Summary
퇴행성 갑상선 암의 동소 마우스 모델의 생성은 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 따라서 질병의 진행뿐만 아니라 화면 혁신적인 치료 개입을 연구하는 많은 임상 관련 설정을 생성, 면역 결핍 쥐의 갑상선에 인간의 퇴행성 갑상선 암 세포의 수술 위치를 사용합니다.
Abstract
인간의 갑상선 암 동물 모델의 여러 종류의 피하 이종 이식과 면역 결핍 생쥐에 암세포의 동소 이식 등 설립되었다. 피하 이종 이식 모델은 임상 검사 및 새로운 치료 치료의 평가에 가치가 있었다. 피하 모델을 사용하면 많은 장점이 있습니다, 1) 신속, 2) 재현성, 3) 종양의 설립, 성장, 요원 및 방사선 치료에 대한 응답은 육안 검사로 모니터링 할 수 있습니다. 그러나 실질적인 증거가 1-3 피하 이종 이식 모델의 짧은 오심에 빛을 발산하고있다. 예를 들어, 피하 이종 이식 모델에서 치료 속성을 보여 의약 치료는 종종 인간의 질병에 주목할만한 영향을주지 않습니다. xenographic 이식하거나 주사 부위의 미세이 차이점의 중심에 자리 잡고 있습니다.
동소 종양 이종 이식 모델은 더 biolo을 제공합니다질병을 연구하기에 gically 관련 상황. 호스트 동물 내에서 해부학 원 상당에 병에 걸린 세포 나 조직을 이식의 장점은 적절한 종양 호스트 상호 작용 사이트, 질병 관련 전이의 개발과 임상 치료 요법에 대한 사이트 별 영향을 조사하는 기능이 포함되어 있습니다. 그들은 밀접하게 인간의 질병을 재현하기 때문에 따라서, 동소 이종 이식 모델은 훨씬 더 임상 적 가치를 항구. 이러한 이유로, 그룹의 수는 연구 도구 4-7로 동소 갑상선 암 모델의 장점을 가지고있다.
여기, 우리는 매우 침략 퇴행성 갑상선 암 (ATC)의 연구 동소 모델을 수립 치료를 저항하고, 모든 진단 환자의 거의 치명적인 방법을 설명합니다. 배양 ATC 세포 기저막 행렬을 포함하는 용액에 해리 세포 현탁액으로 준비가되어 있습니다. 작은 볼륨이 천천히 주사입니다오른쪽 갑상선에 ected. 마우스의 전체적인 모양과 건강은 최소한의 수술 후 합병증을 보장하고 암의 병리학 투과도를 측정하기 위해 모니터링됩니다. 생쥐을 4 주에 희생되고, 조직은 조직 학적 분석을 위해 수집됩니다. 동물 질병의 더 많은 사전의 진행을 검토하기 위해 나중에 시간이 지점에서 수행 할 수 있습니다. 우리 ATC 병리의 이해와 효능 2) 화면의 현재와 미래의 치료제 ATC 퇴치에 추가 1)이 동소 마우스 모델의 생산은 두 가지 목적을 수행하는 플랫폼을 설정합니다.
Protocol
1. 세포의 준비
주 : 2) 장소 리겔 1) 전체 RPMI 1640 기반 문화 미디어 레시피 (500 ML) 435 ML RPMI 1640, 50 ML 열 비활성화 된 FBS 5 ML 비 필수 아미노산, 5 ML 나트륨 피루 베이트, 5 ML 항생제 항진균를 포함 4 ° C에서 세포 수확 하루 전에.
- 인간 ATC 세포주 THJ-11T 8 6 잘 배양 접시에서 자란 80 ~ 90 %의 합류 후 수확하고 있습니다.
- 실온에서 4 분 200 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포.
- RPMI 1640 미디어 [2 ㎖ / 6 잘 플레이트]에서 미디어를 Resuspend 세포를 대기음.
- 0.4 % 판 블루 염색 하나의 볼륨에 추가하고 TC10 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 밀도를 결정, 세포 현탁액의 작은 양을 가지고.
- 주입 5 × 10 5 세포 / 마우스 횟수에 마우스를 얻기 위해 필요한 세포 현탁액의 볼륨을 계산합니다.
참고 : 광고를 보장하기 위해 당신이 마우스의 더블 번호 (예 : 5 마우스를 주입하는 경우 10 쥐를 주입하는 것처럼, 그 세포 현탁액을 준비) 주입하는 것처럼 주입 세포 현탁액을 동일시 세포를 준비합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액의 필요한 양을 전송합니다.
- 실온에서 4 분 200 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포.
- 전체 RPMI 1640 미디어 매체를 Resuspend 세포를 대기음.
- 1.6 ML 튜브에 세포를 전송, 마트 리젤의 1 볼륨을 추가하고 천천히에 피펫 스에 의해 부드럽게 섞는다.
참고 : 각 마우스 세포 현탁액 / 마트 리젤 칵테일의 10 μl를 받게됩니다. 10 μL 주사 양에 떠있는 5 × 10 5 세포가 성공적으로 이전 ATC 동소 연구 9-10에서 사용하고 있기 때문에, 우리는이 보고서에서 이러한 매개 변수를 사용했습니다.
- 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 놓습니다.
- 70 % 에탄올로 모든 표면을 닦아 해부 범위와 주변 지역을 포함하는 외과 영역을 청소합니다.
- 동물이 수술에서 회복 될 가열 램프 / 패드의 전원을 켭니다.
- 1 ML, 27G ½ "투베르쿨린 주사기를 사용하여 10g의 체중 복강 당 0.1 ML 케타민을 / xylazine (케타민 9 MG / ML 및 xylazine 1mg/ml의 구성된 약물 칵테일)를 관리합니다.
- 수술 준비 마우스 : 1) 베타 딘 적신 거즈, 4를 수행 최종 스크럽) chorhexadine 젖은 거즈 사각형, 3으로 수술 영역을 세 번 문질러 마우스의 목 영역 (턱 선에서 흉골과 팔을 밖으로의 상단까지), 2) 면도 ) 부드럽게 건조 눈을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 마우스가 적절하게 침착되어 있는지 확인하기 위해 반사 페달을 확인합니다.
- 해부 범위에 처분 할 수있는 메마른 필드 장벽 지느러미 드러 누움에 동물을 배치하고 피복 테이프와 장소에서 동물을 고정합니다.
- 스크럽 손과 Fingernails는 불임 수술 장갑에 넣어.
- 멸균 방식으로, 개복 수술을 포장하고 악기를 정렬합니다.
- 단지 수술 부위가 노출 떠나, 동물에 무균 드레이프를 놓습니다.
3. 갑상선 세포 주입 수술 액세스
- 멸균 일회용 메스를 사용하여 목의 정중선을 따라 1에 1.5 cm 세로 절개를합니다.
참고 : 정중선에서 편차가 기관에 액세스 할 깊은 절단 복잡. 매우 정확한 중간 선 절개는 당신이 함께 왼쪽과 오른쪽 침샘을 들고 막 조직을 애타게 절단 할 수 있으며 큰 동맥을 새김 눈 또는 단절의 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 기관을 둘러싼 스트랩 근육에 두 번째 절개를 다음 오른쪽 갑상선을 노출 옆에 절개 근육의 오른쪽을 당깁니다.
- Hemostats는 근육 층을 보유하는이 시점에서 사용할 수 있습니다갑상선에 쉽게 접근 할 수있다 (그림 1)에 대한 부분입니다.
참고 : 절차는 두 가지 수술 직원에 의해 수행하는 경우 준비 주사 주사기 지원 직원 외과 의사 전달되는 동안 또는, 근육 층이 단순히 집게로 다시 개최 할 수있다.
- 천천히 조심스럽게 바늘을 제거 31G 5 / 16 "인슐린 주사기를 사용하여 오른쪽 갑상선에 세포 현탁액의 10 μl를 주입.
4. 외과 사이트 및 마우스 복구 폐쇄
- 하나를 연속 또는 단속 봉합 스타일을 사용하여 6.0 봉합 재료와 봉합 근육 층.
- 같은 방식으로 스티치 피부.
- 직접 절개 사이트를 통해 트리플 항생제 연고의 레이어를 적용합니다.
- 따뜻한 가열 패드에 지느러미 드러 누움에 복구하는 동물을 허용합니다. 동물의 도움없이 흉골 드러 누움를 얻을 수 있습니다되면, 다른 마우스와 함께 다시 배치 할 수 있습니다.
- 수술 후 일주일 동안 매일 절개 사이트와 동물의 전반적인 건강을 확인 후, 일주일에 한 번 확인합니다. 봉합이 14 일 후에 그대로 있다면, 그들은 제거됩니다.
참고 : 감소 상태 (예를 들어, 상당한 체중 감소, 초라한 머리, 숨소리)의 흔적을 전시 동물은 안락사해야하며, 조직을 수집.
- 일단 마우스는 xylazine / 케타민 진정으로 위의 설명과 같이 관리, 소정의 수술 시간이 지점에 도달했습니다.
- intracardially 동물을 붓는다 수확 갑상선 / 기관과 관심의 다른 조직 (여기에서는 자세히 설명하지 않음).
Representative Results
우리는 4 주 후에 ATC 세포로 주입 20 생쥐의 총 19 침습 갑상선 종양을 발견했습니다. 그림 2A에 표시된 예에서, 첨부 된 조건 하에서 재배 5X10 5 ATC 세포의 동소 주입받은 쥐는 4 주 후 주입하여 갑상선에 암 세포의 중요한 침투를 나타냅니다. 산성 세포질과 큰 핵을 가진 특성 spindled 세포와 중간에 거대한 크기의 세포 침입 ATC 세포의 본질은 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색에 의해 확인되었다. 비교를 위해, 비 주입 제어 동물에서 갑상선과 기관이 그림 2B에 표시됩니다. uninjected 동물의 모낭은 가까운, 그러나 느슨한 연결을 표시하고 기본적으로 둥근 형태가있다.
주사 배달 갑상선과 사용의 작은 크기로 인해, 의도하지 않은 결과가 발생할 수 있습니다. 그림 3A는 보여줍니다가장 일반적으로 관찰, 이는 외부의 종양 질량의 개발이다, 그러나 갑상선을 포괄하지. 세포가 추방되는 때까지 및 갑상선 이외의 바늘 침투 가능성보다 더 때문입니다. 그림 3b에서와 같이 가끔, 아니 종양의 성장을 제시 생쥐는 모두 조잡한 및 조직 학적으로 감지됩니다. 감지 종양 개발의 부재는 주변 조직과 공동으로 주사 부위 및 보급의 세포 현탁액의 추방으로 인해 발생할 수 있습니다.
그림 1. 갑상선을 노출. 레이블은기도를 측면에서는 왼쪽과 오른쪽 갑상선을 나타냅니다.
그림 2. 종양의 성장과 조직 학적 검사성공적으로 갑상선 주사 후 vasion. 조직 표본은 관상면을 따라 단면이었다. 산성 세포질 헤 마톡 실린과 에오신 큰 핵 (와 특성 spindled 세포와 중간에 거대한 크기의 세포와 상당한 종양의 성장을 전시 마우스 200X에서 찍은) 이미지 H & E)는 얼룩 화는 종양 세포가 갑상선을 침범되는 기본 병변을 나타냅니다 B) 기관지 및 제어 동물에서 갑상선 (100X에서 찍은 이미지) 화, 종양,... S, 평활근, 그럴 필요,기도, 아버지의, 갑상선.
그림 3. 동소 주입 의도하지 않은 결과. 조직 표본은 관상면을 따라 단면이었다.) 주변 종양의 성장 thyroi에 분명없는 성장D (검은 화살표, 100X에서 찍은 이미지). B) 총시 종양 검출의 부족 (표시되지 않음) 또는 조직 학적 검사 (50X에서 찍은 이미지). 아버지의, 갑상선.
Discussion
우리의 모델에서, 동물 4 주 후 주입 도덕의 타락과 호흡 곤란 관련 갑상선 종양의 전이 및 질병을 보여 주었다. 대부분의 다른 동소 모델은 대상을 넘어 퍼져 주위 조직 및 사후 분사 누설에 세포 현탁액 주사 배송, 주사를 이용한 경우와 마찬가지로이 가능합니다. 그 말했다되는,이 절차에 의해 생성 한 인식 할 가능성이 알려지지 않은이 아닌 질병 관련 전이 또는 합병증 파워 노출의 효과입니다. 이 관계없이 질병이 조사되는 대부분의 xenographic 이식과 일반적인 관심사입니다. 그럼에도 불구하고, 전이의 의도하지 않은 결과는 상당히 아늑 갑상선를 오버레이 막 침투 바늘 끝의 전체 베벨을 보장하고 천천히 세포 현탁액을 추방함으로써 최소화 할 수있다. 누설이 주입 도중 또는 이후 관찰되는 경우, 해당 동물 연구에서 생략 할 수있다.
이 보고서에서 우리는 ATC 세포의 동소 주입 다음과 같은 고급 갑상선 종양 지역의 성장과 침략을 설명합니다. ATC 전이는 같은 헤 마톡 실린과 에오신 표준 조직 학적 얼룩을 사용하여 다른 조직의 조직 학적 제제를 분석하여, 또는 면역 세포 또는 병리 관련 마커를 이용하여 조사 할 수 있습니다. 이 시스템은 또한 G에 의해 개발 될 수있다라이브 영상이 전이 치료 치료의 효과를 모니터링하는 데 사용할 수 있도록 enetically 형광 기자와 갑상선 암 세포를 수정.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 박사 부부에게 감사의 말씀을 전합니다. 수술 교육에서의 도움 Wenjun 리와 다니엘 Kreisel (세인트 루이스의 워싱턴 대학 의과 대학). RYL은 건강 보조금 R01 DK068057 국립 연구소와 세인트 루이스 대학의 대통령의 연구 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
