Summary
核糖体RNA（rRNA）的消耗协议的开发是为了丰富信使RNA（mRNA），RNA-seq中蚊子的肠道metatranscriptome的。由蚊子和其肠道微生物样品的具体rRNA探针，用于去除rRNA基因通过减法，创建了。协议的性能的影响，可能会导致在约90-99％的rRNA基因的去除。
Abstract
蚊子肠道适应动态的微生物群落昆虫的生命周期的不同阶段之间。表征的遗传能力和功能的肠道社区将提供洞察肠道菌群的影响蚊子的生命特质。宏基因组RNA序列分析转录从各种微生物，微生物群落，已经成为一个重要的工具。信使RNA通常仅包括1-3％的总RNA，而rRNA基因构成约90％。它是具有挑战性的丰富信使RNA从宏基因组微生物的RNA样品的原核表达，因为大多数物种缺乏稳定的poly（A）尾巴。这可以防止寡聚d（T）介导的mRNA隔离。在这里，我们描述了一个协议，采用衍生rRNA基因的捕获探针删除rRNA基因从宏基因组总RNA样品的样品。首先，蚊子和社区从宏基因组DNA样品的微生物和大亚基rRNA基因片段的扩增。然后，在交流了nity特定的生物素化的反义核糖体RNA的探针使用T7 RNA聚合酶在体外合成。的生物素化的rRNA基因探针杂交的总RNA。杂交捕获由链霉亲和素包被的磁珠，从总RNA中移除。基于此减法协议有效地消除蚊子和从总RNA样品中的微生物的rRNA。 mRNA的富集样品被进一步处理的RNA扩增和RNA序列。
Introduction
新一代测序技术已经极大地推进了宏基因组学研究评估的分类组成和遗传功能的微生物组合。 RNA测序（RNA-Seq的）可以绕过文化为基础的方法，，调查微生物metatranscriptomes在不同的情况下2-5。微生物的RNA-seq的一个主要障碍是丰富表达的困难，没有稳定的聚腺苷酸化的原核细胞的mRNA分子。因此，寡d（T）介导的信使富集是不适用的。删除丰富的rRNA基因是一种替代方法来丰富表达。耗竭商业rRNA基因包，如细菌的mRNA Microexpress富集试剂盒（Ambion），RiboMinus转录分离试剂盒（细菌）（Life Technologies公司），和的mRNA-ONLY原核mRNA分离试剂盒（震中）优先降解与核酸外切酶的rRNA基因，已经使用了除去rRNA的6-8。然而，捕获探针Microexpress或RiboMinus用于除去已知的rRNA从典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（参见制造商的规格）是良好的，但不兼容从未知的微生物与rRNA。因此，去除效率可能较低宏基因组样品8-10。此外，mRNA丰度的保真度是有问题的核酸外切酶处理时，适用11。总体而言，基于减法rRNA基因消耗较少偏见的和更有效的宏基因组的基因富集设置10-13。
蚊子肠道容纳一个充满活力的微生物群落14。我们有兴趣在蚊子的肠道微生物利用RNA-Seq的功能特征。在一个分离的RNA样品由蚊子胆量，蚊子和微生物的RNA存在。在这里，我们描述了修改后的协议，使用社区的具体rRNA探针能够有效地消耗蚊子和微生物的rRNA基因消减杂交技术。所得mRNARNA-Seq的丰富的样本是适当的。在图1中示出的整体的工作流。
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Protocol
程序
1。蚊子饲养
- 后蚊子冈比亚按蚊 G3在养虫株为27.5°C，湿度80％，光/暗周期12:12小时。
- 与啤酒酵母的比例为1:1与地面的猫粮喂养幼虫。
- 对小鼠血后第3天出现产蛋饲料成蚊。
2。蚊子肠道解剖
- 高压灭菌器的清扫工具（幻灯片和钳）。
- 使用抽气收集50个蚊子，把它们放在CO 2流床（终极Flypad）。冲洗顺序在3个培养皿中含有70％的酒精擦拭蚊子体表面的蚊子标本。
- 放置下的立体显微镜载玻片上的检体。删除肠道。
- 收集50个胆为条件宏基因组DNA的提取。收集50个胆量每宏基因组RNA的提取条件。 3。宏基因组DNA的提取
- 将50个蚊子胆300μLTE。匀化1分钟使用生物根PRO200匀浆器（PRO科学公司，美国）在转速2000rpm下在冰上。
- 的准备裂解溶菌酶溶液中加入2μl和1μl核糖核酸酶A在细胞悬浮液。混合涡旋和孵化，在37°C 30分钟。
- 加入300微升元裂解液（2X）和1μl蛋白酶K的管。预混液。简言之脉冲离心管，以确保所有的解决方案是在该管的底部，并在65℃孵育15分钟后，冷却至室温，然后放置在冰上3-5分钟。
- 加入350微升的的MPC蛋白质沉淀试剂管和混合剧烈振荡，持续10秒。
- 颗粒吨他碎片通过离心分离10分钟，以12,000 xg在4℃下
- 将上清液转移到一个干净的2毫升管中，并弃去沉淀。
- 向上清液中加入570微升异丙醇。混合通过反转管几次。
- 通过以12,000 xg离心10分钟沉淀DNA在4℃下不松脱DNA沉淀的情况下，除去异丙醇。
- 加入500微升的75％乙醇洗涤沉淀。在4℃下以12,000 xg离心5分钟除去乙醇，而不会干扰DNA沉淀。空气干燥的颗粒在室温下2分钟。注意：不要过度干燥DNA沉淀。
- 在50μl的TE缓冲液中重悬DNA沉淀。
- 验证的大小比较（40 kb的100纳克/微升），在试剂盒中提供的的F粘粒控制DNA的分离的DNA，通过凝胶电泳，在1％琼脂糖凝胶电泳。
- 把蚊子胆50 2毫升试管中用500μlTriPure的隔离试剂。均化1分钟，在转速2000rpm下使用均化器在冰上。静置5分钟，以允许在RT核蛋白复合物的离解。
- 加入100μl氯仿和旋涡，持续12秒，2分钟，静置在RT。
- 离心10,000 xg离心10分钟。管小心地取出，而不会干扰相分离。
- 水相转移到新管中，加入250μl异丙醇，充分混匀，并在-20°C 20分钟。
- 离心机在4℃下以12,000 xg离心10分钟以沉淀RNA。
- 弃上清没有撞出颗粒。 750μL75％乙醇洗涤沉淀。
- 用移液管除去上清液，而不会干扰沉淀。一红外干燥管，持续2分钟。
- 重悬的RNA 30μL无核酸酶的水。
- 治疗的总RNA用DNase在37℃下20分钟，然后灭活DNA酶孵育在75℃下持续15分钟。用乙醇和重悬在30μl无核酸酶的水的RNA沉淀RNA。
- 总RNA，使用的NanoDrop的数量决定的。
- 核糖体RNA基因片段的PCR扩增
此步骤创建特定样品的rRNA池，将被用作体外转录的模板，以产生反义核糖体RNA（arRNA）探针是免费的rRNA基因中的总RNA样品。- 设计并合成引物组合rRNA基因片段PCR（ 表1）。
- 在50个运行PCRμl反应体系中使用Taq DNA聚合酶（Qiagen公司制）与50 ng模板DNA，1×PCR缓冲液，1.5MM的Mg 2氯，0.2μM的引物，35个循环的变性在94℃下持续10秒，退火15秒，在40℃下进行细菌23S的扩增子，和50℃下进行其他的扩增子，和延伸在72℃下1分钟（在72℃下5分钟的最后延伸）。
- 查看PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
- 在50μl洗脱缓冲液洗脱使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。量化使用的NanoDrop的浓度。
- 在生物素标记的反义的rRNA的探针（arRNA）的体外转录。注意：在此步骤中，样品从各种rRNA基因的扩增子的特异性探针使用MEGAscript T7试剂盒合成。
- 通过混合下面的成分（ 表2），设置了一个20μl反应对每个样品的特定rRNA基因的扩增子。孵育过夜，在37°C。
- 加入1μlDNA酶I（包括在试剂盒中）的反应，并在37℃下孵育20分钟，以除去DNA模板。
- 加入100μl100％乙醇中反应，离心机在4℃下以12,000 xg离心10分钟以沉淀，合成arRNA。弃去上清，并用750微升75％乙醇洗涤沉淀。在50μl无核酸酶的水重悬RNA探针。
- 量化使用的NanoDrop的RNA浓度。商店探针在-80℃下
- 通过混合下面的成分（ 表2），设置了一个20μl反应对每个样品的特定rRNA基因的扩增子。孵育过夜，在37°C。
- rRNA基因减法与生物素arRNA。注意：此步骤采用生物素化的arRNA杂交rRNA基因中的总RNA样品。由链霉亲和素包被的磁珠的rRNA-arRNA的杂交被捕获。程序是基于参考文献13中描述的协议，与细微的修改。
- 试剂
- 准备0.1N氢氧化钠，20X钠氯碱的ide-柠檬酸钠（SSC）和1×SSC，20％甲酰胺。
- 杂交
- 与细菌16S和23S探针（0.75微克），蚊虫18S和28S探针（0.75微克），1微克的总RNA混合，加入1μlRNase抑制剂，2.5微升20X SSC缓冲液，10微升100％甲酰胺中的200微升PCR管，附加组件的无核酸酶的水至50μl。
- 反应管放置在热循环仪和孵育在70℃下5分钟，以打开二级结构和斜坡下降至25℃下，使用5℃的增量，每个℃下1分钟，以允许杂交rRNA和arRNA探头。
- 去除rRNA基因
- 成1.7 ml管，将300微升的链霉亲和素包被的磁珠。将管上的磁分离的机架固定的珠子。除去上清液。在300μl的0.1N NaOH和英里悬浮磁珠X井。管放置返回到磁性机架和移液除去上清液。悬浮磁珠在300μl的1×SSC，拌匀，固定的珠子和吸液管除去上清液。重复洗用300μl的1×SSC一个更多的时间。
- 3等分珠，每100μL，在1.7毫升管。管放置磁性机架上，并通过移液除去上清液。注：取珠用于3轮捕获生物素标记的rRNA的arRNA杂交。
- 加入50μl的1×SSC，用20％甲酰胺到50μl的杂交反应。转移反应到第一胎圈等分管的，拌匀。在RT下孵育10分钟，以允许由链霉抗生物素蛋白磁珠被捕获的生物素化的探针的rRNA杂种。滑动管在孵化混合，每2分钟。
- 管放置磁性机架上，以固定的珠子，将上清转移至所述第二aliqUOT珠，拌匀和孵化如上。进行第三次捕获通过转移到第三管珠上清液。混合和孵化。
- 非rRNA基因转移上清到一个新的管并进行净化，用RNeasy MinElute套件，除去甲酰胺制造商提供的使用手册。
- 请检查的rRNA基因消耗效率的使用Agilent RNA 6000的Pico芯片试剂盒在生物分析仪（ 图4）。
- 试剂
注意：宏基因组DNA中分离，与后述的变形例中使用的Meta-G-诺姆DNA提取试剂盒（震中Biotechnologies公司）。
4。总RNA提取
注意：清洁工作区域RNaseZap，以减少RNase污染。宏基因组RNA的提取使用TriPure隔离试剂（Roche）进行了小修改的蚊子肠道标本。
5。核糖体RNA亏损
注：该协议的开发根据上述方法12,13,15。
注：如有必要，8 mRNA扩增的rRNA耗尽的RNA样品。
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Representative Results
该协议包括3个部分：（1）准备rRNA基因PCR宏基因组DNA模板（2）消减杂交技术创造特定的样品采集rRNA探针（3）消耗的rRNA总RNA。高品质的宏基因组DNA和RNA分离的整个过程是必不可少的。修改后的Meta-G-的诺姆DNA隔离协议产生高品质的宏基因组DNA从蚊子的胆量， 如图2所示。它可以是具有挑战性的蚊子胆中分离出高品质的总RNA。这可能是由于存在的各种酶，核糖核酸酶，在蚊子的胆量。我们比较了罗氏公司TriPure Qiagen公司的RNA提取试剂盒提取总RNA性能。电泳安捷伦生物分析仪分析表明，总RNA使用TriPure包含清晰rRNA的峰（ 图3），这是没有看到在RNA，使用Qiagen公司的试剂盒得到。也许蚊子衍生的RNA酶的有效灭活d的在TriPure苯酚。通常情况下，50蚊的胆量产量〜20μg总RNA。总RNA的输入电流的rRNA基因耗尽过程的理想量为〜1微克，优化的效率的rRNA减法和产量〜150纳克纯化的RNA。 图4示出了比较的RNA电泳rRNA的减法之前和之后。而在剩余的RNA，极大地丰富了非rRNA基因的物种的rRNA被高效地除去。大尺寸RNA（> 2,000 bp）的存在下富集的mRNA表达（ 图4B）表示良好的品质。该协议可以按比例增加，以容纳更大的输入进行处理的RNA。一般需要5微克的RNA的RNA-seq的过程。因此，我们使用MessageAmp II-细菌RNA扩增试剂盒，以产生足够量的rRNA耗尽RNA的RNA-Seq的。我们建议使用150 ng或纯化的RNA的RNA扩增，以确保扩增的保真度。该协议已经APPLIED被蚊子肠道RNA-Seq的项目。有效地实现的rRNA耗尽通过使用样本来自捕获探针。 表3列出的百分比的rRNA基因中的RNA-Seq的四个样本的输出中读取。两个糖美联储和的血液喂养的肠道样品的损耗和RNA-Seq的处理。 Illumina的测序产生的23-24M读取每个样本。 rRNA基因减法有效地去除90-99％rRNA基因蚊子组织和微生物在肠道样本。耗尽糖馈肠道样品几乎是完全的，和6.12-10.98％的rRNA保持血液中的馈样品（ 表3）。
| 扩增子 | 正向5'-3' | 反向5'-3' |
| 细菌16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| 细菌23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| 蚊子18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| 蚊子28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
表1引物套rRNA基因片段扩增细菌16S和23的引物的设计基于20,19。 T7启动子序列以粗体显示。
| 2微升 | |
| PCR产物（0.5-1微克） | 1.5微升 |
| ATP（75MM） | 2微升 |
| GTP（75MM） | 2微升 |
| CTP（75毫米） | 1.5微升 |
| UTP（75毫米） | 1.5微升 |
| 生物素-11-CTP中（10mM） | 3.75微升 |
| 生物素-16-UTP中（10mM） | 3.75微升 |
| T7 RNA聚合酶 | 2微升 |
表2中。rRNA探针在体外合成的组件。
| 样品 | 共读 | 蚊子rRNA基因读取（％） | 微生物16S读取（％） | 微生物23S读取（％） | 总计％的rRNA读取* |
| SM1 | 24341850 | 121,987（0.50） | 3717（0.02） | 6810（0.03） | 0.54 |
| SM2 | 23487202 | 114430（0.49） | 30,271（0.13） | 38,261（0.16） | 0.78 |
| BM1 | 23438304 | 265433（1.13） | 2054777（8.77） | 253051（1.08） | 10.98 |
| BM2 | 24212240 | 110240（0.46） | 1186423（4.90） | 185074（0.76） | 6.12 |
表3中。Stat的istics的rRNA基因在RNA-seq的输出读取。 SM：糖喂肠道，BM：血美联储肠道。 *：读取rRNA基因和微生物的rRNA基因蚊子的百分比的总和。
图1。宏基因组DNA和RNA分离的过程步骤的流程图，显示，rRNA的捕获探针的合成，杂交和捕获珠基于耗尽。
图2。宏基因组DNA分离。在1％琼脂糖凝胶电泳分离的DNA样品。 1，粘粒DNA（40KB）; 2，蚊子的肠道宏基因组DNA。
图3。比较两个总RNA提取试剂的效率，质量RNA提取蚊子肠道覆盖从TriPure隔离（蓝色）的总RNA电泳显示rRNA基因的山峰和广泛的RNA分布，而从Qiagen隔离（红色）有没有明确的rRNA峰。
图4。前（A）和（B）rRNA的消耗效率的rRNA的消耗。电泳显示的总RNA。被有效地除去的rRNA峰。 RNA大于4KB的遗体在rRNA基因耗尽样品。的RNA的浓度为107.6 ng /μl的在（A）和8.6 ng /μl的（B）中。
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Discussion
一个复杂的微生物群落居住在蚊子的肠道生态系统的14,16,17。 Metatranscriptomic测序（RNA-seq的）上下文相关的功能信息可以透露讯问的整个微生物的转录4,18。从技术上讲，低聚的d（T）介导的富集的原核mRNA的是不适用的，由于缺乏稳定的聚（A）尾的使者。或者，rRNA的耗尽已用于mRNA的富集。在这里，我们开发了消耗rRNA基因rRNA基因探针，从自己在蚊子的肠道微生物群落宏基因组DNA一个减为基础的协议。 rRNA的去除的效率取决于所生成的rRNA PCR的rRNA捕获探针上的覆盖范围。设置不同的引物退火效率，针对保守区域的变化在不同的类群19。因此，我们建议您尝试不同的组合，引物对宏基因组样品，然后汇集rRNA的产品，以最大限度地覆盖。在我们的程序，我们创建了捕获探针，通过组合两个向前和两个反向引物，从而可形成4的引物组的组合（ 表1）的rRNA基因的PCR产物。此外，rRNA的打算以形成二级结构。较小的rRNA基因片段相比全长rRNA基因作为探针13，有一个较低的，以形成二级结构的倾向，这可能有利于的捕获探针杂交，以样品的rRNA。有效的生物素化的探针杂交的rRNA基因的总RNA样品中除去与链霉亲和素包被的磁珠捕获和杂种。该过程将删除最的rRNA基因（ 图4）。在我们已经处理的四个样品，有效地被耗尽的rRNA的90-99％（ 表3）。此程序可以进一步修改为各种昆虫相关微生物研究。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作是由NIH授予1SC2GM092789，-01A1，MS新墨西哥州立大学霍华德·休斯医学院校本科研究项目的研究学者。录影被指挥和生产由Amy Lanasa和协调的菲利普·刘易斯博士在新墨西哥州立大学的创意媒体学院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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