Summary
En ribosomalt RNA (rRNA) udtømning protokol blev udviklet til at berige messenger RNA (mRNA) for RNA-seq af myg tarmen metatranscriptome. Prøve specifikke rRNA prober, som blev brugt til at fjerne rRNA via subtraktion, blev skabt fra myg og dens tarm mikrober. Udførelsen af protokollen kan resultere i fjernelse af tilnærmelsesvis 90-99% af rRNA.
Abstract
Den myg gut rumme dynamiske mikrobielle samfund på tværs af forskellige stadier af insektets livscyklus. Karakterisering af den genetiske kapacitet og funktionalitet af tarmen samfund vil give indsigt i følgerne af tarmens mikrobiota om myg liv træk. Metagenomic RNA-Seq er blevet et vigtigt værktøj til at analysere transcriptomes fra forskellige mikrober til stede i en mikrobiel samfund. Messenger RNA omfatter sædvanligvis kun 1-3% af totalt RNA, mens rRNA udgør cirka 90%. Det er en udfordring at berige messenger-RNA fra en metagenomic mikrobiel RNA-prøve, fordi de fleste prokaryote mRNA-arter mangler stabile poly (A) haler. Dette forhindrer oligo d (T) medieret mRNA isolation. Her beskriver vi en protokol der anvender prøve afledt rRNA indfangningsprober til fjernelse af rRNA fra en metagenomic total RNA-prøve. Til at begynde, er både myg og mikrobielle små og store subunit rRNA-fragmenter amplificeret fra et metagenomic samfund DNA-prøve. Derefter kommunikatiskabets specifikke biotinylerede antisense ribosomale RNA-prober syntetiseres in vitro under anvendelse af T7 RNA-polymerase. De biotinylerede rRNA-prober hybridiseret til totalt RNA. Hybriderne indfanges af streptavidin-coatede beads og fjernes fra det totale RNA. Denne subtraktion-baseret protokol effektivt fjerner både myg og mikrobiel rRNA fra den totale RNA-prøve. MRNA'et beriget prøve yderligere forarbejdes for RNA-amplifikation og RNA-Seq.
Introduction
Næste generation sekventering teknologi har i høj grad avanceret metagenomet undersøgelse ved at tillade at vurdere taksonomiske sammensætning og genetisk funktionalitet af en mikrobiel assemblage. RNA-sekventering (RNA-Seq) 1 kan omgå kultur-baserede metoder til at undersøge mikrobielle metatranscriptomes i forskellige sammenhænge 2-5. En stor hindring for mikrobiel RNA-seq er vanskeligheden ved at berige mRNA, som de prokaryote mRNA-species der ikke er stabilt polyadenyleret. Derfor oligo d (T) medieret messenger berigelse finder ikke anvendelse. Fjernelse af rigelige rRNA er en alternativ fremgangsmåde til at berige mRNA. Kommercielle rRNA depletion kits, såsom Microexpress Bakteriel mRNA Enrichment kit (Ambion), RiboMinus transkriptom Isolation Kit (bakterier) (Life Technologies), og mRNA-ONLY Prokaryotisk mRNA Isolation kit (Epicentre), som fortrinsvis nedbrydes rRNA med en exonuclease, er blevet anvendt til fjernelse af rRNA 6-8. Men bindingsproberne i Microexpresseller RiboMinus er gode til at fjerne kendte rRNA fra typiske Gram-positive og Gram-negative bakterier (se fabrikantens specifikationer), men mindre kompatibel med rRNA fra ukendte mikrober. Derfor kan fjernelse være mindre effektiv for metagenomic prøver 8-10. Desuden mRNA overflod fidelity var tvivlsom, da exonukleasebehandling blev anvendt 11. Samlet subtraktion-baserede rRNA depletion var mindre forudindtaget og mere effektive i mRNA berigelse i metagenomic indstillinger 10-13.
Den myg gut rummer en dynamisk mikrobielle samfund 14. Vi er interesseret i at karakterisere funktionen af den myg tarmen microbiome ved hjælp af RNA-Seq. I en RNA-prøve isoleret fra de myg indvolde, er begge myg og mikrobielle RNA til stede. Her beskriver vi en modificeret protokol til at bruge community specifikke rRNA prober til effektivt nedbryder myg og mikrobiel rRNA ved subtraktiv hybridisering. Den resulterende mRNAberigede prøver er egnede til RNA-Seq. Den samlede arbejdsgang er afbildet i figur 1..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedure
1. Mosquito Opdræt
- Bageste myg Anopheles gambiae G3-stamme i en insectary ved 27,5 ° C med 80% fugtighed og 12:12 hr cyklus af lys / mørke.
- Foder larver med jorden kattefoder med ølgær i forholdet 1:1.
- Feed voksne myg på mus blod på dag 3 efter fremspiring til ægproduktion.
2. Mosquito Gut Dissection
- Autoklave Dissektionsværktøj (dias og pincet).
- Saml 50 myg ved hjælp af en aspirator og placere dem på CO 2 flow seng (Ultimate Flypad). Skyl en myg prøve sekventielt i tre Petri-skåle indeholdende 70% ethanol til at rengøre mosquito legemsoverflade.
- Prøven anbringes på et objektglas under en stereomikroskopi. Fjern tarmen.
- Saml 50 indvolde pr betingelse for metagenomic DNA isolation. Samler 50 indvolde pr betingelse for metagenomic RNA-isolering. 3. Metagenomic DNA-isolering
- Placer 50 mosquito indvolde i 300 ul TE. Homogenisere dem i 1 minut ved hjælp af Bio-Gen PRO200 homogenisator (PRO Scientific Inc., USA) ved hastighed 2000 rpm på is.
- Der tilsættes 2 pi af Ready-Lyse Lysozyme Solution og 1 pi RNase A til cellesuspensionen. Vortexes og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Tilsæt 300 pi Meta-Lysis Solution (2X) og 1 ul af proteinase K til røret. Vortexes. Kort puls-centrifugeres røret for at sikre, at al opløsningen er i bunden af røret, og inkuber ved 65 ° C i 15 minutter, afkøles til stuetemperatur, derefter sted på is i 3-5 min.
- Tilsættes 350 pi MPC Protein Precipitation Reagent til røret og vortexes kraftigt i 10 sek.
- Pellet tHan ved centrifugering i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til et rent 2-ml rør, og kassér pelleten.
- Tilsættes 570 pi isopropanol til supernatanten. Bland ved at vende røret flere gange.
- Pellet DNA'et ved centrifugering i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 ° C. Fjern isopropanol uden at løs DNA-pelleten.
- Der tilsættes 500 pi af 75% ethanol til at vaske pelleten. Centrifugeres i 5 minutter ved 12.000 x g ved 4 ° C. Fjernelse af ethanol uden at forstyrre DNA pellet. Lufttørre pelleten ved stuetemperatur i 2 min. Bemærk: Må ikke over-tør DNA pellet.
- Resuspender DNA'et pelleten i 50 pl TE-stødpude.
- Validere størrelsen af det isolerede DNA ved sammenligning med Fosmid kontrol-DNA (40 kb, 100 ng / pl) tilvejebragt i kittet, via gelelektroforese på en 1% agarosegel.
- Lægge 50 mosquito indvolde i en 2-ml rør med 500 gl TriPure Isolation Reagent. Homogeniseres i 1 minut ved hastighed 2000 rpm på is under anvendelse af en homogenisator. Lad det sidde ved stuetemperatur i 5 minutter for at tillade dissociering af nukleoprotein-komplekser.
- Tilsæt 100 pi chloroform og vortex for 12 sek, og lad det sidde ved stuetemperatur i 2 minutter.
- Centrifuger ved 10.000 x g i 10 minutter. Tag forsigtigt røret ud uden at forstyrre adskilte faser.
- Overførsel vandig fase til et nyt rør, tilsæt 250 ul isopropanol, bland godt, og sætte ved -20 ° C i 20 min.
- Centrifuger ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C for at udfælde RNA.
- Supernatanten kasseres, uden løs pellet. Vask pelleten med 750 pi 75% ethanol.
- Pipetteres supernatanten uden at forstyrre pelleten. Air tørre røret i 2 minutter.
- Resuspender RNA med 30 ul nukleasefrit vand.
- Behandl det totale RNA med DNase ved 37 ° C i 20 minutter, og derefter inaktivere DNase ved inkubering ved 75 ° C i 15 minutter. Bundfaldet RNA med ethanol og resuspender RNA i 30 fil nukleasefrit vand.
- Bestemme mængden af totalt RNA under anvendelse af en NanoDrop.
- PCR-amplifikation af ribosomale RNA genfragmenter
Dette trin skaber prøve-specifikke rRNA-puljer, som vil blive anvendt som skabeloner for in vitro transkription til at producere antisense-ribosomale RNA (arRNA) prober, der er komplementære til rRNA i det totale RNA-prøve.- Designe og syntetisere primersæt for rRNA fragment PCR (tabel 1).
- Køre PCR i 50pi reaktion under anvendelse af Taq DNA polymerase (Qiagen) med 50 ng DNA-template, 1 x PCR-buffer, 1,5 mM Mg2 Cl, 0,2 uM primere med 35 cyklusser af denaturering ved 94 ° C for 10 sec, annealing 15 sek ved 40 ° C for bakterielle 23S amplicon, og 50 ° C i de øvrige amplikoner, og strækker sig ved 72 ° C i 1 min (endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 minutter).
- Vis PCR-produkter på 1% agarosegel.
- Oprense PCR-produkter under anvendelse af QIAquick PCR Purification Kit ved eluering i 50 gl elueringspuffer. Kvantificere den koncentration hjælp NanoDrop.
- In vitro transkription af biotin-mærket anti-sense-rRNA-prober (arRNA). Note: I dette trin bliver prøve specifikke prober fra forskellige rRNA-ampliconer syntetiseres ved anvendelse af MEGAscript T7 kit.
- Opsætning af en 20 ul reaktion for hver prøve bestemt rRNA amplikon ved blanding af nedenstående ingredienser (tabel 2). Inkuber natten over ved 37 ° C.
- Tilsættes 1 ul DNase I (inkluderet i kittet) til reaktionsblandingen og inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter for at fjerne DNA-templaten.
- Tilsæt 100 pi 100% ethanol til reaktionsblandingen, centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C for at udfælde syntetiseret arRNA. Kasser supernatanten og vask bundfaldet med 750 pi 75% ethanol. Resuspender RNA-prober i 50 ul nukleasefrit vand.
- Kvantificere RNA-koncentrationen under anvendelse af en NanoDrop. Store prober ved -80 ° C.
- Opsætning af en 20 ul reaktion for hver prøve bestemt rRNA amplikon ved blanding af nedenstående ingredienser (tabel 2). Inkuber natten over ved 37 ° C.
- rRNA subtraktion med biotinyleret arRNA. Bemærk: Dette trin anvender biotinylerede arRNA til at hybridisere til rRNA i det totale RNA-prøve. The rRNA-arRNA hybrider indfanges af streptavidin-coatede magnetiske perler. Proceduren er baseret på protokollen beskrevet i reference 13, med mindre modifikation.
- Reagenser
- Forbered 0,1 N NaOH, 20X natrium kloride-citrat (SSC) og 1 X SSC med 20% formamid.
- Hybridisering
- Bland 1 ug totalt RNA med bakterielle 16S og 23S prober (0,75 ug hver), myg 18S og 28S prober (0,75 ug hver), 1 pi RNase inhibitor, 2.5 pi 20X SSC puffer, 10 pi 100% formamid i en 200 pl PCR-rør , add nuclease-frit vand til 50 ul.
- Anbring reaktionsrøret i et termisk cykliseringsapparat og inkuber ved 70 ° C i 5 minutter til at åbne sekundære struktur og rampe ned til 25 ° C med 5 ° C intervaller i 1 min hver ° C for at tillade hybridisering af rRNA og arRNA prober.
- Fjernelse af rRNA
- Overfør 300 gl streptavidin-coatede beads i et 1,7 ml rør. Anbring glasset på en magnetisk separation rack at immobilisere perlerne. Fjern supernatanten. Resuspendere perlerne i 300 pi 0,1 N NaOH og mix godt. Reagensglasset anbringes tilbage til magnetisk stativ og pipetteres supernatanten. Resuspendere perlerne i 300 gl 1X SSC, bland godt, immobilisere vulsten og pipetteres supernatanten. Gentag vask med 300 gl 1X SSC en gang.
- Lav 3 aliquoter af kugler, 100 pi hver, i 1,7 ml rør. Glasset anbringes på den magnetiske rack, og fjern supernatanten ved pipettering. Bemærk: portioner af perler bruges til 3 runder af fange biotinylerede rRNA-arRNA hybrider.
- Tilsættes 50 ul 1X SSC med 20% formamid i 50 pi hybridiseringsreaktionen. Overfør reaktion i den første perle alikvot rør, og bland godt. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter for at tillade de biotinylerede probe-rRNA-hybrider, der skal indfanges af streptavidin-perler. Svirp røret hvert 2. minut at blande under inkubationen.
- Glasset anbringes på magnetisk stativ at immobilisere perlerne, Overfør supernatanten til den anden aliquot af perler, bland godt og inkuberes som ovenfor. Gennemføre den tredje indfangning ved at overføre supernatant i den tredje rør af perler. Bland og inkuber.
- Overfør ikke-rRNA supernatant til et nyt rør og adfærd oprensning ved hjælp RNeasy MinElute kit til at fjerne formamid at følge producentens manual.
- Kontroller rRNA depletion effektivitet ved anvendelse af en Agilent RNA 6.000 Pico chip kit på en Bioanalyzer (fig. 4).
- Reagenser
Bemærk: Metagenomic DNA isoleres ved hjælp af Meta-G-Nome DNA Isolation Kit (Epicentre Biotechnologies) med den modifikation, beskrevet nedenfor.
4. Total RNA-isolering
Bemærk: Rengør arbejdsområdemed RNaseZap at minimere RNase kontaminering. Metagenomic RNA blev isoleret fra myg tarm prøver ved hjælp af TriPure Isolation Reagent (Roche) med en mindre modifikation.
5. Ribosomalt RNA Depletion
Bemærk: Der blev udarbejdet på grundlag af tidligere beskrevne fremgangsmåder 12,13,15.
Bemærk: rRNA depleteret RNA-prøver er underlagt mRNA forstærkning hvis det er nødvendigt 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen indeholder tre afsnit: (1) udarbejdelse af metagenomic DNA skabeloner til rRNA PCR, (2) skabelse af prøve specifikke capture rRNA prober, (3) udtømning af rRNA fra total RNA ved subtraktiv hybridisering. Isolering af høj kvalitet metagenomic DNA og RNA er afgørende for hele processen. Det modificerede Meta-G-Nome DNA-isolering protokol giver høj kvalitet metagenomic DNA fra myg indvolde, som vist i figur 2. Det kan være udfordrende at isolere høj kvalitet total RNA fra myg indvolde. Dette skyldes sandsynligvis tilstedeværelsen af forskellige enzymer, herunder RNase, i myg indvolde. Vi sammenlignede den samlede RNA-ekstraktion ydeevne Qiagen RNA isolation kit til Roche TriPure. Elektroferogram af Agilent Bioanalyzer analyse viste, at de samlede isolerede RNA ved anvendelse TriPure indeholder klare rRNA-toppe (figur 3), som ikke er set i RNA'et opnået under anvendelse af Qiagen kit. Måske myg-afledt RNase er effektivt inaktivererd ved phenol i TriPure. Typisk, 50 mosquito indvolde udbytte ~ 20 ug totalt RNA. Den ideelle mængde af total RNA input for den aktuelle rRNA depletion proces er ~ 1 ug, hvilket optimerer effektiviteten af rRNA subtraktion og udbytte ~ 150 ng renset RNA. Figur 4 viser sammenligningen af RNA elektroferogrammer før og efter rRNA subtraktion. RRNA blev effektivt fjernet, mens de ikke-rRNA-arter meget blev beriget med de resterende RNA. Tilstedeværelsen af store størrelse RNA (> 2000 bp) angiver en god kvalitet af beriget mRNA (figur 4B). Protokollen kan opskaleres til at rumme en større input af RNA til forarbejdning. Normalt 5 ug RNA er påkrævet for RNA-seq processen. Derfor har vi brugt MessageAmp II-Bakterier RNA Amplification Kit til at generere en tilstrækkelig mængde af rRNA depleteret RNA for RNA-Seq. Vi anbefaler anvendelse af 150 ng eller mere oprenset RNA for RNA-amplifikation for at sikre nøjagtigheden af amplifikation. Denne protokol er blevet applIED til en myg gut RNA-Seq projekt. The rRNA udtømning blev faktisk opnået ved anvendelse prøve afledt indfangningsprober. Tabel 3 angiver procentdelen af rRNA læser i RNA-Seq produktion af fire prøver. To sukker-fodret og to blod-fodret gut prøver blev behandlet af iltsvind og RNA-Seq. Den Illumina sekventering genererede 23-24M læser for hver prøve. RRNA subtraktion effektivt fjernes 90-99% rRNA fra både myg væv og mikroorganismer i tarmen prøver. Depletion var næsten afsluttet på sukker-fodrede gut prøver, og 6,12-10,98% rRNA forblev i blodet-fodrede prøver (Tabel 3).
| Amplicon | Frem 5'-3 ' | Reverse 5'-3 ' |
| Bakterielle 16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| Bakterielle 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| Mosquito 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| Mosquito 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
Tabel 1. Primersæt for rRNA fragment forstærkning Bakterielle 16S og 23 primerne designes ud fra 20,19. T7-promotorsekvenser er med fed skrift.
| 2 ul | |
| PCR-produkter (0,5-1 ug) | 1,5 gl |
| ATP (75mm) | 2 ul |
| GTP (75mm) | 2 ul |
| CTP (75mm) | 1,5 gl |
| UTP (75mm) | 1,5 gl |
| Biotin-11-CTP (10 mM) | 3,75 gl |
| Biotin-16-UTP (10 mM) | 3,75 gl |
| T7 RNA-polymerase | 2 ul |
Tabel 2. Komponenter i in vitro-syntese af rRNA-prober.
| Prøve | Total læser | Mosquito rRNAlæser (%) | Mikrobielle 16S læser (%) | Mikrobiel 23S læser (%) | Total% af rRNA læsninger * |
| SM1 | 24.341.850 | 121,987 (0.50) | 3,717 (0.02) | 6,810 (0.03) | 0,54 |
| SM2 | 23.487.202 | 114,430 (0.49) | 30,271 (0.13) | 38,261 (0.16) | 0,78 |
| BM1 | 23.438.304 | 265,433 (1.13) | 2,054,777 (8.77) | 253,051 (1.08) | 10,98 |
| BM2 | 24.212.240 | 110,240 (0.46) | 1,186,423 (4.90) | 185,074 (0.76) | 6,12 |
Tabel 3. Statristiske træk ved rRNA læser i RNA-seq output. SM: sukker fodret gut, BM: blod fodret gut. *: Summen af procenter af myg rRNA og mikrobielle rRNA læser.
Figur 1. Rutediagram, der viser proceduretrin af metagenomic DNA-og RNA-isolering, rRNA opfangningsprobe-syntese, hybridisering og indfange perler baseret depletion.
Figur 2. Metagenomic DNA-isolering. DNA-prøver blev separeret på 1% agarosegel. 1, Fosmid DNA (40 KB), 2, Mosquito gut metagenomic DNA.
Figur 3.Sammenligning af to total RNA isolation reagenser til deres effektivitet i at ekstrahere en kvalitet RNA fra myg tarm. Overlay af elektroferogrammer viser, at totalt RNA fra TriPure isolation (i blåt) havde rRNA toppe og bred RNA distribution, mens der fra Qiagen isolation (i rødt) havde ingen klare rRNA toppe.
Figur 4. Effektivitet af rRNA depletion. Elektroferogrammer viser det totale RNA før (A) og efter (B) rRNA depletion. RRNA-toppe blev effektivt fjernet. RNA større end 4 KB forbliver i rRNA forarmet prøve. RNA-koncentrationen var 107,6 ng / gl i (A) og 8,6 ng / gl i (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kompleks mikrobielle samfund ligger i den myg tarmen økosystem 14,16,17. Metatranscriptomic sekventering (RNA-seq) kan afsløre kontekstafhængige funktionel information ved at udspørge hele mikrobielle transkriptomet 4,18. Teknisk, oligo-d (T) medieret berigelse af prokaryotisk mRNA er ikke anvendelig på grund af fraværet af stabile poly (A) haler budbringere. Alternativt er rRNA depletion blevet anvendt til mRNA berigelse. Her har vi udviklet en subtraktion-baseret protokol til nedbryder rRNA hjælp rRNA prober fremstillet ud fra helt egen metagenomic DNA i myg tarmen mikrobielle samfund. Effektiviteten af den rRNA fjernelsen afhænger af dækningen af rRNA opfangningsprober, som genereres af rRNA PCR. Den annealing effektivitet af forskellige primersæt målrettet konserverede regioner varierer på tværs af forskellige taxa 19. Derfor anbefaler vi at prøve forskellige kombinationer af primere på metagenomic prøver, og derefter samle denrRNA-produkter, så dækningen. I vores procedure, skaber vi indfangningsprober ved at kombinere rRNA PCR-produkter af to fremad og to reverse primere, som kan danne 4 kombinationer af primersæt (tabel 1). Desuden vil rRNA til dannelse af en sekundær struktur. Sammenlignet med fuld længde rRNA som prober 13, har mindre rRNA-fragmenter, en lavere tendens til at danne sekundær struktur, som kan lette hybridiseringen af indfangningsprober til prøven rRNA. De biotinylerede prober effektivt hybridisere til rRNA i den samlede RNA-prøve, og de hybrider, fjernes ved optagelse med streptavidin-coatede beads. Den procedure fjerner det meste af rRNA (fig. 4). I de fire prøver, vi har forarbejdet, blev 90-99% af rRNA effektivt udtømt (tabel 3). Denne procedure kan modificeres yderligere til en række forskellige insekt-associerede microbiome undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 1SC2GM092789-01A1, og MS var et forsknings lærd af NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate forskningsprogrammer. Videoen blev instrueret og produceret af Amy Lanasa og koordineret af Dr. Philip Lewis med Creative Media Institut på NMSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
