Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En ortotopisk musemodel af Anaplastisk thyreoideakarcinom

doi: 10.3791/50097 Published: April 17, 2013

Summary

Generering af et ortotopisk musemodel af anaplastisk thyreoideakarcinom beskrives her. Denne teknik anvender kirurgisk placering af humane anaplastiske thyreoideacancerceller i skjoldbruskkirtlen hos immunsvækkede mus, hvilket skaber en mere klinisk relevant indstilling for at studere sygdomsprogression samt skærmen innovative terapeutiske indgreb.

Abstract

Flere typer af dyremodeller af humane skjoldbruskkirtlen karcinomer er blevet etableret, herunder subkutan xenotransplantatet og ortotopisk implantation af kræftceller i immunsvækkede mus. Subkutane xenograftmodeller har været værdifulde til præklinisk screening og evaluering af nye terapeutiske behandlinger. Der er en række fordele ved at bruge en subkutan model 1) hurtig, 2) reproducerbar, og 3) tumor etablering, vækst og respons på terapeutiske midler kan overvåges ved visuel inspektion. Imidlertid har betydelige beviser belyse de mangler ved subkutane xenograftmodeller 1-3. For eksempel ofte medicinske behandlinger demonstrerer helbredende egenskaber i subkutane xenograftmodeller har nogen betydelig indvirkning på den menneskelige sygdom. Mikromiljø stedet for xenographic transplantation eller injektion ligger i hjertet af denne forskellighed.

Ortotopisk tumor xenograftmodeller give et mere biologgically relevant sammenhæng at studere sygdommen. Fordelene ved at implantere syge celler eller væv i deres anatomiske oprindelse tilsvarende i et værtsdyr omfatter et passende sted til tumor-vært interaktioner, udvikling af sygdomsrelaterede metastaser og evnen til at undersøge stedspecifik indflydelse på testpræparater terapeutiske midler. Derfor ortotopisk xenograftmodeller havnen langt mere klinisk værdi, fordi de er tæt reproducere sygdom hos mennesker. Af disse årsager har en række grupper benyttet sig af en ortotopisk skjoldbruskkirtelkræft model som et forsknings-værktøj 4-7.

Her beskriver vi en fremgangsmåde, der indfører et ortotopisk model for studiet af anaplastisk thyreoideakarcinom (ATC), som er meget invasiv, modstår behandling, og er nærmest livsfarlig i alle diagnosticerede patienter. Dyrkede ATC celler fremstilles som en dissocieret cellulær suspension i en opløsning indeholdende et basalmembranmatrix. Et lille volumen er langsomt injected ind i højre skjoldbruskkirtlen. Generelle udseende og sundhed musene overvåges for at sikre minimal postoperative komplikationer og for at måle patologisk penetrans af kræft. Mus aflives efter 4 uger, og væv indsamles til histologisk analyse. Dyr kan tages på senere tidspunkter med at undersøge mere forhånd progression af sygdommen. Produktionen af ​​denne ortotopisk musemodel etablerer en platform, der udretter to formål: 1) yderligere vores forståelse af ATC patologi, og 2) skærm nuværende og fremtidige terapeutiske midler til effekt i bekæmpelsen af ​​ATC.

Protocol

1. Cell Preparation

Noter: 1) fuldstændig RPMI 1640 baseret kultur media opskrift (500 ml) indeholder 435 ml RPMI 1640, 50 ml varmeinaktiveret FBS, 5 ml ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml natriumpyruvat, 5 ml antibiotika-antimycotisk, 2) sted matrigel ved 4 ° C en dag før cellehøst.

  1. Menneskelige ATC cellelinie THJ-11T 8 dyrkes i 6 brønde dyrkningsplader og høstes, når 80-90% sammenflydende.
  2. Pellet cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 4 minutter ved stuetemperatur.
  3. Aspirer medier og resuspender celler i RPMI 1640-medier [2 ml / 6 brønds plade].
  4. Tag et lille volumen af ​​cellesuspensionen, tilføje det til et volumen på 0,4% trypanblåt farvestof og bestemme celledensitet hjælp TC10 automatiseret celletæller.
  5. Beregn mængden af cellesuspension bruge for at få 5 x 10 5 celler / mus gange antallet musene intravenøse.

Bemærk: For at sikre ad sidestille celle suspension til injektion, forberede celler, som om du injicerer fordoble antallet af mus (fx hvis injicere 5 mus, så forbered cellesuspensionen som om du var injicere 10 mus).

  1. Overfør nødvendige volumen af ​​cellesuspension i en 15 ml konisk rør.
  2. Pellet cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 4 minutter ved stuetemperatur.
  3. Aspirer medier og resuspender celler i komplet RPMI 1640-medier.
  4. Overføre cellerne til et 1,6 ml rør, tilsættes 1 volumen matrigel og bland forsigtigt ved langsomt pipettering i og ud.

Bemærk: Hver mus modtager 10 pi af cellesuspensionen / Matrigel cocktail. Siden 5 x 10 5 celler suspenderet i en 10 gl injicerbar volumen har været anvendt med succes i tidligere ATC ortotopisk studier 9-10, brugte vi de parametre i denne rapport.

  1. Placer cellesuspension på is, indtil klar til brug.
_title "> 2.. Mus Forberedelse

  1. Rengør kirurgiske område, som omfatter dissektionsmikroskop og omgivelserne, ved aftørring alle overflader med 70% ethanol.
  2. Tænd varmelamper / puder, hvor dyrene vil blive inddrive fra kirurgi.
  3. Dosis er 0,1 ml ketamin / xylazin (lægemiddel cocktail bestående af ketamin 9 mg / ml og xylazin 1mg/ml) pr 10 g legemsvægt intraperitonealt med 1 ml, 27G ½ "Tuberkulinprøve sprøjte.
  4. Prep musen til kirurgi: 1) barbering halsregionen af ​​mus (fra kæben linje til toppen af ​​brystbenet og ud til våben), 2) krat kirurgiske område tre gange med chorhexadine gaze kvadrater, 3) endelig krat gjort med Betadine gaze, 4 ) forsigtigt på øjensalve til at forhindre øjnene mod udtørring.
  5. Check pedal refleks at sikre musen er tilstrækkeligt bedøvet.
  6. Placer dyr liggende på ryggen på et sterilt felt barriere under dissektionsmikroskop og sikre dyret på plads med klud tape.
  7. Scrubs hænder og fingernails derefter sat på sterile kirurgiske handsker.
  8. I en steril måde, pakke åben kirurgi og arrangere instrumenter.
  9. Anbring steril afdækning løbet dyr, så kun operationsstedet eksponeret.

3. Kirurgisk Adgang til skjoldbruskkirtlen og Cell Injection

  1. Ved hjælp af en steril, engangs skalpel en 1-til-1.5 cm indsnit langs midterlinien af ​​halsen.

Note: Afvigelse fra midterlinjen komplicerer dybere skære adgang til luftrøret. Temmelig præcis midtliniesnit tillader dig at drille og skære igennem membranous væv holde venstre og højre spytkirtler sammen og mindsker chancen for at snitte eller afskar store arterier.

  1. Foretag en anden indsnit i remmen musklerne omkring luftrøret derefter trække højre side af indridset musklen til side for at blotlægge den rigtige skjoldbruskkirtlen.
  2. Hemostats kan bruges på dette tidspunkt at holde musklen lag adel for nem adgang til skjoldbruskkirtlen (figur 1).

Bemærk: Alternativt, hvis procedure udføres af to kirurgiske personale, kan den muskel lag simpelthen holdes tilbage med en pincet, mens en klar injicerbar sprøjte afleveres til kirurgen, som den medhjælpende personale.

  1. Langsomt injicere 10 pi cellesuspension ind i den højre skjoldbruskkirtlen ved hjælp af en 31G 5/16 "insulinsprøjte derefter forsigtigt fjerne kanylen.

4. Lukning af operationsstedet og mus Recovery

  1. Sutur muskel lag med 6,0 ​​suturering materiale ved hjælp af enten en kontinuerlig eller afbrudt sutur stil.
  2. Stitch huden på samme måde.
  3. Påfør et lag af triple antibiotisk salve direkte over indsnit site.
  4. Tillad dyret kan komme liggende på ryggen på varme varmepude. Når dyret kan opnå brystleje uden hjælp, kan det placeres tilbage med andre mus.
<p class = "jove_title"> 5. Postoperativ Overvågning og Tissue Collection

  1. Kontroller incisionssted og helbred af dyret dagligt i en uge efter operationen, så tjek en gang om ugen. Hvis suturerne er stadig intakt efter 14 dage, bliver de fjernet.

Bemærk: Animals udviser tegn på faldende sundhed (f.eks betydeligt vægttab, scruffy hår, anstrengt vejrtrækning), bør være aflivet og væv indsamlet.

  1. Når musene har nået et forudbestemt postoperativ tid-point, administrere ketamin / xylazin som beskrevet ovenfor til adstadig.
  2. Perfundere dyr intracardially og høst skjoldbruskkirtlen / luftrør og andre væv af interesse (ikke nærmere beskrevet her).

Representative Results

Vi har registreret 19 invasive skjoldbruskkirtlen tumorer fra i alt 20 mus injiceret med ATC-celler efter 4 uger. I eksemplet vist i figur 2A, mus, der modtager en ortotopisk indsprøjtning af 5X10 5 ATC-celler dyrket under tilknyttede betingelser udviser signifikant infiltration af kræftceller i skjoldbruskkirtlen med 4 uger efter injektion. Arten af ​​de invaderende ATC celler med en karakteristisk spindled celler og mellem-til gigant-store celler med eosinofil cytoplasma og store kerner blev bekræftet ved hematoxylin og eosin (H & E) farvning. Til sammenligning er skjoldbruskkirtlen og luftrør fra en ikke-injicerede kontrol dyr er vist i figur 2B. Hårsække af uinjicerede dyret vise en tæt, men alligevel løs, forening og har hovedsagelig en rund morfologi.

På grund af den lille størrelse af skjoldbruskkirtlen og anvendelse af injicerbar levering, kan utilsigtede resultater opstå. 3A illustrerermest almindeligt observerede, hvilket er en udvikling af en tumormasse udenfor, men ikke omfatter, skjoldbruskkirtlen. Det er mere end sandsynligt på grund af nålen indtrængen gennem og ud over skjoldbruskkirtlen, når celler bliver udvist. Lejlighedsvis, mus frembyder uden tumorvækst, både groft og histologisk påvises som vist i figur 3B. Fravær af påviselig tumor udvikling kan være forårsaget af udvisning af cellesuspensionen fra injektionsstedet og udbredelse i de omkringliggende væv og hulrum.

Figur 1
Figur 1. Udsættes skjoldbruskkirtlen. Etiketter viser højre og venstre skjoldbruskkirtel flankerer luftrøret.

Figur 2
Figur 2. Histologisk undersøgelse af tumorvækst og ivasion efter vellykket skjoldbruskkirtlen injektion. Vævsprøver blev snittet langs koronale plan. A) Billede taget ved 200X af mus udviser betydelig tumorvækst med karakteristiske spindled celler og mellem-til gigant-store celler med eosinofil cytoplasma og store kerner i hematoxylin og eosin ( H & E) plet Tu angiver den primære læsion hvorfra tumorceller invaderer skjoldbruskkirtlen B) Luftrør og skjoldbruskkirtel fra kontrol dyr (billede taget ved 100X) Tu, tumorer,... S, glat muskulatur, Tr, luftrøret; Thy, skjoldbruskkirtlen.

Figur 3
Figur 3. Utilsigtede resultater af ortotopisk injektion. Vævsprøver blev snittet langs koronale plan. A) Perifere tumorvækst med ingen vækst tydeligt i thyroid (sort pil, billede taget ved 100X). B) Manglende tumordetektion på brutto (ikke vist) eller histologisk undersøgelse (billede taget ved 50X). Thy, skjoldbruskkirtlen.

Discussion

I vores model, viste dyr skjoldbruskkirtlen tumormetastase og sygdom relateret kakeksi og åndedrætsbesvær med 4 uger efter injektion. Som med de fleste andre ortotopisk modeller udnytte injicerbar levering af en celle suspension, injektion i omkringliggende væv og efter injektion lækage, der breder sig uden for målet er mulige. Med dette er sagt, en genkendelig potentiel ukendt produceret ved denne procedure er effekten af ​​off target eksponering for ikke-sygdomsrelaterede metastaser eller komplikationer. Dette er en generel bekymring med de fleste xenographic transplantationer, uanset den sygdom, der undersøges. Ikke desto mindre kan utilsigtede konsekvenser fra metastaser minimeres betydeligt ved at sikre hele affasning nålens spids har gennemtrængt membranen stramt overlejre skjoldbruskkirtlen og langsomt udstøde cellesuspension. Hvis der konstateres en lækage under eller efter injektion, kan disse dyr udelades fra undersøgelsen.

I denne rapport beskriver vi lokal vækst og invasion af avancerede thyroidtumor efter ortotopisk injektion af ATC-celler. ATC metastase kan undersøges ved at analysere histologiske præparater af andre væv ved hjælp af standard histologiske pletter, såsom hematoxylin og eosin, eller ved immunohistokemi udnytte celle eller patologi relevante markører. Dette system kan videreudvikles af genetically modificere thyreoideacancerceller med fluorescens journalister, således at levende billeddannelse kan bruges til at overvåge metastaser og effektiviteten af ​​terapeutiske behandlinger.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Drs. Wenjun Li og Daniel Kreisel (Washington University School of Medicine i St. Louis) for deres assistance i kirurgi uddannelse. RYL er støttet af National Institutes of Health Grant R01 DK068057 og formandens Research Fund of Saint Louis University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 cell culture media Mediatech 10-041-CV Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0001
Matrigel Becton, Dickinson and Company 354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" Roboz RS-5135
Disposable scalpel, No. 15 Feather 2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated gSource gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture Surgical Specialties Corporation 1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds Medline MIINON260101 For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer Wahl 8655 For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2% Penn Veterinary Supply VED1222
Betadine Henry Schein Company 6906727
Petrolatum ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply Butler Animal Health Supply 6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26" Busse 696
Drapes (CSR Wrap) Cardinal Health AT 21 412
27G ½" needle Becton, Dickinson and Company 309623
31G 5/16" needle Becton, Dickinson and Company 328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
  2. Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
  3. Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
  4. Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
  5. Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
  6. Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
  7. Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
  8. Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
  9. Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
  10. Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
En ortotopisk musemodel af Anaplastisk thyreoideakarcinom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sewell, W., Reeb, A., Lin, R. Y. An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma. J. Vis. Exp. (74), e50097, doi:10.3791/50097 (2013).More

Sewell, W., Reeb, A., Lin, R. Y. An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma. J. Vis. Exp. (74), e50097, doi:10.3791/50097 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter