Summary
Generierung einer orthotopen Mausmodell der anaplastischen Schilddrüsenkarzinom wird hier beschrieben. Diese Technik beschäftigt chirurgische Platzierung des menschlichen anaplastischen Schilddrüsenkrebs Zellen in der Schilddrüse von immungeschwächten Mäusen, wodurch eine weitere klinisch relevante Einstellung, um den Krankheitsverlauf sowie Bildschirm innovative therapeutische Interventionen zu studieren.
Abstract
Mehrere Arten von Tiermodellen für menschliche Schilddrüse Karzinome wurden eingerichtet, darunter subkutane Xenograft und orthotopen Implantation von Krebszellen in immundefiziente Mäusen. Subkutanen Xenograft-Modellen wurden für die präklinische Screening und Bewertung von neuen therapeutischen Behandlungen wertvoll. Es gibt eine Reihe von Vorteilen mit einer subkutanen Modell, 1) S, 2) reproduzierbar ist, und 3) Tumor-Einrichtung, das Wachstum und die Reaktion auf therapeutische Mittel kann durch Sichtprüfung überwacht werden. Allerdings hat stichhaltige Beweise Licht auf die Defizite des subkutanen Xenograft-Modellen 1-3 vergießen. Zum Beispiel, medizinische Behandlungen demonstriert heilenden Eigenschaften in subkutanen Xenograft-Modellen haben oft keine nennenswerten Auswirkungen auf die menschliche Krankheit. Die Mikroumgebung der Website von xenographic Transplantation oder Injektion liegt im Herzen dieser Verschiedenheit.
Orthotopic Tumorxenotransplantates Modelle bieten eine biologisch relevanten Kontext, in dem die Krankheit zu studieren. Die Vorteile des Implantierens von erkrankten Zellen oder Gewebe in ihrer anatomischen Ursprungs Äquivalent in einem Wirtstier eine geeignete Stelle für die Tumor-Wirt-Wechselwirkungen, die Entwicklung der Krankheit im Zusammenhang mit Metastasen und die Fähigkeit zur ortsspezifischen beeinflussen Der therapeutische Mittel zu untersuchen. Daher hegen orthotopic Xenotransplantatmodellen weitaus klinischen Wert, weil sie reproduzieren eng menschliche Krankheit. Aus diesen Gründen wurde eine Reihe von Gruppen Vorteil einer orthotopen Schilddrüsenkrebs Modell als Recherche-Tool 4-7 gemacht.
Hier beschreiben wir einen Ansatz, der einen orthotopen Modell für die Untersuchung von anaplastischen Schilddrüsenkarzinom (ATC), die sehr invasiv ist etabliert, widersteht Behandlung und ist praktisch in allen tödlich diagnostizierten Patienten. Kultivierte ATC Zellen als dissoziierte Zellsuspension in einer Lösung, die einen Basalmembran-Matrix hergestellt. Ein kleines Volumen langsam injektiert in der rechten Schilddrüse. Insgesamt Aussehen und die Gesundheit der Mäuse überwacht werden, um minimale postoperative Komplikationen zu gewährleisten und pathologischen Penetranz des Krebses zu beurteilen. Die Mäuse werden 4 Wochen getötet und die Gewebe für die histologische Analyse gesammelt. Tiere können zu späteren Zeitpunkten genommen werden, um mehr voraus Fortschreiten der Krankheit zu untersuchen. Die Produktion dieses orthotopen Mausmodell etabliert eine Plattform, die zwei Ziele erreicht: 1) unser Verständnis von ATC Pathologie und 2) Bildschirm aktuelle und zukünftige Therapeutika zur Wirksamkeit bei der Bekämpfung von ATC.
Protocol
Ein. Zellpräparation
Anmerkungen: 1) vollständige RPMI 1640 basierten Kulturmedien Rezept (500 ml) enthält 435 ml RPMI 1640, 50 ml hitzeinaktiviertes FBS, 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 5 ml Natriumpyruvat, 5 ml Antibiotikum-Antimykotikum, 2) Ort Matrigel bei 4 ° C einen Tag vor der Zellernte.
- Menschliche ATC Zelllinie THJ-11T 8 sind in 6-Well-Platten Kultur angebaut und geerntet einmal 80-90% konfluent.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 4 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Medien und Zellen in RPMI 1640-Medium [2 ml / 6-Well-Platte].
- Nehmen Sie ein kleines Volumen der Zellsuspension, fügen Sie es zu einem Volumen von 0,4% Trypanblau und bestimmen Zelldichte mit TC10 Automated Zellzähler.
- Berechnen Sie Volumen der Zellsuspension benötigt bis 5 x 10 5 Zellen / Maus mal die Anzahl Mäuse injiziert bekommen.
Hinweis: Um sicherzustellen, ad gleichzusetzen Zellsuspension zur Injektion vorzubereiten Zellen, als ob Sie injizieren die doppelte Anzahl von Mäusen (zB wenn Einspritzen 5 Mäuse, dann bereiten Zellsuspension, als ob Sie Injektion wurden 10 Mäuse) werden.
- Übertragen benötigt Volumen der Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 4 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Medien und Zellen in kompletten RPMI 1640 Medien.
- Übertragen Zellen zu einer 1,6-ml-Röhrchen, fügen Sie 1 Volumen von Matrigel und vorsichtig mischen durch Pipettieren langsam ein und aus.
Hinweis: Jede Maus wird 10 ul der Zellsuspension / Matrigel Cocktail empfangen. Seit 5 x 10 5 Zellen in einer 10 ul injizierbaren Volumen suspendiert wurden erfolgreich in früheren Studien ATC orthotopic 9-10 verwendet, nutzten wir die Parameter in diesem Bericht.
- Zeigen Zellsuspension auf Eis bis zum Gebrauch.
- Reinigen Sie den chirurgischen Bereich, der die Binokular und Umgebung, durch Wischen Sie alle Oberflächen mit 70% Ethanol enthält.
- Schalten Sie Wärmelampen / pads, in denen Tiere von der Operation erholt werden.
- Verwalten 0,1 ml Ketamin / Xylazin (Drogen-Cocktail, bestehend aus Ketamin 9 mg / ml und Xylazin 1mg/ml) pro 10 g Körpergewicht intraperitoneal mit einer 1 ml, 27G ½ "Tuberkulinspritze.
- Prep Maus für Chirurgie: 1) rasieren Halsbereich Maus (aus Kiefer-Linie nach oben und aus Brustbein zu den Waffen), 2) schrubben OP-Bereich dreimal mit chorhexadine getränkten Gaze Plätze, 3) endgültige Peeling mit betadine getränkte Gaze, 4 getan ) sanft gelten Augensalbe die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Prüfen Pedal Reflex, um sicherzustellen, Maus ausreichend sediert.
- Zeigen Tier in Rückenlage auf einer sterilen Feldbarriere unter dem Binokular und sichern das Tier an Ort und Stelle mit Gewebeband.
- Scrubs Hände und fingernails lege dann sterile OP-Handschuhe.
- In einer sterilen Mode, packen die offene Chirurgie und vereinbaren Instrumente.
- Zeigen sterilen Tuch über Tier, so dass nur OP-Gebiet ausgesetzt.
3. Chirurgische Zugang zu Schilddrüsen-und Zell-Injection
- Mit einer sterilen Einweg-Skalpell, eine 1-zu-1.5 cm Längsschnitt entlang der Mittellinie des Halses.
Hinweis: Die Abweichung von der Mittellinie erschwert tiefer schneiden, um die Luftröhre gelangen. Ziemlich präzise Mittellinienschnitt können Sie necken und durch den häutigen Gewebe hält links und rechts Speicheldrüsen zusammen geschnitten und reduziert das Risiko von Nicking oder Durchtrennung großen Arterien.
- Einen zweiten Einschnitt in die Halsmuskulatur rund um die Luftröhre und ziehen Sie dann die rechte Seite der eingeritzten Muskel zur Seite, um das Recht Schilddrüse freizulegen.
- Hemostats kann an dieser Stelle eingesetzt werden, um die Muskelschicht halten aTeil für den einfachen Zugriff auf die Schilddrüse (Abbildung 1).
Hinweis: Alternativ, wenn Verfahren von zwei OP-Personal durchgeführt wird, der Muskel Schicht kann einfach wieder mit einer Pinzette gehalten werden, während eine gebrauchsfertige injizierbare Spritze wird der Chirurg durch die Unterstützung der Mitarbeiter übergeben.
- Langsam injizieren 10 ul Zellsuspension in die rechte Schilddrüse mit einer 31G 5/16 "Insulinspritze dann vorsichtig entfernen Nadel.
4. Closure of Surgical Site-und Recovery-Maus
- Naht Muskelschicht mit 6,0 Nahtmaterial entweder mit einem durchgehenden oder unterbrochenen Naht Stil.
- Stich die Haut in der gleichen Weise.
- Tragen Sie eine Schicht von Triple antibiotische Salbe direkt über Inzisionsstelle.
- Erlauben Tier in Rückenlage auf warmen Heizkissen erholen. Sobald Tier kann Brustlage ohne Hilfe zu erreichen, kann es wieder mit anderen Mäusen platziert werden.
- Überprüfen Sie die Inzisionsstelle und die allgemeine Gesundheit des Tieres täglich für eine Woche nach der Operation, dann einmal pro Woche zu überprüfen. Wenn die Fäden noch nach 14 Tagen erhalten, werden sie entfernt.
Hinweis: Tiere Anzeichen von schlechter Gesundheit (z. B. erheblichen Gewichtsverlust, struppiges Haar, Atemnot) sollte eingeschläfert werden und Gewebe gesammelt.
- Sobald Mäusen haben eine vorgegebene postoperativen Zeit-Punkt erreicht, verwalten Ketamin / Xylazin wie oben beschrieben zu beruhigen.
- Perfundieren Tier intrakardial und Ernte Schilddrüse / Luftröhre und anderen Geweben von Interesse (hier nicht im Detail beschrieben).
Representative Results
Wir haben festgestellt, 19 invasive Schilddrüsenhormonen aus insgesamt 20 Mäusen mit ATC Zellen nach 4 Wochen injiziert. In dem in 2A gezeigten, Mäuse, die eine Injektion von orthotopic 5X10 5 ATC Zellen unter Bedingungen gezüchtet beigefügten weisen erhebliche Infiltration von Krebszellen in der Schilddrüse mit 4 Wochen nach der Injektion. Die Art der eindringenden Zellen ATC mit einer charakteristischen gespindelt Zellen und mittel-bis übergroßes Zellen mit eosinophilen Zytoplasma und großen Kernen wurde von Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung überprüft. Zum Vergleich wird die Schilddrüse und die Luftröhre aus einem nicht-injizierten Kontrolltieren in 2B gezeigt. Follikel des injizierten Tier zeigen eine enge, aber locker, Vereinigungsfreiheit und haben im Wesentlichen eine runde Morphologie.
Aufgrund der geringen Größe der Schilddrüse und Verwendung von injizierbaren Abgabe, ungewollte Ergebnisse entstehen. 3A zeigt dieam häufigsten beobachteten, ist die Entwicklung einer Tumormasse von außerhalb, aber nicht umfasst, die Schilddrüse. Dies ist mehr als wahrscheinlich, aufgrund Nadelpenetration durch und über die Schilddrüse, wenn Zellen ausgestoßen werden. Gelegentlich präsentiert Mäuse ohne Tumorwachstum, sowohl grob und histologisch nachgewiesen werden, wie in 3B gezeigt. Abwesenheit von nachweisbaren Tumor Entwicklung kann durch Vertreibung der Zellsuspension aus der Injektionsstelle und Verbreitung in benachbarte Gewebe und Hohlräume verursacht werden.
Abbildung 1. Offenlegen der Schilddrüse. Labels bezeichnen die rechte und linke Schilddrüse flankieren die Luftröhre.
Abbildung 2. Die histologische Untersuchung des Tumorwachstums undvasion nach erfolgreicher Schilddrüse Injektion. Gewebeproben wurden geschnitten entlang der koronalen Ebene. A) Bild bei 200X von Maus ausstellenden erhebliche Tumorwachstum mit charakteristischen gespindelt Zellen und mittel-bis übergroßes Zellen mit eosinophilen Zytoplasma und großen Kernen in Hämatoxylin und Eosin (entnommen H & E)-Färbung Tu zeigt die primäre Läsion aus denen Tumorzellen dringen in die Schilddrüse B) Luftröhre und Schilddrüse von Kontrolltieren (Bild im 100X genommen) Tu, Tumoren;... S, glatte Muskelzellen, Tr, Luftröhre, Thy, Schilddrüse.
Abbildung 3. Unbeabsichtigte Ergebnisse der orthotopen Injektion. Gewebeproben wurden geschnitten entlang der koronalen Ebene. A) Peripheral Tumorwachstum ohne Wachstum deutlich in der thyroid (schwarzer Pfeil, Bild bei 100X genommen). B) Fehlende Tumordetektion auf brutto (nicht gezeigt) oder histologische Untersuchung (Bild bei 50X gemacht). Thy, Schilddrüse.
Discussion
In unserem Modell demonstriert Tiere Schilddrüse Metastasierung und Krankheiten im Zusammenhang Kachexie und Atemnot um 4 Wochen nach der Injektion. Wie bei den meisten anderen orthotopic Modelle verwendet injizierbaren Abgabe von einer Zellsuspension, die Injektion in das umgebende Gewebe und Nacheinspritzung Leckage über das Ziel verteilt sind möglich. Mit diesem wird gesagt, ist ein erkennbarer unbekannt nach diesem Verfahren produziert die Wirkung vorbei Exposition gegenüber nicht-verwandten Krankheit Metastasen oder Komplikationen. Dies ist ein allgemeines Problem bei den meisten xenographic Transplantationen, unabhängig von der Erkrankung untersucht. Dennoch kann es zu unbeabsichtigten Folgen von Metastasen deutlich, indem sie die gesamte Facette der Nadelspitze hat drang in die Membran fest, die über der Schilddrüse und langsam Vertreibung der Zellsuspension minimiert werden. Wenn das Leck während oder nach der Injektion beobachtet wird, kann diese Tiere aus der Studie verzichtet werden.
In diesem Bericht beschreiben wir lokale Wachstum und Invasion von fortgeschrittenen Tumoren der Schilddrüse nach orthotopen Injektion von ATC-Zellen. ATC Metastasierung kann durch die Analyse von histologischen Präparaten von anderen Geweben unter Verwendung von Standard histologischen Färbungen, wie Hämatoxylin und Eosin oder durch Immunhistochemie Verwendung Zelle oder Pathologie relevante Marker untersucht werden. Dieses System kann weiter ausgebaut werden, indem genetically Modifizieren Schilddrüsenkrebs Zellen mit Fluoreszenz-Reporter, so dass Live-Aufnahmen verwendet werden, um Metastasen und die Wirksamkeit von therapeutischen Behandlungen zu überwachen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Wenjun Li und Daniel Kreisel (Washington University School of Medicine in St. Louis) für ihre Unterstützung in der Chirurgie Ausbildung. RYL wird durch die National Institutes of Health Grants R01 DK068057 und der Präsident der Forschungsfonds von Saint Louis University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
