Summary
A ribozomal RNA (rRNA) azalması protokolü sivrisinek bağırsak metatranscriptome RNA-seq mesajcı RNA (mRNA) zenginleştirmek için geliştirilmiştir. Çıkarma yoluyla rRNA kaldırmak için kullanılan örnek belirli rRNA probları, sivrisinek ve onun bağırsak mikropları oluşturulmuş. Protokol performans rRNA yaklaşık olarak% 90-99 arasında kaldırma neden olabilir.
Abstract
Sivrisinek gut böceğin yaşam döngüsünün farklı aşamaları boyunca dinamik mikrobiyal topluluklar barındırmaktadır. Gut toplumun genetik kapasite ve işlevselliğe Karakterizasyonu sivrisinek hayatı özellikleri üzerine gut mikrobiyotasına etkileri içgörü sağlayacaktır. Metagenomic RNA-Seq bir mikrobiyal topluluk bulunan çeşitli mikroplardan transcriptomes analiz için önemli bir araç haline gelmiştir. RRNA yaklaşık% 90'ını oluşturmaktadır ise mesajcı RNA genellikle total RNA sadece% 1-3 oluşmaktadır. Çoğu prokaryotik mRNA türleri istikrarlı poli (A) kuyrukları eksikliği nedeniyle bir Metagenomic mikrobiyal RNA örnek mesajcı RNA zenginleştirmek için zordur. Bu oligo d (T) aracılı mRNA izolasyon önler. Burada, rRNA bir Metagenomic toplam RNA örnek rRNA kaldırmak için problar yakalamak türetilmiş örnek kullanan bir protokol açıklar. Başlamak için, sivrisinek ve mikrobiyal küçük ve büyük alt ünite rRNA parçaları hem Metagenomic topluluk DNA örneğinden güçlendirilir. Daha sonra, CommuSon veriler özel biyotinli antisense RNA probları T7 RNA polimerazı kullanılarak in vitro olarak sentezlenir. Biotinlenmiş rRNA probları toplam RNA melezi. Melez streptavidin kaplı boncuklar tarafından yakalanır ve toplam RNA kaldırılır. Bu çıkarma tabanlı protokol verimli total RNA örnek sivrisinek ve mikrobiyal rRNA hem kaldırır. MRNA, zenginleştirilmiş bir numune, RNA amplifikasyonu ve RNA-Seq için işleme tabi tutulur.
Introduction
Gelecek nesil dizileme teknolojisi büyük ölçüde taksonomik kompozisyonu ve mikrobiyal topluluk genetik işlevselliğini değerlendirmek için izin vererek metagenomik çalışmada ilerlemiştir. RNA-Dizileme (RNA-Seq) 1 farklı bağlamlarda 2-5 mikrobiyal metatranscriptomes araştırmak için kültüre dayalı yöntemler atlayabilir. Prokaryotik mRNA türleri stabil polyadenylated değil gibi mikrobik RNA-seq için büyük bir engel, mRNA zenginleştirici güçlüktür. Bu nedenle, oligo d (T) aracılı messenger zenginleşme geçerli değildir. Bol rRNA kaldırılmasını mRNA zenginleştirmek için alternatif bir yaklaşımdır. Böyle Microexpress Bakteriyel mRNA Zenginleştirme kiti (Ambion), RiboMinus transcriptome İzolasyon Kiti (Bakteri) (Life Technologies), ve tercihen bir eksonükleaz ile rRNA alçaltır mRNA-SADECE Prokaryotik mRNA İzolasyon kiti (Epicentre) gibi Ticari rRNA tükenmesi kitleri, kullanılmış rRNA 6-8 kaldırmak için. Microexpress Ancak, yakalama problarıya RiboMinus (imalatçılarının şartnamelerine bakın) tipik Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler bilinen rRNA kaldırılması için iyi, ama bilinmeyen mikroplardan rRNA ile daha az uyumludur. Sonuç olarak, kaldırma Metagenomic örnekler 8-10 için daha az etkili olabilir. Ekzonükleaz tedavi 11 verildiğinde yanı sıra, mRNA bolluk aslına uygunluk sorgulanabilir. Genel olarak, çıkarma tabanlı rRNA tükenmesi az önyargılı ve Metagenomic ayarları 10-13 mRNA zenginleştirme daha etkili olmuştur.
Sivrisinek gut dinamik mikrobiyal topluluk 14 barındırmaktadır. Biz RNA-Seq kullanarak sivrisinek bağırsak mikrobiyomları fonksiyonunu karakterize ilgilendi. Sivrisinek bağırsaklar izole edilen bir RNA örnek olarak, her ikisi de mikrobiyal sivrisinek ve RNA bulunmaktadır. Burada, biz verimli eksiltici hibridizasyon ile sivrisinek ve mikrobiyal rRNA tüketmek topluluk belirli rRNA probları kullanmak üzere değiştirilmiş bir protokol açıklar. Elde edilen mRNAzenginleştirilmiş örnekleri RNA-Seq için uygundur. Genel akışı Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedür
1. Sivrisinek Yetiştirme
- 27.5 bir insectary Arka sivrisinek Anofel gambiae G3 zorlanma ° C / karanlık ışığın% 80 nem ve 12:12 saat döngüsü ile.
- Oranı 1:1 bira mayası ile zemin kedi maması ile larva besleme.
- 3. gün yumurta üretimi için post-ortaya Farelerde kan yetişkin sivrisinekler besleyin.
2. Sivrisinek Gut Diseksiyon
- Otoklav diseksiyon araçları (slaytlar ve forseps).
- Bir aspiratörü kullanarak 50 sivrisinek toplayın ve CO 2 akış yatağı (Ultimate Flypad) üzerine koyun. Sivrisinek vücut yüzeyi temizlemek için% 70 etanol içeren üç petri sırayla bir sivrisinek örneği durulayın.
- Bir stereomikroskobi altında bir cam slayt üzerine numune yerleştirin. Gut çıkarın.
- Metagenomic DNA izolasyonu için koşul başına 50 cesareti toplayın. Metagenomic RNA izolasyonu için koşul başına 50 cesareti toplayın. 3. Metagenomic DNA İzolasyonu
- 300 ul TE 50 sivrisinek bağırsaklar yerleştirin. Buz üzerinde hız 2.000 rpm Bio-Gen PRO200 homojenizatör (PRO Bilimsel Inc, ABD) kullanılarak 1 dk için onları homojenize.
- Hazır-Lyse Lizozim Çözüm 2 ul RNaz hücre süspansiyonu A 1 ul ekleyin. 30 dakika 37 ° C'de vorteks ve inkübe Mix by.
- Meta-Lizis çözeltisi (2X) ve tüp ile Proteinaz K ve 1 ul 300 ul ekle. Vorteks ile karıştırın. Kısaca çözeltinin her tüpün tabanında olduğundan emin olmak için tüp darbe santrifüjden, ve 3-5 dakika için buz üzerinde daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulur 15 dak, yer için 65 ° C sıcaklıkta inkübe edilir.
- 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteks tüpü ve karıştırın MPC Protein yağış reaktifi 350 ul ekleyin.
- Pelet t4 azından 12,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ile çöpleri ° C.
- Temiz bir 2 ml tüp için supernatant aktarın ve pelet atın.
- Süpernatant ile izopropanol 570 ul ekle. Ters tüp birkaç kez karıştırın.
- Pelet 4 12,000 x g'da 10 dakika için santrifüjleme ile DNA ° C. DNA pelet oradan çıkarmadan izopropanol çıkarın.
- Pelet yıkamak için% 75 etanol 500 ul ekleyin. 4 ° C'de 12,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje DNA pelet bozmadan etanol çıkarın. 2 dakika için oda sıcaklığında pelet Hava kurutun. Not: DNA pelet aşırı kuru etmeyin.
- TE tamponu 50 ul DNA pelet yeniden süspanse edin.
- Bir% 1 agaroz jeli üzerinde jel elektroforezi yolu ile, kitte sağlanan; Fosmid Kontrol DNA (100 ng / ml 'den 40 kb) ile kıyasla izole edilmiş DNA'nın boyutu ile doğrula.
- 500 ul TriPure İzolasyon Reaktifi ile 2 ml tüp içinde 50 sivrisinek cesaretlenin. Bir homojenizer kullanarak, buz üzerinde hızlı 2.000 rpm'de 1 dakika için homojenize edilir. Nükleoprotein komplekslerin dissosiyasyon imkan vermek üzere 5 dakika oda sıcaklığında bekletin.
- 12 sn için 100 ul kloroform ve vorteks ekleyin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatlice rahatsız ayrılmış aşamaları olmadan tüpü çıkarmak.
- Yeni bir tüp ile sulu faz transfer, 250 ul izopropanol eklemek iyice karıştırılır, ve 20 dakika süre ile -20 ° C'de koydu.
- 4, 10 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin ° C'de çökelti RNA için.
- Pelet oradan çıkarmadan Süpernatantı atın. 750 ul% 75 etanol ile pelet yıkayın.
- Pelet bozmadan süpernatant kapalı pipet. Air 2 dakika süreyle tüp kurulayın.
- 30 ul nükleaz ücretsiz su ile RNA tekrar.
- 20 dk için 37 ° C 'de DNaz ile tedavi edilen toplam RNA ve daha sonra 75 ile inkübe ederek DNase inaktive 15 dakika için ° C. 30 ul nükleaz ücretsiz su etanol ve tekrar süspansiyon RNA ile Çökelti RNA.
- Bir Nanodrop kullanılarak toplam RNA miktarını belirleyin.
- Ribozomal RNA gen fragmanlarının PCR amplifikasyon
Bu adım, toplam RNA örnek rRNA için ücretsiz olan anti-sense RNA (arRNA) probları üretmek için in vitro transkripsiyon için şablon olarak kullanılacak örnek özgü rRNA havuzları, oluşturur.- RRNA fragmanı PCR (Tablo 1) primer setleri tasarlayın ve sentez.
- 50 PCR Çalıştır50 ng DNA şablonu, 1 x PCR tamponu, 1.5mM Mg 2 ile Taq DNA polimeraz (Qiagen) kullanılarak ul reaksiyon, Cl, denaturasyon, 94 ve 35 döngü ile 0.2 uM primerler ° C'de 10 saniye, 40 saniye, 15 ° C'de tavlama için bakteri 23S amplikon, ve 50 ° C diğer amplikonlar ve 72 uzatılması için 1 dk (72 nihai uzatma ° C de 5 dakika) için ° C.
- % 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri görün.
- 50 ul yıkama tamponu ile elüsyon QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri temizler. Nanodrop kullanılarak konsantrasyon ölçülmesine imkan verirler.
- Biotin-etiketli anti-sense rRNA probları (arRNA) in vitro transkripsiyon olarak. Not: Bu basamakta, çeşitli rRNA gelen amplikonlar örnek özel problar MEGAscript T7 kiti kullanılarak sentezlenmiştir.
- Aşağıdaki maddeleri (Tablo 2) karıştırılması ile her bir örnek için özel rRNA amplikon bir 20 ul reaksiyon ayarlayın. 37 gece inkübe ° C
- DNA şablonu kaldırmak için 20 dakika boyunca 37 ° C de inkübe etmek ve reaksiyon 1 ul DNase I (kitinde) ekleyin.
- 4, 10 dakika için 12,000 x g'da reaksiyon için 100 ul% 100 etanol, santrifüj ekleme ° C arRNA sentezlendi çökeltilir. Süpernatantı atın ve 750 ul% 75 etanol ile pelet yıkayın. 50 ul nükleaz ücretsiz su süspanse RNA problar.
- Bir Nanodrop kullanarak RNA konsantrasyonu niceliğini. -80 Mağaza probları ° C
- Aşağıdaki maddeleri (Tablo 2) karıştırılması ile her bir örnek için özel rRNA amplikon bir 20 ul reaksiyon ayarlayın. 37 gece inkübe ° C
- biotinlenmiş arRNA ile rRNA çıkarma. Not: Bu adım, toplam RNA örnek rRNA için melezleşme biotinlenmiş arRNA kullanır. RRNA arRNA melezler streptavidin kaplı manyetik boncuk tarafından yakalanır. Prosedür küçük değişiklik ile referans 13'de tarif edilen protokole dayanmaktadır.
- Reaktifler
- 0.1 N NaOH, 20X sodyum klor hazırlayınide-sitrat (SSC) ve% 20 formamid 1 X SSC.
- Melezleme
- Bakteriyel 16S ve 23S probları (0.75 mikrogram her), sivrisinek 18S ve 28S probları (0.75 mikrogram adet) 1 mg total RNA karıştırın, 1 ul RNaz inhibitörü, 2.5 ul 20X SSC tamponu, 200 ul PCR tüp 10 ul% 100 formamid , 50 ul ekleyin nükleaz ücretsiz su.
- 70, bir termal döngü cihazı ve inkübe reaksiyon tüpü yerleştirin ° C de 5 dakika ikincil yapı açmak ve 25 aşağı rampa ° C rRNA ve arRNA hibridizasyon probları izin vermek için 1 dakika her biri ° C de 5 ° C lik artışlarla kullanarak.
- RRNA Kaldırma
- 1.7 ml tüp içine 300 ul streptavidin kaplı boncuklar aktarın. Boncuk hareketsiz bir manyetik ayırma raf tüp yerleştirin. Süpernatantı. 0.1N NaOH ve mil ve 300 ul içinde süspanse boncukiyi x. Manyetik raf geri tüpü yerleştirin ve süpernatant kapalı Pipeti. Iyice karıştırın, 1X SSC 300 ul boncuklar tekrar süspansiyon, boncuk immobilize ve süpernatant kapalı Pipeti. 1X SSC bir kez daha 300 ul yıkama tekrarlayın.
- Boncuk 3 alikotları, 100 ul, her biri 1.7 ml tüpler olun. Manyetik raf tüp yerleştirin ve pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak. Not: boncuk alikotları biyotinile rRNA arRNA melez yakalama 3 tur için kullanılır.
- 50 ul hibridizasyon reaksiyona girerek% 20 formamid 50 ul 1X SSC ekleyin. İlk boncuk kısım tüpüne reaksiyon aktarın ve iyice karıştırın. Biotinlenmiş prob-rRNA melezleri streptavidin boncuk tarafından yakalanan izin vermek için 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. Tüp inkübasyon sırasında karıştırmak için her 2 dakikada Flick.
- Boncuk hareketsiz manyetik raf tüp yerleştirin, ikinci aliq için süpernatant aktarmakboncuk uot, iyice karıştırın ve yukarıdaki gibi kuluçkaya yatmaktadır. Boncuk üçüncü tüp içine Süpernatant aktararak üçüncü yakalama gerçekleştirilmesi. Karıştırın ve inkübe.
- Üreticinin kılavuzunu takip formamid kaldırmak RNeasy MinElute kitini kullanarak yeni bir tüp ve davranış arıtma içine non-rRNA süpernatant aktarın.
- Bir Bioanalyzer (Şekil 4) bir Agilent RNA 6000 Pico yonga seti kullanarak rRNA tükenmesi verimliliğini kontrol edin.
- Reaktifler
Not: Metagenomic DNA aşağıda açıklanan değişiklik ile Meta-G-Nome DNA izolasyon kiti (Epicentre Biotechnologies) kullanılarak izole edilir.
4. Toplam RNA İzolasyonu
Not: çalışma alanı temizleyinRNaz kontaminasyonu en aza indirmek için RNaseZap ile. Metagenomic RNA, küçük bir değişiklik ile TriPure İzolasyon Reaktif (Roche) kullanılarak sivrisinek gut örneklerden izole edilmiştir.
5. Ribozomal RNA tükenmesi
Not: Bu protokol daha önce tarif edilen yöntemler 12,13,15 üzerinde geliştirilmiştir.
Not: rRNA tüketilmiş RNA numuneleri 8 gerekirse amplifikasyon mRNA tabi tutulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
, (2) numune belirli bir yakalama rRNA probları yaratılması; rRNA (3) azalması eksiltme hibridizasyon ile total RNA rRNA PCR Metagenomic DNA şablonları (1) Hazırlık: Protokol üç bölümden oluşmaktadır. Yüksek kalite Metagenomic DNA ve RNA İzolasyonu tüm süreci esastır. Değiştirilmiş Meta-G-Nome DNA izolasyon protokol olarak Şekil 2'de gösterildiği gibi sivrisinek bağırsaklar yüksek kaliteli Metagenomic DNA, elde edilir. Sivrisinek cesareti yüksek kalitede toplam RNA izole etmek zor olabilir. Bu, büyük ihtimalle sivrisinek bağırsaklarında RNaz dahil olmak üzere, çeşitli enzimleri, bulunmasından kaynaklanır. Biz Roche TriPure için Qiagen RNA izolasyon kiti toplam RNA ekstraksiyon performansı karşılaştırılmıştır. Agilent Bioanalyzer analiz elektroferogram TriPure kullanılarak izole edilen toplam RNA Qiagen kiti kullanılarak elde edilen RNA görülmemektedir berrak rRNA tepeler (Şekil 3) içerdiğini göstermiştir. Belki sivrisinek kökenli RNaz etkili inaktive edilirTriPure içinde fenol tarafından d. Genellikle, 50 sivrisinek cesareti verim ~ 20 mg total RNA. Geçerli rRNA tükenmesi işlem için toplam RNA giriş ideal miktar rRNA çıkarma ve verimleri ~ 150 ng saflaştırılmış RNA verimliliği optimize ~ 1 mikrogram vardır. Şekil 4 rRNA çıkarma öncesinde ve sonrasında RNA electropherograms karşılaştırılmasını göstermektedir. Non-rRNA tür büyük ölçüde kalan RNA zenginleştirilmiş iken rRNA verimli bir şekilde çıkartıldı. Büyük boy RNA (> 2,000 bp) varlığı zenginleştirilmiş mRNA kaliteli (Şekil 4B) gösterir. Protokol işlemlerinde RNA daha girişlerine uyum sağlayacak kadar ölçeklendirilebilir. Genellikle 5, ug RNA, RNA-seq işlem için gereklidir. Bu nedenle, RNA-Seq için rRNA tüketilmiş RNA, yeterli miktarda üretmek için MessageAmp II-Bakteri RNA amplifikasyon takımı kullanılır. Biz, 150 ng kullanılarak ya da daha fazla amplifikasyon aslına uygunluğunu sağlamak için RNA amplifikasyonu için RNA saflaştırıldı önerilir. Bu protokol, Appl olmuşturBir sivrisinek gut RNA-Seq proje ied. RRNA tükenmesi etkili örnek türetilmiş yakalama problar kullanılarak elde edilmiştir. Tablo 3 listeler rRNA yüzdesi dört örnekten RNA-Seq çıktı okur. İki şeker beslenen ve iki kandan beslenen bağırsak örnekleri tükenmesi ve RNA-Seq için işlendi. 23-24M oluşturulan Illumina sekanslama her bir numune için okur. RRNA çıkarma etkili bağırsak örneklerinde sivrisinek doku ve mikroplardan hem% 90-99 rRNA kaldırıldı. Tükenme şeker ile beslenen bağırsak örneklerde hemen hemen tamamlanmış ve 6,12-10,98% rRNA kan beslenen örnekleri (Tablo 3) içinde kalmıştır.
| Amplikon | İleri 5'-3 ' | '5'-3 Ters |
| Bakteriyel 16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| Bakteriyel 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| Sivrisinek 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| Sivrisinek 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
RRNA fragmanı amplifikasyon Bakteriyel 16S ve 23 primerleri için Tablo 1. Primer setleri 20,19 dayalı tasarlanmıştır. T7 promotörü dizisi kalın harflerle gösterilmektedir.
| 2 ul | |
| PCR ürünleri (0.5-1 ug) | Ul 1.5 |
| ATP (75mm) | 2 ul |
| GTP (75mm) | 2 ul |
| CTP (75mm) | Ul 1.5 |
| UTP (75mm) | Ul 1.5 |
| Biotin-11-CTP (10mM) | 3.75 ul |
| Biotin-16-UTP (10 mM) | 3.75 ul |
| T7 RNA polimeraz | 2 ul |
Tablo 2. RRNA probları vitro sentez Bileşenleri.
| Örnek | Toplam okur | Sivrisinek rRNAokur (%) | Mikrobiyal 16S okur (%) | Mikrobiyal 23S okur (%) | RRNA okuma Toplam% * |
| SM1 | 24,341,850 | 121,987 (0.50) | 3,717 (0.02) | 6,810 (0.03) | 0.54 |
| SM2 | 23,487,202 | 114,430 (0.49) | 30,271 (0.13) | 38,261 (0.16) | 0.78 |
| BM1 | 23,438,304 | 265,433 (1.13) | 2,054,777 (8.77) | 253,051 (1.08) | 10.98 |
| KM2 | 24,212,240 | 110,240 (0.46) | 1,186,423 (4.90) | 185,074 (0.76) | 6.12 |
Tablo 3. İstatistikrRNA kasten hasar RNA-seq çıktı okur. SM: şeker beslenen gut; BM: Kan beslenen gut. *: Sivrisinek rRNA ve mikrobiyal rRNA yüzdeleri toplamı okur.
Şekil 1. Metagenomic DNA ve RNA izolasyon usul aşamalarını gösteren akış şeması, rRNA yakalama prob sentezi, hibridizasyon ve boncuk tabanlı tükenmesi yakalamak.
Şekil 2. Metagenomic DNA izolasyonu. DNA örnekleri% 1 agaroz jel üzerinde ayrıldı. 1, Fosmid DNA (40kb); 2, Sivrisinek gut Metagenomic DNA.
Şekil 3,.Sivrisinek gut bir kalite RNA ayıklanan onların verimlilik için iki total RNA izolasyonu reaktifleri karşılaştırılması. Electropherograms Yerleşimi, TriPure izolasyon (mavi) elde edilen toplam RNA rRNA zirveleri ve geniş RNA dağıtım olduğunu gösterirken Qiagen izolasyonu (kırmızı) gelen net rRNA zirveleri vardı.
Şekil 4. RRNA tükenmesi. Electropherograms Etkinliği (A) ve sonrası (B) rRNA tükenmesi önce total RNA göstermektedir. RRNA zirveleri verimli bir şekilde çıkarıldı. RRNA tüketilmiş örnek 4kb kalıntıları daha fazla RNA. RNA konsantrasyonu 107.6 ng / ul idi (A) ve 8.6 (B) 'de ul / ng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karmaşık bir mikrobiyal topluluk sivrisinek bağırsak ekosistemi 14,16,17 bulunur. Metatranscriptomic sıralama (RNA-seq) tüm mikrobiyal transcriptome 4,18 sorgulayarak bağlam bağımlı işlevsel bilgileri açığa çıkartabilir. Teknik olarak, prokaryotik mRNA oligo-d (T) aracılı zenginleştirme dolayı stabil poli haberciler (A) kuyrukları olmaması için geçerli değildir. Alternatif olarak, rRNA mRNA zenginleştirme tabakasının incelmesi için kullanılmıştır. Burada, sivrisinek bağırsak mikrobiyal topluluk çok kendi Metagenomic DNA yapılan rRNA probları kullanarak rRNA tüketmek için bir çıkarma tabanlı protokolü geliştirildi. RRNA kaldırma verimliliği rRNA PCR tarafından oluşturulan rRNA yakalama probların kapsama alanına bağlıdır. Farklı primer tavlama verimliliği farklı taksonun 19 arasında değişmektedir korunmuş bölgeleri hedefleyen ayarlar. Bu nedenle, Metagenomic numuneler üzerinde primerlerin farklı kombinasyonları çalışıyor tavsiye ve daha sonra havuzurRNA ürünlerin kapsama maksimize etmek. Bizim prosedürü, biz primer setleri 4 kombinasyonu (Tablo 1) oluşabilir iki ileri ve iki geri primerleri, ve rRNA PCR ürünleri birleştirerek yakalama probları oluşturun. Buna ek olarak, rRNA bir ikincil yapı oluşturacak şekilde istemektedir. Probları 13 olarak tam uzunlukta rRNA ile karşılaştırıldığında, küçük rRNA parçaları örnek rRNA için yakalama prob hibridizasyon kolaylaştırabilir ikincil yapı oluşturmak için daha düşük bir eğilim var. Biotinlenmiş probları verimli toplam RNA örnek rRNA için melezleşme ve melez streptavidin kaplı boncuklar ile yakalayarak kaldırılır. Prosedür en rRNA (Şekil 4) ortadan kaldırır. Biz işledik dört örneklerde, rRNA% 90-99 etkin (Tablo 3) bitmiş. Bu prosedür, ayrıca böcek ilişkili mikrobiyomları çeşitli çalışmalarda için modifiye edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe 1SC2GM092789-01A1 tarafından desteklenen, ve MS NMSU Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Araştırma Programları bir araştırma bilim adamı oldu. Video yönetmen ve yapımcı Amy Lanasa tarafından NMSU de Creative Media Enstitüsü ile Dr Philip Lewis tarafından koordine edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
