Summary
Generatie van een orthotope muismodel van anaplastisch schildkliercarcinoom wordt hier beschreven. Deze techniek maakt chirurgische plaatsing van menselijk anaplastisch schildklierkanker cellen in de schildklier van immunodeficiënte muizen, waardoor een meer klinisch relevante instelling van ziekteprogressie en screen vernieuwende therapeutische interventies bestuderen.
Abstract
Verschillende soorten dierlijke modellen van menselijke schildkliercarcinomen zijn vastgesteld, waaronder subcutane xenograft en orthotopische implantatie van kankercellen in immuun deficiënte muizen. Subcutane xenotransplantaatmodellen zijn waardevol geweest voor preklinische screening en evaluatie van nieuwe therapeutische behandelingen. Er zijn een aantal voordelen aan het gebruik van een subcutaan model: 1) snelle, 2) reproduceerbaar, en 3) tumor inrichting, groei en respons op therapeutische middelen kunnen worden gecontroleerd door visuele inspectie. Echter, is substantieel bewijs licht werpen op de tekortkomingen van het onderhuidse xenograftmodellen 1-3. Bijvoorbeeld, medicinale behandelingen demonstreren genezende eigenschappen in subcutane xenotransplantaatmodellen hebben vaak geen noemenswaardige impact op de menselijke ziekte. De micro-omgeving van de plaats van xenografisch transplantatie of injectie ligt in het hart van deze ongelijkheid.
Orthotopic tumor xenotransplantaatmodellen zorgen voor een meer biologisch relevante context om de ziekte te bestuderen. De voordelen van implanteren zieke cellen of weefsels in hun anatomische oorsprong equivalente binnen een gastheerdier omvat een geschikte plaats voor tumor-gastheer interacties ontwikkeling van ziektegerelateerde metastasen en het vermogen om plaatsspecifieke invloed onderzoeken voor verantwoorde therapeutische middelen. Daarom orthotopische xenotransplantaatmodellen haven veel meer klinische waarde, omdat ze nauw ziekte bij de mens te reproduceren. Om deze redenen hebben een aantal groepen voordeel van een orthotopic schildklierkanker model genomen als onderzoeksinstrument 4-7.
Hier beschrijven we een werkwijze met als orthotopic model voor de studie van anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC), die sterk invasieve vaststelt, weerstaat behandeling en vrijwel fataal in alle gediagnosticeerde patiënten. Gekweekte cellen ATC bereid als gedissocieerde celsuspensie in een oplossing die een basaalmembraan matrix. Een klein volume langzaam injected in de juiste schildklier. Algehele uiterlijk en de gezondheid van de muizen worden gevolgd om te zorgen minimale postoperatieve complicaties en pathologische penetrantie van kanker meten. Muizen worden opgeofferd 4 weken, en weefsel verzameld voor histologische analyse. Dieren kunnen op latere tijdstippen worden voor een vooraf progressie van de ziekte te onderzoeken. Productie van dit orthotope muismodel wordt een platform dat twee doelstellingen verwezenlijkt: 1) verdere ons begrip van ATC pathologie, en 2) het scherm de huidige en toekomstige therapeutische middelen voor de werkzaamheid bij de bestrijding van ATC.
Protocol
1. Cell Preparation
Opmerkingen: 1) volledige RPMI 1640 gebaseerde voedingsbodems recept (500 ml) bevat 435 ml RPMI 1640, 50 ml hitte geïnactiveerd FBS, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natriumpyruvaat, 5 ml antibiotica-antimycotische; 2) plaats matrigel bij 4 ° C op een dag voorafgaand aan de cel oogst.
- Menselijke ATC cellijn THJ-11T 8 worden gekweekt in 6 putjes en een keer 80-90% samenvloeiing geoogst.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireren media en resuspendeer cellen in RPMI 1640 media [2 ml / 6 wells plaat].
- Neem een klein volume van de celsuspensie, toevoegen aan een volume van 0,4% trypan blauwe kleurstof en bepalen celdichtheid behulp TC10 geautomatiseerde cel Counter.
- Bereken volume celsuspensie nodig 5 x 10 5 cellen / muis maal het aantal muizen te injecteren.
Opmerking: Om ervoor te zorgen advertentie gelijk cel suspensie voor injectie, bereiden cellen alsof je injecteren dubbele van het aantal muizen (bijvoorbeeld als het injecteren van 5 muizen, dan bereiden celsuspensie alsof u het injecteren van 10 muizen).
- Overdragen nodig volume van celsuspensie in een 15 ml conische buis.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireren media en resuspendeer cellen in volledige RPMI 1640 media.
- Overdracht van cellen om een ml tube 1.6, voeg 1 volume matrigel en meng voorzichtig door langzaam pipetteren in en uit.
Opmerking: Elke muis wordt 10 ul van de celsuspensie / Matrigel cocktail ontvangen. Aangezien 5 x 10 5 cellen gesuspendeerd in een 10 pl volume injecteerbare succes zijn gebruikt in eerdere studies ATC orthotope 9-10, gebruikten we de parameters in dit rapport.
- Plaats celsuspensie op ijs tot gebruik.
- Reinig de chirurgische zone, die het ontleden scope en omgeving, door af te vegen alle oppervlakken met 70% ethanol bevat.
- Schakel warmtelampen / pads waar de dieren zullen worden herstellende van een operatie.
- Dien 0,1 ml ketamine / xylazine (combinatietherapie bestaande uit ketamine 9 mg / ml en xylazine 1mg/ml) per 10 g lichaamsgewicht intraperitoneaal met een 1 ml, 27G ½ "tuberculine spuit.
- Prep muis voor een operatie: 1) scheren halsgebied van de muis (van kaaklijn naar de top van het borstbeen en uit om de armen), 2) scrub chirurgische gebied drie keer met chorhexadine doordrenkte gaas pleinen, 3) definitief scrub gedaan met betadine doordrenkte gaas, 4 ) voorzichtig oogzalf gelden voor de ogen niet uitdroogt.
- Controleer pedaal reflex om ervoor te zorgen muis is voldoende verdoofd.
- Plaats dier in de rug gelegd op een disposable steriele veld barrière onder het ontleden scope en zet het dier op zijn plaats met een doek tape.
- Scrubs handen en voetingernails zet dan op steriele chirurgische handschoenen.
- In een steriele manier, open chirurgie inpakken en regelen instrumenten.
- Plaats steriel laken dan dierlijke, waardoor alleen operatiegebied blootgesteld.
3. Chirurgische toegang tot Schildklier en Cell Injection
- Met behulp van een steriele wegwerpspuit scalpel een 1 op 1,5 cm longitudinale incisie langs de middellijn van de keel.
Opmerking: Afwijking van de middellijn bemoeilijkt dieper snijden om de luchtpijp. Vrij nauwkeurige middellijn incisie kunt u plagen en dwars door de membraneuze weefsel houden links en rechts speekselklieren samen en vermindert kans op knikken of versnijden grote slagaders.
- Maak een tweede incisie in de riem spieren rond de luchtpijp en trek de rechterkant van de ingesneden spier aan de zijkant om de juiste schildklier bloot.
- Hemostats kan op dit moment worden gebruikt om de spierlaag bezit zijn van eendeel voor gemakkelijke toegang tot de schildklier (figuur 1).
Opmerking: Als alternatief, als de procedure uitgevoerd door twee chirurgische personeel, de spierlaag kan eenvoudig worden tegengehouden met een tang, terwijl een kant en klaar injecteerbare injectiespuit wordt overhandigd aan de chirurg door het assisterend personeel.
- Injecteer langzaam 10 pi celsuspensie in de juiste schildklier met een 31G 5/16 "insulinespuit dan naald verwijder voorzichtig.
4. Sluiting van Surgical Site en Muis Recovery
- Hechtdraad spierlaag met 6,0 hechtmateriaal volgens een continu of onderbroken hechten stijl.
- Steek de huid op dezelfde manier.
- Breng een laag drievoudige antibiotische zalf direct over incisieplaats.
- Laat dier te herstellen in dorsale decubitus op warme verwarming pad. Zodra dier sternale decubitus kan bereiken zonder hulp, kan worden terug met andere muizen geplaatst.
- Controleer de incisie en de algehele gezondheid van het dier per dag gedurende een week na de operatie, controleer dan een keer per week. Als de hechtingen nog intact zijn na 14 dagen worden ze verwijderd.
Opmerking: Dieren tekenen van afnemende gezondheid (bv. substantieel gewichtsverlies, smerig haar, moeizame ademhaling) moeten gedood worden en weefsels verzameld.
- Zodra muizen een vooraf bepaalde postoperatieve tijd-punt hebben bereikt, beheren ketamine / xylazine zoals hierboven beschreven te verdoven.
- Perfuseren dier intracardiaal en oogst schildklier / luchtpijp en andere weefsels van belang (niet in detail beschreven).
Representative Results
We gedetecteerd 19 invasieve schildkliertumoren van totaal 20 muizen geïnjecteerd met ATC cellen na 4 weken. In de in figuur 2A weergegeven voorbeeld, muizen die een orthotope injectie van 5x10 5 ATC cellen gekweekt onder voorwaarden verbonden, vertonen aanzienlijke infiltratie van kankercellen in de schildklier van 4 weken na injectie. De aard van de ATC binnenvallende cellen met een karakteristieke spindled cellen en middelgrote tot grote grote cellen met eosinofiel cytoplasma en grote kernen werd geverifieerd door hematoxyline en eosine (H & E) kleuring. Ter vergelijking wordt de schildklier en luchtpijp van een niet-geïnjecteerde controledieren figuur 2B. Follikels van de geïnjecteerde dier vertonen een nauwe, nog los, vereniging en hebben in wezen een ronde morfologie.
Vanwege de kleine omvang van de schildklier en het gebruik van injecteerbare afgifte, onbedoelde gevolgen ontstaan. Figuur 3A illustreert demeest waargenomen, dat ontwikkeling van een tumormassa buiten, maar niet omvat, de schildklier. Dit is meer dan waarschijnlijk te wijten aan naaldpenetratie door en voorbij de schildklier wanneer de cellen worden verdreven. Soms muizen presenteren zonder tumorgroei zowel grove en histologisch worden gedetecteerd zoals getoond in figuur 3B. Geen waarneembare tumorontwikkeling kan worden veroorzaakt door uitzetting van de celsuspensie uit de injectieplaats en verspreiding in naburige weefsels en holtes.
Figuur 1. Blootstellen van de schildklier. Labels geven de rechter en linker schildklieren aan weerszijden van de luchtpijp.
Figuur 2. Histologisch onderzoek van tumorgroei envasion na succesvolle schildklier injectie. Tissue exemplaren werden coupes langs het frontale vlak. A) foto genomen bij de 200X van muizen vertonen aanzienlijke groei van de tumor met karakteristieke spindled cellen en middelgrote tot grote-sized cellen met eosinofiel cytoplasma en grote kernen in hematoxyline en eosine ( H & E) kleuring Tu geeft de primaire laesie waaruit tumorcellen binnenvallen de schildklier B) luchtpijp en de schildklier van controle dieren (die beeld bij 100x) Tu, Tumoren;... S, gladde spieren, Tr, luchtpijp, Thy, schildklier.
Figuur 3. Onbedoelde uitkomsten van orthotopic injectie. Tissue exemplaren werden coupes langs het frontale vlak. A) Perifere tumorgroei met geen groei zichtbaar in de thyroid (zwarte pijl, die beeld bij 100X). B) Gebrek aan tumoropsporing op bruto (niet getoond) of histologisch onderzoek (beeld dat bij 50X). Thy, schildklier.
Discussion
In ons model dieren aangetoond schildklier tumormetastase en ziekten verwant cachexia en respiratoire distress bij 4 weken na injectie. Zoals de meeste orthotope trekken met behulp injecteerbare afgifte van een celsuspensie, injectie in omringende weefsels en lek na de injectie die zich verspreidt over het doel mogelijk. Met dat gezegd zijnde, een herkenbare potentiële onbekend geproduceerd door deze procedure is het effect van de palen blootstelling aan niet-ziekte gerelateerde metastasen of complicaties. Dit is een algemene zorg met meeste xenografisch transplantaties, ongeacht de ziekte die wordt onderzocht. Toch kunnen onbedoelde gevolgen van metastase aanzienlijk worden geminimaliseerd door te zorgen voor de volledige afschuining van de naald is het membraan doorgedrongen stevig overlappen de schildklier en langzaam verdrijven van de celsuspensie. Wanneer lekkage wordt waargenomen tijdens of na de injectie, kunnen deze dieren worden weggelaten uit de studie.
In dit rapport beschrijven we de plaatselijke groei en invasie van geavanceerde schildklier tumor na orthotopic injectie van ATC cellen. ATC metastase kan onderzocht worden door middel van histologische preparaten andere weefsels met behulp van standaard histologische kleuringen, zoals hematoxyline en eosine of met behulp van immunohistochemie cel of pathologie relevante markers. Dit systeem kan verder worden ontwikkeld door genetically modificeren schildklierkanker cellen met fluorescentie reporters zodat levende beeldvorming kan worden gebruikt voor het bewaken metastase en de efficiëntie van therapeutische behandelingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Drs bedanken. Wenjun Li en Daniel Kreisel (Washington University School of Medicine in St. Louis) voor hun hulp in de chirurgie training. RYL wordt ondersteund door de National Institutes of Health Grant R01 DK068057 en Fonds van Saint Louis University Research van de president.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
