Summary
Generering av en orthotopic musmodell av anaplastic thyroidcarcinoma beskrivs här. Denna teknik utnyttjar kirurgisk placering av mänskliga anaplastiska celler sköldkörtelcancer i sköldkörteln hos möss med immunbrist, vilket skapar en mer kliniskt relevant miljö att studera sjukdomsförloppet samt skärm innovativa terapeutiska ingrepp.
Abstract
Flera typer av djurmodeller för mänskliga sköldkörteln karcinom har fastställts, inklusive subkutan xenotransplantatet och orthotopic implantation av cancerceller i möss med immunbrist. Subkutana xenograft modeller har varit värdefullt för preklinisk screening och utvärdering av nya terapeutiska behandlingar. Det finns ett antal fördelar med att använda en subkutan modell, 1) snabba, 2) reproducerbar, och 3) tumör etablering, tillväxt, och svar på terapeutiska medel kan övervakas genom visuell inspektion. Däremot har omfattande bevis belysa bristerna i subkutana xenograft modeller 1-3. Till exempel medicinska behandlingar visar läkande egenskaper i subkutana xenograft modeller har ofta ingen betydande påverkan på den mänskliga sjukdomen. Microenvironmenten av platsen för xenographic transplantation eller injektion ligger i hjärtat av denna olikhet.
Orthotopic tumör xenograft modeller ger en mer biologiskt relevant sammanhang som att studera sjukdomen. Fördelarna med implantera sjuka celler eller vävnad in i deras anatomiska ursprung motsvarande inom ett värddjur innefattar en lämplig plats för tumör-värd interaktioner, utveckling av sjukdomsrelaterade metastaser och förmågan att undersöka platsspecifika inflytande på investigational terapeutiska åtgärder. Därför orthotopic xenograft modeller hysa betydligt mer kliniskt värde eftersom de noggrant återge mänskliga sjukdomar. Av dessa skäl har ett antal grupper utnyttjat en orthotopic sköldkörtelcancer modellen som ett forskningsverktyg 4-7.
Här beskriver vi en metod som upprättar en orthotopic modell för studier av anaplastic sköldkörtelcancer (ATC), vilket är mycket invasiva, motstår behandling, och är nästan dödligt i alla diagnostiserade patienter. Odlade ATC celler bereds som en dissocierad cellulär suspension i en lösning innehållande en matris basalmembranet. En liten volym är långsamt injected in i den högra sköldkörteln. Övergripande utseende och hälsa av mössen övervakas för att säkerställa minimala postoperativa komplikationer och att mäta patologisk penetrance av cancern. Mössen avlivades efter 4 veckor, och vävnad tas för histologisk analys. Djur får tas vid senare tidpunkter för att undersöka mer avancerade progression av sjukdomen. Produktionen av denna orthotopic musmodell etablerar en plattform som åstadkommer två mål: 1) ytterligare vår förståelse av ATC patologi, och 2) skärm nuvarande och framtida terapeutiska medel för att få effekt i kampen mot ATC.
Protocol
Ett. Cellberedning
Fotnoter: 1) komplett RPMI1640 baserad kultur media recept (500 ml) innehåller 435 ml RPMI 1640, 50 ml värmeinaktiverad FBS, 5 ml icke-essentiella aminosyror, 5 ml natriumpyruvat, 5 ml antibiotika-antimykotika, 2) plats matrigel vid 4 ° C en dag före skörden av cellerna.
- Human ATC cellinje THJ-11T 8 odlas i 6 brunnar och skördas en gång 80-90% sammanflytande.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 4 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera media och återsuspendera celler i RPMI 1640 media [2 ml / 6 brunnar].
- Ta en liten volym av cellsuspensionen, lägga till den i en volym av 0,4% trypanblått och bestämma celldensitet med TC10 Automatiserad Cell Counter.
- Beräkna volymen av cellsuspension som behövs för att få 5 x 10 5 celler / mus gånger antalet möss injicera.
Obs: För att säkerställa annons jämställa cell suspension för injektion, förbereda celler som om du injicerar dubbla antalet möss (t.ex. om att injicera 5 möss, sedan förbereda cellsuspension som om du injicera 10 möss).
- Överför behövs volym av cellsuspension i en 15 ml koniska rör.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 4 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera media och återsuspendera celler i fullständigt RPMI 1640 media.
- Överför celler till ett 1,6 ml rör, tillsätt 1 volym matrigel och blanda försiktigt genom att långsamt pipettera in och ut.
Obs: Varje mus kommer att få 10 pl av cellsuspensionen / matrigel cocktail. Sedan 5 x 10 5 celler suspenderade i en 10 pl injicerbara volym har med framgång använts i tidigare ATC orthotopic studier 9-10, använde vi dessa parametrar i denna rapport.
- Placera cellsuspensionen på is tills det ska användas.
- Rengör kirurgiska området, vilket inkluderar dissekera omfattning och omgivningen, genom att torka alla ytor med 70% etanol.
- Slå på värmelampor / kuddar där djuren kommer att återhämta sig från operationen.
- Administrera 0,1 ml ketamin / xylazin (drog cocktail bestående av ketamin 9 mg / ml och xylazin 1mg/ml) per 10 g kroppsvikt intraperitonealt med användning av en 1 ml, 27G ½ "tuberkulinspruta.
- Prep musen för kirurgi: 1) rakning halsregionen av mus (från käklinjen till toppen av bröstbenet och ut till vapen), 2) skrubba kirurgiska området tre gånger med chorhexadine indränkt gasbinda rutor, 3) slutlig scrub gjort med betadin indränkt gasbinda, 4 ) försiktigt på ögonsalva för att förhindra att ögonen blir uttorkade.
- Kontrollera pedal reflex att säkerställa musen tillräckligt sövd.
- Placera djuret i rygg VILA på en disponibel sterilt område barriär under dissekera omfattning och säkra djuret på plats med tyg tejp.
- Scrubs händer och fingernails satte därefter på sterila kirurghandskar.
- I ett sterilt sätt, öppen kirurgi packa och arrangera instrument.
- Placera steril duk över djur, vilket innebär att endast operationsområdet exponeras.
3. Kirurgisk åtkomst till Sköldkörtel och cellinjektion
- Med en steril, engångs skalpell görs en 1-till-1,5 cm longitudinellt snitt längs mittlinjen av halsen.
Obs: Avvikelse från mittlinjen komplicerar djupare skärning för att få tillgång till luftstrupen. Ganska exakt mittlinjesnitt kan du retas och skär genom membranösa vävnaden håller vänster och höger spottkörtlar ihop och minskar risken för hackning eller bryta stora artärer.
- Gör en andra snitt i bandet musklerna kring luftstrupen drar sedan den högra sidan av den snittade muskeln åt sidan för att exponera den högra sköldkörteln.
- Peanger kan användas vid denna punkt för att hålla muskeln lagret endelen för enkel åtkomst till sköldkörteln (Figur 1).
Obs: Om alternativt förfarande som utförs av två kirurgiska personal, kan muskeln lagret helt enkelt hållas tillbaka med pincett medan en klar injektion spruta lämnas till kirurgen av biståndsmyndigheten personalen.
- Långsamt injicera 10 l cellsuspension in rätt sköldkörteln med en 31G 5/16 "insulin spruta sedan försiktigt bort nålen.
4. Avslutande av operationsområdet och mus Recovery
- Sutur muskel skikt med 6,0 suturmaterial använder antingen en kontinuerlig eller avbruten suturering stil.
- Sy huden på samma sätt.
- Applicera ett lager av triple antibiotisk salva direkt över snittet webbplats.
- Låt djuret att återhämta sig i rygg VILA på värmedyna. När djuret kan uppnå sternala VILA utan hjälp, kan den placeras tillbaka med andra möss.
- Kontrollera snittet webbplatsen och allmänna hälsa av djuret dagligen under en vecka efter operationen, så kolla en gång i veckan. Om suturerna är fortfarande intakt efter 14 dagar, tas de bort.
Obs: Djur som uppvisar tecken på sviktande hälsa (t.ex. betydande viktnedgång, Josh hår, ansträngd andning) bör avlivas och vävnader som samlats in.
- När möss har nått en förutbestämd postoperativ tid-punkten, administrera ketamin / xylazin som beskrivs ovan söva.
- BEGJUTA djur intracardially och skörd sköldkörtel / luftstrupe och andra vävnader av intresse (beskrivs inte närmare här).
Representative Results
Vi upptäckt 19 invasiva sköldkörteltumörer från totalt 20 möss som injicerats med ATC-celler efter 4 veckor. I exemplet som visas i figur 2A, möss som fick en orthotopic injektion av 5X10 5 ATC-celler som odlats under villkor, uppvisar betydande infiltration av cancerceller i sköldkörteln med 4 veckor efter injektion. Arten av de invaderande ATC-celler med en spindled karaktäristiska celler och medellång jätte-stora celler med eosinofil cytoplasma och stora kärnor verifierades med hematoxylin och eosin (H & E) färgning. Som jämförelse, är sköldkörteln och luftstrupe från en icke-injicerade kontrolldjur visas i Figur 2B. Folliklar den icke injicerade djuret visar en nära, men ändå löst, förening och har i huvudsak en rund morfologi.
På grund av den lilla storleken av sköldkörteln och användning av injektionsleverans kan oavsiktliga resultat uppstå. Figur 3A illustrerar denvanligast observerade, vilket utvecklingen av en tumör massa utanför, men inte omfattar, sköldkörteln. Detta är mer än sannolikt på grund nålpenetration genom och bortom sköldkörteln när cellerna utvisas. Ibland, möss uppvisar ingen tumörtillväxt både grovt och histologiskt, detekteras som visas i figur 3B. Frånvaro av detekterbara tumörutveckling kan orsakas av utvisning av cellsuspensionen från injektionsstället och spridning till angränsande vävnader och håligheter.
Figur 1. Exponera sköldkörteln. Etiketter anger höger och vänster sköldkörtel flankerar luftstrupen.
Figur 2. Histologisk undersökning av tumörtillväxt och ivasion efter lyckad sköldkörteln injektion. Vävnadsprover snittades längs frontalplanet. A) Bild tagen vid 200X av musen uppvisar betydande tumörtillväxt med karaktäristiska spindled celler och medellång jätte-stora celler med eosinofil cytoplasma och stora kärnor i hematoxylin och eosin ( H & E) färgning Tu anger den primära lesionen från vilken tumörceller invaderar sköldkörteln B) luftstrupe och sköldkörtel från kontroll djur (bild tagen vid 100X) Tu, tumörer;... S, glatt muskulatur, Tr, luftstrupe, Thy, sköldkörteln.
Figur 3. Oavsiktlig utfall av orthotopic injektion. Vävnadsprover snittades längs frontalplanet. A) Perifer tumörtillväxt med ingen tillväxt tydligt i thyroid (svart pil, bild tagen vid 100X). B) Brist på tumördetektion på brutto (ej visad) eller histologisk undersökning (bild tagen vid 50X). Thy, sköldkörteln.
Discussion
I vår modell, visade djuren metastaser sköldkörteln tumör och sjukdom relaterade kakexi och andnöd vid 4 veckor efter injektion. Som med de flesta andra orthotopic modeller utnyttjar injektionsleverans av en cell suspension, injektion i omgivande vävnader och läckage efter injektion som sprider sig utanför målet är möjliga. Med detta sagt, är en igenkännbar potentiell okänt produceras av denna procedur effekten av från målet exponering för icke-sjukdomsrelaterade metastaser eller komplikationer. Detta är ett allmänt problem med de flesta xenographic transplantat, oberoende av sjukdomen som undersöks. Ändå får oavsiktliga konsekvenser från metastaser vara betydligt minimeras genom att säkerställa hela avfasning av nålspetsen har träffat membranet tätt överliggande sköldkörteln och långsamt utvisa den cellulära fjädring. Om läckage konstateras under eller efter injektion, kan sådana djur uteslutas ur studien.
I denna rapport beskriver vi lokal tillväxt och invasion av avancerade sköldkörteln tumör efter orthotopic injektion av ATC-celler. ATC metastas kan undersökas genom att analysera histologiska preparat av andra vävnader med hjälp av vanliga histologiska fläckar, såsom hematoxylin och eosin, eller genom immunohistokemi utnyttjar cellen eller patologi relevanta markörer. Detta system kan vidareutvecklas av genetically modifiera celler sköldkörtelcancer med fluorescens reportrar så att levande avbildning kan användas för att övervaka metastaser och effektiviteten av terapeutiska behandlingar.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Wenjun Li och Daniel Kreisel (Washington University School of Medicine i St Louis) för deras hjälp i kirurgi utbildning. RYL stöds av National Institutes of Health bidrag R01 DK068057 och presidentens Research Fund of Saint Louis University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
