNA Utarmning
Obs: Protokollet har utvecklats baserat på tidigare beskrivna metoder 12,13,15.
Obs! RRNA utarmade RNA prover är föremål för mRNA förstärkning om det behövs 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet innehåller tre delar: (1) beredning av metagenomic DNA mallar för rRNA PCR, (2) skapa prov prober fånga rRNA, (3) utarmning av rRNA från total RNA genom subtraktiv hybridisering. Isolering av hög kvalitet metagenomic DNA och RNA är nödvändig för hela processen. Den modifierade Meta-G-Nome DNA-isolering protokoll ger högkvalitativ metagenomic DNA från mygga inälvor, såsom visas i figur 2. Det kan vara svårt att isolera högkvalitativa total RNA från mygga inälvor. Detta är sannolikt på grund av närvaron av olika enzymer, inklusive RNas, i mygga tarmar. Vi jämförde den totala RNA-extraktion prestanda Qiagen RNA isolering kit till Roche TriPure. Elektroferogram av Agilent Bioanalyzer visade att de totala isolerade RNA med TriPure innehåller tydliga rRNA toppar (figur 3), vilket inte ses i RNA erhålls med Qiagen-kit. Kanske mygga-derived RNas är inaktiverar effektivtd av fenol i TriPure. Vanligtvis 50 mygga tarmar avkastning ~ 20 ug totalt RNA. Det ideala mängden totalt RNA ingång för den aktuella rRNA utarmning processen är ~ 1 ng, vilket optimerar effektiviteten av rRNA subtraktion och ger ~ 150 ng renat RNA. Figur 4 visar en jämförelse av RNA elektroferogram före och efter rRNA subtraktion. Den rRNA avlägsnas effektivt medan de icke-rRNA arter kraftigt anrikad på de återstående RNA. Närvaron av stora storlek RNA (> 2.000 bp) indikerar en god kvalitet av anrikat mRNA (figur 4B). Protokollet kan skalas upp för att rymma en större ingång av RNA för bearbetning. Vanligtvis 5 pg RNA erfordras för RNA-seq processen. Därför använde vi MessageAmp II-bakterier RNA-amplifiering Kit för att generera en tillräcklig mängd rRNA utarmat RNA för RNA-Seq. Vi rekommenderar att du använder 150 ng eller mer renade RNA för RNA förstärkning för att säkerställa trohet förstärkning. Detta protokoll har applIED till en mygga gut-RNA-Seq-projektet. RRNA utarmning var faktiskt uppnås genom att använda prov härledda infångningssökfragment. Andelen rRNA läser i RNA-Seq utgång fyra prover Tabell 3 listor. Två socker-fed och två blod-matade prover gut behandlades för utarmning och RNA-sekvens. Den Illumina sekvensering genererade 23-24M läser för varje prov. RRNA subtraktion avlägsnas effektivt 90-99% rRNA från både mygga vävnad och mikrober i tarmen proverna. Utarmning var nästan fullständig i socker-matade tarmprover och 6,12-10,98% rRNA kvar i blod-matade prov (tabell 3).
| Amplicon | Framåt 5'-3 ' | Omvänd 5'-3 ' |
| Bakteriella 16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| Bakteriella 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| Mosquito 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| Mygga 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
Tabell 1. Primeruppsättningar för rRNA Bakteriella fragment amplifiering 16S och 23 primrar utformas baserat på 20,19. T7 promotorsekvenser är i fetstil.
| 2 pl | |
| PCR-produkterna (0.5-1 pg) | 1,5 pl |
| ATP (75 mM) | 2 pl |
| GTP (75 mM) | 2 pl |
| CTP (75 mM) | 1,5 pl |
| UTP (75 mM) | 1,5 pl |
| Biotin-11-CTP (10 mM) | 3,75 pl |
| Biotin-16-UTP (10 mM) | 3,75 pl |
| T7 RNA-polymeras | 2 pl |
Tabell 2. Komponenter i in vitro-syntes av rRNA prober.
| Prov | Totalt läser | Mygga rRNAläser (%) | Mikrobiella 16S läser (%) | Mikrobiell 23S läser (%) | Totalt% av rRNA läsningar * |
| SM1 | 24.341.850 | 121,987 (0.50) | 3,717 (0.02) | 6,810 (0.03) | 0,54 |
| SM2 | 23.487.202 | 114,430 (0.49) | 30,271 (0.13) | 38,261 (0.16) | 0,78 |
| BM1 | 23.438.304 | 265,433 (1.13) | 2,054,777 (8.77) | 253,051 (1.08) | 10,98 |
| BM2 | 24.212.240 | 110,240 (0.46) | 1,186,423 (4.90) | 185,074 (0.76) | 6,12 |
Tabell 3. Statskaper av rRNA läser i RNA-seq utgång. SM: socker utfodras gut, BM: blod matas gut. *: Summan av procentandelar av mygga rRNA och mikrobiell rRNA läser.
Figur 1. Flödesschema som visar stegen i förfarandet metagenomic DNA och RNA isolering, rRNA infångningsprob syntes, hybridisering och fånga pärlor baserade utarmning.
Figur 2. Metagenomic DNA-isolering. DNA-prover separerades på 1% agarosgel. 1, Fosmid DNA (40KB), 2, Mosquito gut metagenomic DNA.
Figur 3.Jämförelse av två totalt RNA isolering reagenser för sin effektivitet i att extrahera en kvalitet RNA från mygga tarmen. Overlay av elektroferogram visar att totalt RNA från TriPure isolering (i blått) hade rRNA toppar och breda RNA distribution medan från Qiagen isolering (i rött) hade inga tydliga rRNA toppar.
Figur 4. Effektivitet i rRNA utarmning. Elektroferogram visar totala RNA före (A) och efter (B) rRNA utarmning. RRNA topparna avlägsnas effektivt. RNA större än 4KB kvar i rRNA utarmat prov. RNA-koncentrationen var 107,6 ng / pl i (A) och 8,6 ng / | il i (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En komplex mikrobiella bosatt i mygga tarmen ekosystem 14,16,17. Metatranscriptomic sekvensering (RNA-seq) kan avslöja kontextberoende funktionell information genom att fråga hela mikrobiella transkriptom 4,18. Tekniskt är oligo-d (T)-medierad anrikning av prokaryot mRNA inte tillämplig på grund av frånvaron av stabila poly (A) svansar budbärarna. Alternativt har rRNA utarmning använts för mRNA-anrikning. Här utvecklade vi en subtraktion-baserat protokoll för att tömma rRNA med rRNA sonder som görs från egen metagenomic DNA i mygga tarmen mikrobiella samhället. Effektiviteten hos rRNA borttagning beror på vilken täckning av rRNA infångningsprober som genereras av rRNA PCR. Den glödgning effektiviteten av olika primeruppsättningar inriktning konserverade regioner varierar mellan olika taxa 19. Därför rekommenderar vi försöker olika kombinationer av primers på metagenomic prover och sedan förena derRNA produkter för att maximera täckningen. I vår procedur skapar vi infångningssökfragment genom att kombinera rRNA PCR-produkter av två framåt och två omvänd primers, som kan bilda 4 kombinationer av primeruppsättningar (tabell 1). Dessutom avser rRNA för att bilda en sekundär struktur. Jämfört med full längd rRNA som prober 13, mindre rRNA fragment har en lägre tendens att bilda sekundär struktur, som kan underlätta hybridiseringen av infångningssonder till provet rRNA. De biotinylerade sonderna hybridiserar effektivt till rRNA i den totala RNA-prov och hybriderna avlägsnas genom att fånga med streptavidinbelagda pärlor. Förfarandet avlägsnar det mesta av rRNA (Figur 4). I de fyra proverna som vi har bearbetat, var 90-99% av rRNA effektivt uttömda (tabell 3). Detta förfarande kan modifieras ytterligare för en mängd olika insekter associerade microbiome studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag 1SC2GM092789-01A1, och MS var en forskaren i NMSU Howard Hughes Medical Institution Grundutbildning forskningsprogram. Videoen riktades och producerad av Amy Lanasa och samordnas av Dr Philip Lewis med Creative Media Institute i NMSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
